Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Общая характеристика наследственных оптических нейропатии... 15
1.2. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика наследственных оптических нейропатии 16
1.2.1. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика аутосомно-доминантной оптический нейропатии. Пенетрантность и экспрессивность гена 16
1.2.2. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика наследственной оптической нейропатии Лебера. Феномен гетероплазмии...20
1.2.3. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика аутосомно-рецессивной оптической нейропатии 25
1.2.4. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика Х-сцепленной атрофии зрительного нерва 27
1.2.5.Дополнительные клинические методы исследования наследственных оптических нейропатии 28
1.3. Митохондрии 30
1.3.1. Строение и функции митохондрий 30
1.3.2.Строение и функции дыхательной цепи митохондрий 32
1.4. Общая характеристика митохондриальных заболеваний 35
1.5. Модели митохондриальных заболеваний 36
1.6. Изучение электрохимического потенциала митохондрий 40
1.7. Заключение по обзору литературы 42
CLASS Глава 2. Материалы и методы исследования 4 CLASS 4
2.1. Клинические исследования 44
2.1.1. Характеристика выборки пациентов 44
2.1.2. Офтальмологические методы обследования пациентов 47
2.2. Молекулярно-генетические исследования 51
2.2.1. Материал для исследования 52
2.2.2. Методы молекулярно-генетического исследования 52
2.3. Клеточные исследования 55
2.3.1. Материал для клеточных исследований 55
2.3.2. Методы клеточного исследования 55
2.4. Методы информационной обработки данных 58
Глава 3. Результаты клинических и генетических исследований 60
3.1. Результаты генетических исследований 60
3.2. Характеристика пациентов с генетически верифицированной наследственной оптической нейропатией. Данные наследственного анамнеза 63
3.3. Клиническая картина генетически верифицированной наследственной оптической нейропатии 68
3.3.1. Показатели визометрии 68
3.3.2. Показатели цветового зрения 72
3.3.3. Показатели компьютерной периметрии 73
3.3.4. Офтальмоскопическая картина 78
3.3.5. Структурные изменения сетчатки и зрительного нерва по данным спектральной оптической когерентной томографии 80
3.3.6. Электрофизиологические и психофизические показатели 89
3.4. Характеристика пациентов с генетически неверифицированной
наследственной оптической нейропатией. Данные наследственного
анамнеза 92
Глава 4. Результаты цитологических исследований 96
Глава 5. Алгоритм диагностики наследственных оптических нейропатии 103
Клиничекие примеры 106
Глава 6. Заключение 119 выводы 123
Практические рекомендации 125
Список литературы 126
- Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика аутосомно-доминантной оптический нейропатии. Пенетрантность и экспрессивность гена
- Офтальмологические методы обследования пациентов
- Клиническая картина генетически верифицированной наследственной оптической нейропатии
- Структурные изменения сетчатки и зрительного нерва по данным спектральной оптической когерентной томографии
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика аутосомно-доминантной оптический нейропатии. Пенетрантность и экспрессивность гена
В литературе встречается синоним заболевания: аутосомно-рецессивная атрофия зрительного нерва. Изолированные формы аутосомно-рецессивной оптической нейропатии (АРОН) наблюдаются чрезвычайно редко, по поводу их существования неоднократно высказывались сомнения [13, 109]. Однако в литературе описаны несколько случаев изолированной АРОН в кровнородственных браках с указанием родословной пробандов [153]. Так, Barbet F. и соавторы в 2003 г. описали французскую семью, в которой от брака двоюродных сибсов четверо детей из шести имели изолированную АРОН. В отличие от имеющихся сообщений о случаях АРОН с очень ранним началом и тяжелой потерей зрительных функций, в данной семье ухудшение зрения отмечалось в возрасте 2-6 лет, заболевание медленно прогрессировало, при этом острота зрения снижалась до 0,1-0,2, развивалась умеренная фотофобия и дисхроматопсия в красно-зеленом спектре. При картировании на длинном плече хромосомы 8 удалось определить локус ОРА6, но ген не был идентифицирован [24].
Hanein S. и соавторы в 2009 г. описали 4 семьи из Северной Африки, в которых дети от близкородственных браков имели изолированную форму АРОН, и определили связь заболевания с мутацией в гене ТМЕМ126А на хромосоме 11 [59]. Та же мутация была выявлена у двух сибсов в алжирской семье, у которых АРОН сочеталась со слуховой нейропатией, проявляющейся медленно прогрессирующей потерей слуха [105].
Однако в большинстве случаев АРОН является частью мультисистемного заболевания с поражением нервной системы и других органов, манифестирует в младенчестве и быстро прогрессирует в дальнейшем. Описано большое число аутосомно-рецессивных синдромов, в которых АЗН является одним из клинических проявлений (синдром Бера, оптикокохлеарный синдром, инфантильная АЗН Вента, оптикоакустическая атрофия с деменцией Иенсена и т.д.) [20, 146]. Для некоторых из синдромов идентифицированы гены.
Метилглютаконовая ацидурия III типа (синдром АЗН Костеффа -Costeff optic atrophy syndrome) является аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся ранней двухсторонней АЗН, спастичностью, экстрапирамидной дисфункцией и когнитивными нарушениями, повышенной экскрецией с мочой 3-метилглютаконовой и 3-метилглютаровой кислот [136]. Ген, отвечающий за развитие этого заболевания, ОРАЗ идентифицирован в локусе 19ql3.2 - ql3.3 [20]. При синдроме Вольфрама, для которого характерно сочетание АРОН с несахарным и сахарным диабетом, нейросенсорной глухотой, идентифицированы гены WFS1 (МІМ 606201) и WFS2 в локусе 4q22-q24 (МІМ 604928) [24]. АЗН выявляется при атаксии Фридрейха и врожденной спастической параплегии, тип 7, обусловленные мутациями в генах яДНК в FXNn SPG7, соответственно [158]. 1.2.4. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика X-сцепленной атрофии зрительного нерва
Заболевание встречается крайне редко, в литературе описаны лишь единичные случаи Х-сцепленной АЗН, для которой характерно поражение только лиц мужского пола.
Впервые Lysen J.С. и Oliver СР. в 1947 году описали 8 мужчин с АЗН в 4 поколениях, у некоторых из пациентов авторы отмечали наличие нистагма, катаракты, косоглазия [94]. Следующее описание семьи с X-сцепленной нейропатией зрительного нерва появилось в 1967 году. Rosenberg R.N. и Chutorian А. исследовали двух братьев и их племянника с прогрессирующей АЗН, нейросенсорной тугоухостью и полинейропатией [125]. В 1981 году Jensen Р.К. описал похожий семейный случай, при этом, наряду с нейросенсорной тугоухостью, прогрессирующая АЗН сопровождалась деменцией [70].
В 1974-1975 годах были опубликованы сообщения о большой семье с Х-сцепленной ОН у мужчин, у четырех из которых впоследствии молекулярно-генетическое исследование позволило выявить связь заболевания зрительного нерва с геном ОРА2, локализованном в локусе Хр11.4-Хр11.2. В 2006 году сообщили о семье из Айдахо (США), в которой 6 мужчин в 3-х поколениях имели Х-сцепленную форму АЗН, которую также ассоциировали с локусом ОРА2 [21, 152].
Исходя из данных литературы, можно отметить некоторые особенности, характерные для Х-сцепленной АЗН: начало снижения зрения в детском возрасте, фенотипические различия заболевания внутри одной семьи, что связывают с влиянием на проявление признаков факторов внешней среды или других генетических факторов, в большинстве случаев сочетание Х-сцепленной АЗН с дополнительными неврологическими симптомами [74]. 1.2.5. Дополнительные клинические методы исследования наследственных ОН
Изучению перипапаллярного слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) с помощью оптического когерентного томографа Stratus посвящено несколько публикаций. В 2005 году Barboni Р. и соавторы проводили исследование структурных изменений общей толщины перипапиллярного СНВС и отдельно в 4 квадрантах в острой и хронической стадии заболевания у пациентов с НОНЛ [27]. Было выявлено увеличение толщины СНВС в верхнем, назальном и нижнем секторах, а также средней толщины СНВС у пациентов в острой/подострой стадии заболевания (в течение 6 месяцев от начала заболевания) по сравнению с группой контроля. Существенных изменений СНВС в височном секторе не было обнаружено. В атрофической стадии заболевания потери СНВС составили 42,1%, 47,7%, 38% и 49.8%, соответственно в темпоральном, верхнем, носовом и нижнем секторах. Однако исследование СНВС в острой/подострой стадии у каждого пациента выполняли однократно в разные сроки в пределах 6 месяцев от начала заболевания, суммируя, таким образом, и увеличение показателей СНВС на первых месяцах и уменьшение показателей в более поздний период до полугода.
Офтальмологические методы обследования пациентов
СТОЛЬ высокая доля встречаемости спорадических случаев (80,6%) можно объяснить низкой (неполной) пенетрантностью заболевания, в результате чего доля лиц, у которых обнаруживают проявление мутантного гена среди всех лиц, унаследовавших этот ген, значительно варьирует. Подобные результаты в некоторых случаях обусловлены трудностями получения информации о родственниках пациентов и их заболеваниях. Однако после выявления мутации мтДНК некоторые пациенты либо вспоминают о наличии родственников с подобными нарушениями зрения, которые ранее они связывали с травмой, приемом алкоголя, лекарственных средств и другими причинами, либо в результате тщательного изучения жизни и болезней своих родственников получают новые, до сих пор неизвестные им сведения. Так, после проведения генетического исследования еще 8 пациентов уточнили, что среди их родственников есть люди с низкой остротой зрения, т.е. суммарно наследственный анамнез по АЗН был отмечен у 15 (41,7 %) из 36 пациентов. Кроме того, наблюдение в течение 5 лет за пациентами с верифицированным диагнозом НОНЛ и их семьями выявило 6 новых случаев НОНЛ в 4-х семьях, с прежде неотягощенным семейным анамнезом. Таким образом, отсроченные данные наследственного анамнеза показывают значительно большее количество семейных форм заболевания: у 17 (56,7%) из 30 пациентов, наблюдаемых в течение 3 лет их заболевания, и у 20 (83,3%) из 24 пациентов, наблюдаемых в течение 5 лет заболевания (Табл.5).
Первичные и отсроченные (через 5 лет наблюдения) данные семейного анамнеза у пациентов с клинически установленным диагнозом наследственной оптической нейропатии.
АДОН была выявлена у женщины 32 лет и у мужчины 54 лет. В семейном анамнезе у каждого был выявлен один родственник с низкой остротой зрения: мать у женщины и отец у мужчины. Учитывая, что начало заболевания у пациентов было выявлено в дошкольный период, длительность заболевания до выявления этиологии частичной АЗН составила около 25 и 47 лет соответственно у женщины и мужчины.
Клиническая картина генетически верифицированной наследственной оптической нейропатии 3.3.1. Показатели визометрии
Клиническая картина НОНЛ у 34 пациентов (68 глаз) характеризовалась постепенным безболезненным снижением зрения на обоих глазах до 0,1 и ниже. У одного пациента снижение зрения было выявлено в 4-летнем возрасте до 0,5/0,33 на правом и левом глазу соответственно, без существенной динамики на протяжении 32 лет наблюдения (по результатам данных медицинской документации пациента и собственных наблюдений).
24 пациента в начале заболевания отмечали последовательное снижение зрения, сначала на одном глазу, через несколько дней или недель на другом. 7 пациентов заметили одновременное снижение зрения на обоих глазах, 4 пациента не смогли четко определить последовательность или одновременность снижения зрения. У одного пациента, наблюдающегося в течение 15 месяцев, заболевание носило односторонний характер, второй глаз не был вовлечен в клинический процесс на текущий период наблюдения.
Динамическое наблюдение за пациентами с НОНЛ выявило частичное восстановление остроты зрения у 6 пациентов (17% случаев среди всех пациентов с НОНЛ): у 2-х пациентов с мутацией m. 11778G A в гомоплазмическом состоянии - до 0,8/0,6 соответственно на OD/OS у одного пациента, до 0,28 на OD у второго пациента (острота зрения OS без динамики); у пациента с мутацией m.3460G A в гомоплазмическом состоянии до 0,28/0,5; у двух пациентов с мутацией т. 14484Т С в гетероплазмическом состоянии соответственно до 0,8/0,6, 0,8/0,8, 1 пациента 0,6/0,8, с мутацией т.14484Т С в гомоплазмическом состоянии (Рис.10). Начало восстановления зрения у пациентов было зафиксировано в диапазоне от 2 до 28 месяцев от начала заболевания, медиана составила 14 месяцев. Раннее восстановление зрения, как в нашем исследовании у пациента с т.14484Т С на 2-м месяце заболевания, может приводить к ошибочной оценке этиологии ОН как неврита. Это согласуется с рядом работ, в которых авторы также указывают на возможность невритоподобного течения НОНЛ [148, 123].
Максимальная острота зрения у этих пациентов на текущий период наблюдения была выявлена в диапазоне 14-36 месяцев, медиана составила 20 месяцев.
Однако у всех пациентов с высокой остротой зрения вдаль сохранялись сниженные показатели остроты зрения вблизи. Так, острота зрения вблизи была снижена по сравнению с остротой зрения вдаль приблизительно в два раза, пациенты испытывают существенный дискомфорт при работе вблизи.
Все пациенты с НОНЛ получали энерготропную терапию, улучшающую внутриклеточные процессы энергообмена и показанную при митохондриальной патологии. Однако механизмы восстановления зрения у части пациентов непонятны, не изучены они и другими авторами. Неизвестно, является ли восстановление зрения самопроизвольным, обусловленным особенностями генетического дефекта, или корректирующее влияние оказывает энерготропная терапия [135, 15, 77].
Показатели визометрии остальных пациентов либо существенно не менялись, либо отмечалась тенденция к некоторому снижению остроты зрения. На рисунке 10 представлены показатели остроты зрения 32 пациентов (64 глаза), которые находились под наблюдением не менее 1,5 лет. Отмечена острота зрения через 6 месяцев после начала заболевания, когда показатели визометрии относительно стабилизировались, а также на текущий период наблюдения, через 1,5-5 лет от начала заболевания.
Клиническая картина генетически верифицированной наследственной оптической нейропатии
Молекулярно-генетическое исследование на наличие 12 мутаций мтДНК, а также мутаций в горячих участках гена (7экзонов) ОРА1, не выявило мутации у 59 пациентов (61%) из 97 обследуемых (18 женщин, 41 мужчин) (Табл. 17). Таблица 17 Распределение пациентов с клинически установленным диагнозом наследственной оптической неиропатии в зависимости от выявленных мутаций и наличия семейного анамнеза.
Тип оптической неиропатии Мутации Кол-во пациентов Семейные/спорадические случаи Первичные данные Отсроченные данные НаследственнаяоптическаянейропатияЛебера Обнаружены (m.H778G A, т.14484Т С, m.3460G A, Ш.41710А) 36 7/29 20/4 Не обнаружены 37 1/36 5/12 Аутосомно-доминантнаяоптическаянейропатия Обнаружены (c.869G A c.2850delT) 2 2/0 2/0 Не обнаружены 22 9/13 9/13 Всего 97 19/78 36/29 Отсроченные данные рассчитывали для пациентов, наблюдение за которыми составило 5 лет.
Клиническую картину, соответствующую НОНЛ, наблюдали у 63% обследованных с генетически неверифицированным заболеванием (37 пациентов). При этом отмечали двустороннее одновременное или последовательное безболезненное снижение зрения до 0,1 и ниже с развитием центральной или центроцекальной скотомы, дисхроматопсией. Офтальмоскопическая картина в острой стадии характеризовалась типичными изменениями: гиперемией ДЗН, извитостью ретинальных сосудов, перепапиллярными телеангиэктазиями, отеком перипапиллярного слоя нервных волокон, в хронической стадии формировалась частичная АЗН с диффузной или височной бледностью ДЗН. Через 5 лет наблюдения у 5 пациентов был выявлен наследственный анамнез по АЗН по материнской линии.
Классическая клиническая картина, типичная для АДОН, была отмечена у 22 обследованных пациентов с генетически неверифицированным заболеванием (37% случаев), из них у 9 пациентов с их слов имелись родственники с АЗН. У этих пациентов отмечали двустороннее симметричное снижение остроты зрения в первые десять лет жизни, во многих случаях с незаметным, субклиническим началом. Прогрессирование заболевания отличалось вариабельностью: от умеренной потери остроты зрения, которая стабилизировалась в юности, до медленного, но постоянно прогрессирующего снижения зрения. Кроме этого наблюдали случаи с внезапными, ступенчатыми уменьшениями показателей визометрии. Клиническая картина характеризовалась развитием дисхроматопсии различной степени выраженности, двусторонними центральными и центроцекальными скотомами с различной степенью депрессии световой чувствительности. Офтальмоскопическая картина соответствовала двусторонней частичной АЗН с преимущественным побледнением височной стороны ДЗН, в некоторых случаях с развитием глубокой экскавацией ДЗН. Отсутствие наследственного анамнеза у части пациентов, вероятно, связано с тем, что АДОН свойственна вариабельная экспрессия, характеризующаяся тем, что степень выраженности клинических проявлений гена широко варьирует от субклинических изменений функций зрения до полной слепоты. Поэтому родственники, имеющие незначительные нарушения зрительных функций, могут не знать об имеющейся патологии зрительного нерва.
Таким образом, в нашем исследовании пациенты на основании клинических показателей и имеющихся данных наследственного анамнеза для анализа результатов были подразделены на две группы: НОНЛ и АД ОН. Однако, учитывая возможность пересекающихся признаков заболеваний в редких случаях, всем пациентам было проведено описанное выше полное молекулярно-генетическое исследование.
Среди всех пациентов с клинически установленным диагнозом НОНЛ или подозрением на этот диагноз только в 49% случаев этиология заболевания была генетически верифицирована. Отчасти, это связано с тем, что диагностика НОНЛ в нашей работе была ограничена 12 мутациями мтДНК. Однако известны другие условно патогенные мутации, патогенность которых в настоящее время неокончательно доказана в силу единичных случаев наблюдения, т.е. возможно, что в нашей выборке имеются случаи, причиной которых являются более редкие мутации митохондриального генома.
Возможно, это связано с тем, что наряду с генетически обусловленными случаями заболевания, в изученной группе имеется некоторое число фенокопий ОН, обусловленной неустановленными негенетическими причинами. По данным литературы три первичные мутации (т. 14484Т С, m.3460G A, m.H778G A) являются причиной 90-95% всех случаев НОНЛ. Однако в нашем исследовании мажорные мутации были выявлены у 51% пациентов с лебероподобной клинической картиной. Существенную разницу можно объяснить различными условиями отбора пациентов для исследования. Высокий процент определения вышеперечисленных мутаций был выявлен в работах, авторы которых включали только семейные случаи, по крайней мере, с двумя мужчинами с ОН, родственно связанными через одну здоровую женщину, с подтвержденной материнской передачей заболевания [33].
В наше исследование были включены пациенты с типичной клинической картиной для НОНЛ, вне зависимости от наличия семейного анамнеза. Вместе с тем из таблиц 5 и 17 следует, что среди семейных случаев три первичные мутации НОНЛ встречаются у 18 пациентов из 25, т.е. в 72% случаев.
Низкая доля выявления генетических изменений при АДОН в нашей работе, возможно, связана с ограничением задач исследования и поиском мутаций только в «горячих» точках гена ОРА1, наиболее часто встречающихся у больных АДОН западно-европейской популяции. Вероятно мутационная структура гена ОРА1 у пациентов, проживающих на территории РФ, имеет отличия.
Структурные изменения сетчатки и зрительного нерва по данным спектральной оптической когерентной томографии
Молекулярно-генетический анализ «горячих» участков гена ОРА1 позволил в 2-х случаях идентифицировать патогенные мутации: мутацию c.869G A (Arg290Gln) в 8 экзоне, мутацию c.2850delT (p.950Gly Glu) в 28 экзоне, которая была впервые обнаружена в нашей работе, ранее не была описана.
Низкая генетическая выявляемость наследственных ОН отчасти, вероятно, связана с тем, что в нашей выборке имеются случаи НОНЛ, причиной которых являются более редкие мутации митохондриального генома. Небольшая доля генетической верификации АДОН, возможно, связаны с ограничением задач исследования и поиском мутаций только в «горячих» точках гена ОРА1, наиболее часто встречающихся у больных АДОН западно-европейской популяции. Вероятно мутационная структура гена ОРА1 у пациентов, проживающих на территории РФ, имеет отличия.
Таким образом, большое разнообразие мутаций в митохондриальном и ядерном геноме затрудняют поиск патологических изменений мтДНК и яДНК, являющихся причиной наследственных ОН. Однако при этом нельзя полностью исключить возможность того, что определенные спорадические ОН могут быть фенокопиями, вызванные негенетическими причинами, но имеющими схожие клинические характеристики.
Клиническая картина наследственных ОН, которая характеризуется специфичностью проявлений, как показало исследование, может отличаться особенностями течения, возрастом манифестации заболевания, низкими показателями отягощенности наследственного анамнеза по АЗН.
В нашей работе при первичном осмотре и наблюдении пациентов до результатов генетического исследования НОНЛ, семейный анамнез по АЗН был установлен только в 19,4% случаев, что согласуется с работами многих авторов, которые также отмечают высокий процент спорадических случаев. Лишь только отсроченные данные наследственного анамнеза показывают значительно большее количество семейных форм заболевания (83,3% случаев) за счет получения новых сведений о родственниках самими пациентами, а также выявления новых случаев в семьях, с прежде неотягощенным семейным анамнезом.
Особенности наследственных заболеваний, которые проявляются неполной пенетрантностью и вариабельной экспрессией, полиморфизм клинических проявлений, сложность выявления наследственных признаков заболевания, а также генетическая гетерогенность часто приводят к трудностям в распознавании и диагностировании наследственных ОН.
Вместе с тем, одним из результатов работы явилось выявление особенностей структурных изменений сетчатки и зрительного нерва, которые имеет большую значимость для своевременной дифференциальной диагностики НОНЛ среди ОН иного генеза. Спектральная ОКТ, выполненная у пациентов в динамике, продемонстрировала определенный алгоритм структурных изменений, характеризующийся первоначальным истончением внутренних слоев сетчатки в сочетании с отеком перипапиллярного СНВС, а также последовательным развитием выраженных атрофических изменений КГК и лишь отсрочено в перипапиллярной зоне, с более ранними и выраженными структурными изменениями в височном секторе перипапиллярного СНВС.
Учитывая, что в основе развития наследственных ОН, лежит генетически детерминированное нарушение функций комплексов дыхательной цепи митохондрий и снижение продукции АТФ, изменение биоэнергетических функций митохондрий, в нашей работе была предложена методика дифференциальной диагностики наследственных ОН путем изучения мембранного потенциала митохондрий в культуре фибробластов кожи пациентов.
Исследование выявило, что олигомицин, ингибитор АТФ-синтазы, в линии клеток здоровых людей вызывает увеличение интенсивности флюоресценции митохондрий в среднем на 33,3%, что свидетельствует о повышении потенциала митохондрий. В то же время у 13 пациентов с НОНЛ отмечалось снижение интенсивности флюоресценции митохондрий на 6,3% обусловленных влиянием олигомицина. У 2 пациентов с АДОН, выявлено снижение интенсивности флюоресценции митохондрий под действием олигомицина в одном случае на 13,4%, во втором случае небольшое увеличение на 4,7%.
У всех 8 исследованных пациентов с неверифицированным генетическим дефектом предложенная методика обнаружила снижение интенсивности флюоресценции митохондрий фибробластов кожи на 13,4%, что позволило выявить у этих пациентов митохондриальную патологию и рекомендовать расширенный поиск мутаций яДНК и мтДНК
На основании результатов клинического, молекулярно-генетического и цитологического анализа наследственных ОН был составлен алгоритм, который позволяет поставить правильный клинический диагноз, определить направление поиска генетического дефекта, вызвавшего заболевание, выявить наличие митохондриальнои патологии в случае редких неустановленных мутаций.
