Введение к работе
Актуальность проблемы
Наиболее частой причиной неудовлетворительных результатов кератопластики является развитие реакции тканевой несовместимости с развитием болезни трансплантата роговицы и исходом в стойкое помутнение. По данным разных авторов, помутнение в посттрансплантационном периоде развивается от 5 до 70% наблюдений в зависимости от исходной этиологии бельма (Слепова О.С, 1991; Кротова Е.В., 1994; Комах Ю.А., 1995; Балаян Т.Г., 2008; Борзенок С.А., 2008; Dua H.S., Azuara-Blanco А., 1999; Hill 1С, 2002).
В группу кератопластики высокого риска по отторжению сквозных трансплантатов роговицы входят реципиенты с тяжелыми бельмами ожоговой этиологии, васкуляризированными бельмами инфекционно-воспалительного генеза, помутнением трансплантата роговицы и реконструктивными операциями глаза на базе сквозной кератопластики (Копаева В.Г., 2002; Макаров П.В. и др., 2007; Goichet-Bonnat L. et al, 1987;
CCTS, 1992; Hill J.C. 1994; Rumelt S. et al., 2002; Pleyer U., 2003; Hamrah P., 2005; Kaminska A. et al, 2005; de Freitas A.M. et al, 2006).
В настоящее время единственным широко применяемым способом защиты аллогенных трансплантатов от отторжения служит иммуносупрессивная фармакотерапия. Однако для профилактики помутнения трансплантата роговицы локальное применение препаратов этой группы ограничено отсутствием или дефицитом «глазных лекарственных форм», их недостаточным терапевтическим действием, а при системном и длительном применении - возникновением ряда побочных эффектов: гепато- и нефропатий, вторичного иммунодефицита и активации латентных вирусных инфекций (Каспаров А.А. и др., 2002; Robert P.Y. et al, 2001; Pleyer U., 2003; Tabbara K.F., 2008). Кроме того, до 46% реципиентов с пересадкой роговицы остаются резистентными к иммуносупрессивной фармакотерапии (Балаян Т.Г., 2008).
В последние годы наметился интерес трансплантологов к использованию клеточных трансплантатов с иммунокорригирующими свойствами (Шумаков В.И. и др., 2009; Starzl Т.Е., 2004) и так называемой «Малой иммуносупрессивной фармакотерапии» (Готье СВ., 2011; GirlandaR. et al, 2007).
Изучение свойств стволовых/прогениторных клеток костного мозга и прежде всего мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) позволило установить, что человеческие ММСК способны индуцировать иммунную толерантность при аллотрансплантации органов и тканей. Индукция иммунной толерантности происходит за счет блокировки активности эффекторных Т-клеток при аллогенной пересадке (Majumdar М.К. et al, 2003), активации размножения Т-регуляторных клеток с супрессивными свойствами, стимуляции секреции противовоспалительных пептидов (Aggarwal S., 2005) и одновременной активации регенераторных процессов в поврежденных органах (Шумаков В.И., 2009.).
Особую роль в формировании иммунной толерантности в организме играют неклассические молекулы HLA класса I МНС (Rouas-Freiss N. et al. 1997; Hviid T.V., 2006). Так, экспрессия HLA-G позволяет клеткам избежать иммунного надзора, то есть создает условия толерантности (Lila N. et al, 2001, 2002; Rieger L. et al, 2002; Hviid T.V. et al, 2005). Проводятся исследования экспрессии молекул HLA-G при аллогенной трансплантации органов и тканей: почки (Jin H.L. et al., 2012), легкого (Brugiere О. et al, 2009), кожи (Carosella E.D. et al, 2008), а также при других патологических состояниях (Gonzalez A. et al, 2012).
Не так давно было выявлено присутствие ММСК-подобных клеток в глубоких слоях лимба (Du Y. et al. 2005; Polisetty N. et al, 2008; Li G.G. et al, 2010; Lim M.N. et al, 2012),
обеспечивающих процессы физиологической и репаративной регенерации роговицы (Du Y. et al. 2005; Dravida S. et al, 2005; Choong P.F. et al, 2007; Blazejewska E.A. et al, 2009), a также обнаружена экспрессия молекул HLA-G в роговице, как в норме, так и при некоторых патологических состояниях (Le Discorde М. et al. 2003; Higa К. et al. 2006).
В клинике при кератопластике высокого риска и сопутствующем синдроме лимбальной недостаточности (СЛН) проводят сотрансплантации стволовых клеток лимба и донорской роговицы, используя аутотрансплантаты лимба или лимбальные клетки с парного глаза, культивированные на различных носителях (Кепуоп K.R. et al, 1989; Grueterich М. et al, 2002), а также трансплантаты аллогенного лимба от доноров-трупов (Dua H.S. et al, 1999; Tsubota К. et al, 1999; James E.S. et al, 2001).
Однако указанные методы трансплантации стволовых клеток лимба не позволяют обеспечить их широкое применение в клинической практике из-за опасности развития ятрогенного СЛН на парном глазу, технической сложности выполнения операции и необходимости длительной иммуносупрессивной терапии (Robert P.Y. et al, 2001).
Между тем известно, что консервация донорских роговиц в жидких средах, позволяет не только сохранить исходный фенотип клеток трансплантата, но и значительно снизить его иммунную реактивность за счет элиминации клеток Лангерганса (антигенпрезентирующих клеток) (Кротова Е.В., 1994; Holland E.J. et al., 1987; Ardjomand N. et al, 1998). Однако в имеющейся литературе отсутствуют сведения о влиянии органотипической консервации на состояние ММСК-подобных стволовых клеток лимба, назначение которых обеспечивать состояние толерантности окружающих тканей к трансплантату роговицы.
Отсутствие в литературе сведений о сохранности ММСК-подобных клеток лимба при органотипической консервации, а также необходимость снижения процента неудовлетворительных результатов кератопластики высокого риска, позволили нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования. Разработка медико-технологической системы выделения, органотипической консервации и сотрансплантации аллогенных лимбальных трансплантатов с иммуносупрессивными свойствами при кератопластике высокого риска.
Задачи исследования
1 .Разработать технику выделения аллогенных лимбальных трансплантатов с иммуносупрессивными свойствами.
2.Разработать протоколы консервации и предоперационной подготовки аллогенных лимбальных трансплантатов с иммуносупрессивными свойствами.
3.Изучить в эксперименте динамику цитокинового статуса мезенхимальных клеток аллогенных лимбальных трансплантатов в процессе органотипической консервации и предоперационной подготовки.
4.Изучить в эксперименте морфологические и ультраструктурные характеристики аллогенных лимбальных трансплантатов в процессе их консервации и предоперационной подготовки.
5. Оценить клиническую эффективность сотрансплантации консервированных аллогенных лимбальных трансплантатов с иммуносупрессивными свойствами у реципиентов при кератопластике высокого риска.
Научная новизна результатов исследования
Впервые доказана возможность сохранения ММСК-подобных клеток лимба с иммуносупрессивными свойствами в процессе органотипической консервации ЛТ, что позволяет повысить процент прозрачного приживления трансплантата роговицы при сочетанной кератопластике высокого риска (р<0,05). Показана возможность использования метода индивидуального динамического измерения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в слезной жидкости для прогнозирования развития криза отторжения и прозрачного приживления трансплантата роговицы.
Впервые для доказательства сохранения в лимбальных трансплантатах (ЛТ) ММСК-подобных клеток с иммуносупрессивными свойствами использована динамика повышения противовоспалительных и снижения провоспалительных цитокинов в консервационной среде, а также сохранение экспрессии молекул HLA-G - маркера толерогенных свойств клеток. При сравнительном анализе результатов органотипической консервации донорских ЛТ в стандартной культуральной среде и среде Борзенка-Мороз установлено, что для сравниваемых сред оптимальным сроком сохранения ММСК-подобных клеток лимба с иммуносупрессивными свойствами являются 21-е - 28-е сутки.
Впервые для доказательства клинической пригодности ЛТ после криогенной консервации использовано выявление в них активированных ММСК-подобных клеток с иммуносупрессивными свойствами. Установлено, что оптимальным периодом для восстановления активности ММСК-подобных клеток в процессе их органотипической реконсервации является срок не менее 7-ми суток.
Впервые установлено, что сотрансплантация ЛТ, прошедших стадию органотипической консервации, способствует снижению потери эндотелиальных клеток трансплантата роговицы на 9,7% при кератопластике высокого риска.
Практическая значимость результатов исследования
Впервые разработана технология заготовки жизнеспособных ЛТ, включающая два этапа: хирургическое выделение и их последующая органотипическая консервация.
Установлено, что первый этап - хирургическое выделение ЛТ из глаз доноров-трупов, - должен проводиться в сроки до 18-ти часов после смерти донора (для сохранения максимального резерва жизнеспособности стволовых клеток лимба), с применением техники, которая позволяет сохранить герметичность глазного яблока для последующего выкраивания корнеосклерального диска; второй этап - органотипическая консервация тканевых фрагментов димба, - необходим для активации иммуносупрессивных свойств ММСК-подобных клеток лимба с оптимальными сроками достижения этого эффекта 21-28 сутки.
Показано, что среда Борзенка-Мороз пригодна для органотипической консервации фрагментов лимба и сохранения ММСК-подобных клеток ЛТ, как и стандартная среда, используемая для культивирования ММСК костного мозга.
Впервые разработан протокол криогенной консервации ЛТ, предварительно прошедших стадию органотипической консервации. Протокол включает обязательный этап реконсервации не менее 7-ми суток в условиях нормотермии перед клиническим применением, для восстановления структурно-функциональной целостности ММСК-подобных клеток ЛТ. Разработанный протокол послужил основой для создания Криобанка ЛТ на базе Глазного тканевого банка ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ.
Установлена клиническая эффективность и целесообразность сотрансплантации аллогенных ЛТ, прошедших стадию органотипической консервации, при кератопластике высокого риска. Предложенная методика сотрансплантации позволяет повысить количество прозрачных приживлений кератотрансплантов на 16,4% в течение 1-го года после кератопластики. Метод динамического контроля про- и противовоспалительных цитокинов в слезной жидкости может быть использован для прогнозирования результатов сотрансплантации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Активированные ММСК-подобные клетки лимба являются маркерами жизнеспособности лимбальных трансплантатов, обладающих иммуносупрессивными свойствами.
2.Оптимальными сроками органотипической консервации ЛТ следует считать 21-28 сутки в связи с достижением максимального накопления ММСК-подобных клеток лимба,
высокого уровня их фенотипической активности, активации молекул HLA-G с иммуносупрессивными свойствами на фоне повышения уровня противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGFP) в консервационной среде.
З.Сотрансплантация алло генных ЛТ, прошедших стадию органотипической консервации, при кератопластике высокого риска позволяет значительно снизить потерю эндотелиальных клеток (на 9,7%) и повысить количество прозрачных приживлений донорских роговиц (на 16,4%) как минимум в течение первого года после кератопластики.
Внедрение в практику
Разработанные техника выделения, протоколы органотипической и криогенной консервации аллогенных лимбальных трансплантатов с иммуносупрессивными свойствами, а также клинические показания к сотрансплантации их при кератопластике высокого риска внедрены в практику Глазного тканевого банка Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем, Головной клиники ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России», Глазного банка Чебоксарского филиала «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России», Тканевого банка Одесского НИИ глазных болезней и тканевой терапии им. акад. В.П.Филатова» НАН Украины.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях и съездах: на 8-й и 10-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2009, 2012); на 9-м Съезде офтальмологов России (Москва, 2010); на 5-м Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2010); на 2-м международном ежегодном конгрессе EuCornea (Вена, Австрия, 2011); на Национальной научной конференции с международным участием «Филатовские чтения» (Одесса, Украина, 2011, 2012); на Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию З.Алиевой (Баку, Азербайджан, 2013); на двух научно-клинических конференциях ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России (Москва, 2011, 2012); на VI Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2013).
Диссертация апробирована на совместной конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России и кафедры глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета с участием специалистов по трансплантологии и иммунологии из ФГБУ «ФНЦ
трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И.Шумакова» Минздрава России (Москва, 2013).
Публикации Всего по теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов по теме диссертации, и 3 в иностранных изданиях. Получен патент РФ на «Способ выделения и органотипического культивирования алло генного лимбального трансплантата».
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 18 таблицами. Работа построена по классическому типу и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов и двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Указатель цитируемой литературы включает 233 источника, из них 49 отечественных и 184 иностранных.
Разработку протоколов хирургического выделения, органотипической, криогенной консервации и предоперационной подготовки ЛТ осуществляли на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (руководитель - д.м.н. С. А. Борзенок) и головной клиники ФГБУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва), Лаборатории биотехнологии стволовых клеток (заведующая - д.м.н. проф. Н.А. Онищенко), определение уровня исследуемых цитокинов и растворимой молекулы HLA-G5 проводили в Лаборатории иммунодиагностики и иммунокоррекции (заведующая - д.м.н. проф. B.C. Сускова) ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова Минздрава России», изучение полученных в ходе исследования препаратов ЛТ с последующей фоторегистрацией осуществляли на базе Лаборатории анатомии микроорганизмов (заведующая - д.м.н. Л.В. Диденко) ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, изучение фенотипа клеток ЛТ осуществляли на базе Лаборатории клеточной биологии и патологии развития (заведующая - д.б.н. И.Н. Сабурина) ФГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН.
Похожие диссертации на Медико-технологическая система консервации и сотрансплантации аллогенных лимбальных трансплантатов при кератопластике высокого риска
![Сквозная кератопластика с биопокрытием трансплантата у больных вторичной отечной дистрофией роговицы [Электронный ресурс]](/i/i/4334/179787.png "Сквозная кератопластика с биопокрытием трансплантата у больных вторичной отечной дистрофией роговицы [Электронный ресурс] Абу Траби Диаа")
