Введение к работе
Актуальность темы. В мире от глаукомы страдает более 90 млн. человек (Goldberg I., 2000), а к 2030 году ожидается увеличение числа таких больных в 2 раза (Rochtchina E. et al., 2000). По данным А.В. Хватовой (2005), в настоящее время больных с врожденной глаукомой насчитывается около 300 000, из них 75% слепые. Доля глаукомы среди причин первичной инвалидности за последнее десятилетие выросла с 12 до 20% (Либман Е.С. с соавт., 2000), а в Санкт-Петербурге – до 30% и занимает первое место как причина инвалидности по зрению (Разумовский М.И. с соавт., 2004).
Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) – одна из главных причин слабовидения и слепоты среди лиц трудоспособного возраста в развитых странах (Quigley H.A. et Broman A.T., 2006; Нестеров А.П., 2008), и, несмотря на достигнутые успехи в её лечении, более половины больных продолжают терять зрительные функции. Первичная врожденная глаукома – очень редкая патология в нашей стране (встречаемость составляет 1 случай на 10 000 новорожденных) (Алексеев И.Б., 2008) и выступает как причина слепоты в 2,5 – 7% случаев (Сомов Е.Е., 2005).
Особенность ПВГ, ПЮГ и ПОУГ заключается в их бессимптомном течении на начальных этапах. Вместе с тем, подавляющее большинство применяемых диагностических тестов рассчитано на выявление уже имеющихся у пациента изменений, связанных с глаукомой, когда часть времени на лечение упущена. Кроме того, особенностью ПВГ и ПЮГ является то, что в большинстве случаев при работе с детьми возникают трудности в сборе жалоб, анамнеза, а также не всегда возможно применение общепринятых и высокотехнологичных методик обследования.
В связи с этим особое значение приобретают диагностические тесты, с помощью которых можно выявить глаукому на самой ранней стадии или установить склонность к ее развитию еще в преморбидном периоде. Из известных на сегодняшний день методик далеко не все отвечают таким требованиям, как достаточная информативность, простота и, следовательно, поиски в этом направлении необходимо продолжать.
Благодаря достижениям молекулярной генетики последних десятилетий стал возможен прогресс в доклинической диагностике и понимании точных механизмов развития сотен моногенных заболеваний. Определенные успехи достигнуты и в изучении патогенеза мультифакториальных заболеваний (Горбунова В.Н., Баранов В.С., 1997; Баранов В.С. с соавт., 2000), в этиологию которых наряду с факторами внешней среды значительный вклад вносят генетические составляющие.
ПВГ, обусловленная мутациями в гене CYP1B1 (2p21), чаще всего наследуется по аутосомно-рецессивному типу с вариабельной пенетрантностью (Bejjani B.A. et al., 2000). Мутации в гене CYP1B1 ответственны за развитие 10-15% спорадических и 20-100% семейных случаев ПВГ (Plasilova М. et al., 1999; Mashima Y. et al., 2001; Stoilov I. et Sarfarazi M., 2002; Curry S.M. et al., 2004).
ПЮГ обусловлена мутациями в генах MYOC (1q24.3-q25.2) и CYP1B1 (2p21). Мутации в гене MYOC чаще всего наследуются по аутосомно-доминантному типу со степенью пенетрантности 80-96% и ответственны за 5-20% спорадических и 20-36% семейных случаев данного заболевания (Booth A. et al., 1997; Fingert J.H. et al., 1999; Shimizu S. et al., 2000; Faucher M. et al., 2002; Wiggs J.L. et al., 2007; Lin Y. et al., 2008; Mengkegale M.G. et al., 2008). В ряде случаев ПЮГ является мультигенным заболеванием, зависящим от сочетания генотипов генов MYOC и CYP1B1 (Vincent A.L. et al., 2002; Bayat B. et al., 2008).
ПОУГ обусловлена мутациями в гене MYOC (1q24.3-q25.2) и наследуется по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью. Мутации в этом гене ответственны за развитие от 2% до 5% случаев данного заболевания (Fingert J.H. et al., 1999; Kumar A. et al., 2007; Wiggs J.L. et al., 2007; Sud A. et al., 2008), а их носители имеют риск развития ПОУГ в течение жизни, варьирующий от 60 до 100%. Мутации в гене WDR36 (5q22.1) ответственны за развитие 5-17% случаев ПОУГ (Monemi S. et al., 2005; Suriyapperuma S.P. et al., 2007; Lin Y. et al., 2008).
Мутации в гене MYOC имеют две основные патогенетические точки приложения в глазу – в области трабекулярной сети и в области решетчатой пластинки. Повышенная экспрессия миоцилина в клетках трабекулярной сети приводит к уменьшению числа актиновых волокон в них и к нарушению функционирования актомиозинового сократительного комплекса, кроме того, он блокирует функции ряда белков, которые принимают участие в оттоке водянистой влаги (ВВ). Все это ведет к нарушению оттока ВВ в области трабекулы. Кроме того, ген миоцилина экспрессируется в ганглиозных клетках сетчатки и астроцитах в области решетчатой пластинки. Мутации в гене MYOC приводят к неправильному укладыванию белка миоцилина и его внутриклеточному накоплению в эндоплазматической сети и в аппарате Гольджи, что в конечном итоге приводит к запуску процесса апоптоза и, как следствие, к снижению механической устойчивости решетчатой пластинки.
Цитохром P450 1B1 (белок, кодируемый геном CYP1B1) относится к ферментам, которые ответственны за первую фазу метаболизма разнообразных ксенобиотиков (компонентов пищи, лекарственных препаратов, ядов), а также и эндогенных субстратов (таких как стероиды, жирные кислоты, простагландины). Существует гипотеза, что данный белок может вовлекаться в элиминацию метаболитов, которые оказывают токсическое воздействие на развитие структур глаза, а также может участвовать в выработке регуляторной молекулы, которая контролирует экспрессию генов, влияющих на развитие радужно-роговичного угла (РРУ) глаза, что возможно приводит к развитию ПВГ.
Ген WDR36 кодирует белок активации Т-клеток, имеющий, по меньшей мере, 8 WD40-повторов. Известно, что данный ген вовлечен в активацию Т-клеток и регулируется в значительной степени координированно с IL-2. Однако его функции и роль в патогенезе глаукомы в настоящее время неизвестны. Данные, полученные при исследовании мутаций в данном гене (а точнее его изменений нуклеотидной последовательности N355S, A449T, R529Q и D658G) в разных популяциях мира, очень противоречивы и говорят как в пользу вовлеченности гена WDR36 в патогенез глаукомы, так и против этого.
Спектр описанных мутаций в этих генах является этнически и популяционно специфичным (Gong G. et al., 2004; Ishikawa K. et al., 2004), что делает невозможным в России в целях диагностики опираться на данные, полученные в других странах. В нашей стране исследования мутаций генов MYOC, CYP1B1 и WDR36 у пациентов с разными формами глаукомы не проводились. В связи с этим данное исследование, направленное на определение спектра мутаций в перечисленных генах у больных Санкт-Петербурга, представляется актуальным.
Цель работы: Определить спектр и частоту встречаемости мутаций в генах миоцилина, цитохрома Р450 1B1 и WDR36 и их диагностическое значение у пациентов с различными формами первичной глаукомы в Санкт-Петербурге.
В соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие задачи:
-
Определить спектр и частоту встречаемости мутаций в генах миоцилина, цитохрома Р450 1В1 и WDR36 у больных ПВГ, ПЮГ и ПОУГ.
-
Определить связь полиморфизма L432V в гене цитохрома Р450 1В1 с развитием различных форм первичной глаукомы.
-
Оценить диагностическую значимость обнаруженных полиморфизмов в генах миоцилина и цитохрома Р450 1В1.
-
Разработать методы быстрого тестирования обнаруженных мутаций.
-
Определить частоту встречаемости и вклад в развитие различных форм первичной глаукомы изменений нуклеотидной последовательности (N355S, A449T, R529Q и D658G) в гене WDR36.
Научная новизна работы. Впервые в России на клиническом материале изучен спектр мутаций в генах MYOC, CYP1B1 у пациентов с первичной врожденной и первичной ювенильной глаукомами. Определен вклад обнаруженных мутаций и полиморфизмов в заболеваемость ПВГ и ПЮГ в Санкт-Петербурге. Показано отсутствие связи между широко распространенными изменениями нуклеотидной последовательности гена WDR36 и возникновением ПВГ, ПЮГ и ПОУГ.
Практическая значимость работы. Внедрена в клиническую практику методика генетического тестирования родственников пробандов больных первичной ювенильной глаукомой, позволяющая выделить группу риска развития данного заболевания, диспансерное наблюдение за которой является непременным условием профилактики слепоты, обусловленной глаукомой. Полученные данные позволяют проводить генетическое консультирование носителей мутаций в гене миоцилина.
Разработан метод быстрой детекции мутации G367R в гене миоцилина, полиморфизма N453S в гене цитохрома Р450 1В1 с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции и мутации P369ins в гене цитохрома Р450 1В1 с помощью гетеродуплексного анализа.
Основные положения диссертации, которые выносятся на защиту.
-
Мутация G367R в гене миоцилина встречается у пациентов с первичной ювенильной глаукомой Санкт-Петербурга с частотой, сопоставимой с таковой в других популяциях.
-
Впервые в мире охарактеризована новая мутация P369ins в гене цитохрома Р450 1В1 у пациента с первичной врожденной глаукомой, которая является частью компаунд-генотипа и может быть предрасполагающим фактором развития ПВГ.
-
Носительство аллеля G полиморфизма L432V в гене цитохрома Р450 1В1 не является генетическим фактором риска развития ни одной из форм первичной глаукомы у больных Санкт-Петербурга.
-
Среди всех обнаруженных полиморфизмов в генах MYOC и CYP1B1, лишь носительство аллеля G полиморфизма N453S в гене цитохрома Р450 1В1 может являться генетическим фактором риска развития ПВГ.
-
Экспресс-диагностика мутации G367R в гене миоцилина и полиморфизма N453S в гене цитохрома Р450 1В1 может быть осуществлена с помощью ПДРФ-анализа.
-
Диагностику мутации P369ins в гене цитохрома Р450 1В1 удобно проводить с помощью гетеродуплексного анализа.
-
Пациентов с ПЮГ, их детей и кровных родственников до 35 лет целесообразно тестировать на наличие мутаций в гене миоцилина.
Внедрение результатов работы в практику.
Методика молекулярно-генетического исследования у больных с первичной ювенильной глаукомой внедрена в работу клиники офтальмологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на:
II международном молодежном конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2007», Санкт-Петербург, 5-7 декабря 2007 года; Всероссийском Форуме «Наука и инновации в технических университетах», Санкт-Петербург, 28-31 октября 2008 года; Всероссийской межвузовской конференции студентов и аспирантов «XXXVII неделя науки СПбГПУ», Санкт-Петербург, 24-29 ноября 2008 года; Съезде генетиков и селекционеров, посвященый 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 года; совместном заседании научной проблемной комиссии по молекулярной медицине и кафедры офтальмологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П. Павлова, ноябрь 2009 года.
Публикации результатов работы.
По теме диссертации опубликовано 11 работ. 22.06.2009 принят к оформлению патент на изобретение «Способ обнаружения мутации P369ins в гене CYP1B1, предрасполагающей к развитию первичной врожденной глаукомы» (входящий номер 032948, регистрационный номер 2009123806).
Структура и объем диссертации.
Похожие диссертации на Мутации и полиморфизмы в генах миоцилина, цитохрома Р450 1В1 у больных с первичной врожденно, первичной ювенеальной и первичной открытоугольной глаукомами из числа жителей Санкт-Петербурга
