Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1 Зубные и слюнные камни 9
1.1.1 Общие сведения 9
1.1.2 Морфология зубных и слюнных камней 9
1.1.3 Состав зубных и слюнных камней 12
1.1.3.1 Минеральный состав 12
1.1.3.2 Элементный состав 14
1.1.3.3 Органический состав 15
1.1.4 Гипотезы формирования зубных и слюнных камней 16
1.2 Состав камнеобразующей среды и ее роль в формировании зубных и слюнных камней 19
1.2.1 Ротовая жидкость 19
1.2.1.1 Минеральный состав 19
1.2.1.2 Органический состав 22
1.2.1.3 Структурные свойства 23
1.2.1.4 Отклонения от физиологических значений в составе слюны 24
1.2.1.5 Электролитные компоненты ротовой жидкости в условиях камнеобразования в полости рта 26
1.2.1.6 Морфологическая картина ротовой жидкости 27
1.2.2 Жидкая фаза зубного налета («plaque fluid») 28
1.3 Экзогенные и эндогенные факторы, влияющие на образование зубных и слюнных камней 31
2. Методическая часть 37
2.1. Методика проведения рентгенофазового анализа 37
2.2 Методика проведения ИК-спектроскопии 37
2.3 Методики определения элементного состава зубных, слюнных камней и ротовой жидкости 39
2.3.1 Методика рентгено-флуоресцентного анализа с применением синхротронного излучения 39
2.3.2 Методика количественного рентгеноспектрального микрозондового анализа (РСМА) петрографических шлифов 40
2.3.3 Методика атомно-эмиссионного спектрального анализа с индуктивно- связанной плазмой 40
2.4 Методика определения аминокислотного состава органической составляющей зубных, слюнных камней и ротовой жидкости 41
2.5 Методика проведения модельного эксперимента 43
2.5.1 Приготовление исходных растворов и проведение модельных экспериментов 43
2.5.2 Определение химического состава полученных твердых фаз и модельных растворов 45
3. Результаты определения состава зубных и слюнных камней. 47
3.1 Минеральный состав зубных и слюнных камней 47
3.1.1 Минеральный состав камней по данным РФА 47
3.1.2 Минеральный состав камней по данным ИК-спектроскопии 48
3.2 Элементный состав зубных и слюнных камней 52
3.2.1 Результаты атомно-эмиссионного спектрального анализа 52
3.2.2 Результаты рентгено-флуоресцентного анализа с синхротронным излучением 55
3.3 Аминокислотный состав органической составляющей зубных и слюнных камней 62
3.4 Установление корреляционных зависимостей между содержанием микроэлементов и аминокислот в составе камней 64
4. Результаты определения состава и свойств слюны. 69
4.1 Определение основных параметров ротовой жидкости в норме и в условиях камнеобразования в полости рта 69
4.2 Элементный состав ротовой жидкости по данным АЭС-ИСП 72
4.3 Аминокислотный состав органической составляющей слюны 77
4.4 Установление корреляционных зависимостей между содержанием микроэлементов и аминокислот в составе ротовой жидкости 80
4.5 Определение структурных свойств ротовой жидкости по типу микрокристаллизации 82
5. Термодинамическое моделирование процесса камнеобразования в ротовой полости человека 89
5.1 Расчет констант равновесия в системе осадок- раствор 89
5.2 Расчет возможности и условий образования малорастворимых соединений в системе, минеральный состав и рН которой аналогичны таковому для ротовой жидкости и жидкой фазы зубного налета 95
6. Экспериментальное моделирование процесса камнеобразования в ротовой полости человека 101
6.1 Результаты модельного эксперимента для состава ротовой жидкости и жидкой фазы зубного налета 101
6.2 Влияние добавок на процесс образования камней полости рта 104
6.2.1 Влияние добавок аминокислот 105
6.2.2 Влияние добавок белка (казеина) 110
6.2.3 Влияние добавок глюкозы 115
6.2.4 Влияние добавок мочевины 119
6.2.5 Моделирование минеральной компоненты зубного камня в присутствии ионов магния 121
6.3 Физико-химические условия формирования зубных камней и возможные механизмы их образования 124
Выводы 128
- Состав камнеобразующей среды и ее роль в формировании зубных и слюнных камней
- Методика количественного рентгеноспектрального микрозондового анализа (РСМА) петрографических шлифов
- Аминокислотный состав органической составляющей зубных и слюнных камней
- Определение структурных свойств ротовой жидкости по типу микрокристаллизации
Введение к работе
Изучение процесса патогенного минералообразования в организме человека является одной из актуальных научных проблем. В настоящее время установлено, что патогенные биоминералы могут образовываться во многих тканях и органах человека. Результатом патогенного минералообразования в ротовой полости являются зубные и слюнные камни.
Актуальность исследования. В последнее время разработка и совершенствование физико-химических основ изучения биоминералов, образующихся в организме человека, приобретает особо важное значение в связи с высоким ростом заболеваемости и, соответственно, необходимостью поисков новых методов профилактики, диагностики и лечения. С целью выявления причин и механизмов камнеобразования в ротовой полости человека возникает необходимость в детальном исследовании состава и строения органоминеральных образований (ОМА) с использованием современных физико-химических методов. Специфическая особенность подобных биоминералообразований, а именно участие в их строении как неорганического, так и органического веществ, требует использовать при их изучении методы различных наук: химии, минералогии, биохимии, медицины и др.
Накопление эмпирических данных, результатов анализа биологических систем и ОМА, а также развитие компьютерных методов описания физико-химических равновесий в многокомпонентных системах делают обоснованными попытки количественного моделирования процессов, имеющих место в прототипах биологических сред с целью выявления возможностей образования различных фаз и т.д. Поэтому одним из перспективных направлений изучения процессов патогенного минералообразования в организме человека является его теоретическое и экспериментальное моделирование, на основании которого можно предположить механизм образования, выявить факторы, влияющие на характер протекания данного процесса, а также предсказать поведение системы при изменении тех или иных параметров.
Целью работы является термодинамическое и экспериментальное моделирование процесса образования основных минеральных фаз зубных и слюнных камней на основе результатов комплексного изучения их состава и параметров камнеобразующей среды.
Для достижения поставленной цели были поставлены задачи:
• Изучить вещественный состав зубных и слюнных камней, выявить основные закономерности распределения микроэлементов и аминокислот в ОМА.
• Определить основные параметры ротовой жидкости, способствующие процессу камнеобразования в ротовой полости человека.
• Разработать термодинамическую модель, описывающую процесс кристаллизации основных минеральных фаз зубных и слюнных камней.
• Провести экспериментальное моделирование процесса образования ОМА и изучить влияние ряда добавок ротовой жидкости (органических и неорганических) на характер протекания данного процесса.
Научная новизна работы. На основании термодинамических расчетов определены условия образования основных минеральных фаз в ротовой жидкости и жидкой фазе зубного налета человека. Впервые проведено экспериментальное моделирование процесса образования зубного камня в лабораторных условиях. Установлено, что в условиях модельного эксперимента происходит формирование твердой фазы, представленной преимущественно слабо о кристаллизованным гидроксилапатитом с избытком кальция. Показано, что компоненты биологической жидкости по-разному влияют на процессы камнеобразования, протекающие в модельных системах: аминокислоты, белок (казеин) и ионы магния ингибируют процесс образования гидроксилапатита, причем наибольшим ингибирующим действием обладает казеин; глюкоза промотирует данный процесс; мочевина же в физиологических концентрациях замедляет процесс образования гидроксилапатита зубных камней человека, тогда как 10-кратное увеличение содержания мочевины в растворе способствует формированию стехиометрического гидроксилапатита.
Получены новые данные по вещественному составу зубных и слюнных камней человека и установлены следующие закономерности: результаты дискриминантного анализа подтверждают взаимосвязь между микроэлементным составом зубных и слюнных камней и регионом проживания пациентов; результаты кластерного анализа аминокислотного состава камней показали, что группы зубных и слюнных камней неоднородны по своему составу (отличаются по содержанию глутаминовой кислоты и серина, выявлены возрастные отличия). Показано существование обратной зависимости между суммарным содержанием аминокислот и фосфора в составе слюнных камней. Для ряда элементов Fe, Mn, Zn, Mo, Sr, Ni наблюдаются достоверно высокие значения коэффициентов корреляции с аминокислотами.
В результате выполненных исследований выявлены изменения, происходящие в составе ротовой жидкости, при образовании зубных камней. По данным дискриминантного анализа показано, что по содержанию 10 элементов в ротовой жидкости (Са, Р, Na, К, Mg, Zn, Си, Fe, Mn, Al) происходит разделение на четыре группы: с кариесом зубов, камнеобразованием в полости рта, с некрозом твердых тканей зуба и контрольная. Отмечены различия между контрольной группой и группой пациентов с зубными отложениями в полости рта. Установлено, что в условиях камнеобразования в полости рта повышается содержание цинка и железа, тогда как некроз твердых тканей зуба сопровождается заниженным относительно нормы содержанием всех изучаемых микроэлементов. Получены высокие значения коэффициентов корреляции ряда аминокислот с ионами Си, Zn, Fe и Mn при нормальном состоянии полости рта; отмечена положительная корреляция ионов кальция и фосфора с рядом аминокислот, что свидетельствует о существовании устойчивой коллоидной системы слюны. В условиях камнеобразования в полости рта установлена тенденция: нарушение структурных и минерализующих свойств слюны, обусловленное понижением содержания кальция и увеличением содержания аминокислот, приводит к образованию зубных камней. При сравнении зубных, слюнных камней и ротовой жидкости по содержанию аминокислот выявлены межгрупповые различия, подтвержденные результатами кластерного и дискриминантного анализов. Впервые предложен метод оценки фигур микрокристаллизации слюны для изучения ее структурных свойств.
Практическая значимость. Материалы данной работы важны для понимания механизмов образования зубных и слюнных камней, что расширяет возможности профилактики и ранней диагностики заболеваний полости рта. Полученные результаты широко используются в стоматологической практике на базе городской стоматологической поликлиники №1, а также на кафедрах клинической и терапевтической стоматологии ОмГМА г. Омска. Так, на основе изучения типа микрокристаллизации ротовой жидкости предложен новый способ определения уровня воздействия компьютерного излучения на состояние зубов (патент РФ № 2311639 от 31.03.2006). При исследовании параметров слюны в норме и при ряде заболеваний был разработан способ выявления гипертонической болезни и сахарного диабета на стоматологическом приеме (патент РФ № 2336803 от 02.05.2007). Предложенный способ моделирования процесса образования зубного камня (патента РФ № 2342713 от 09.04.2007) может быть использован на начальных этапах разработки новых медицинских препаратов для профилактики и лечения заболеваний полости рта.
На защиту выносятся следующие положения:
1. При комплексном изучении вещественного состава зубных и слюнных камней человека установлен фазовый, элементный и аминокислотный состав и показаны взаимосвязи между микроэлементным составом зубных и слюнных камней и регионом проживания пациентов; суммарным содержанием аминокислот и ионов фосфора в составе слюнных камней.
2. В условиях камнеобразования в полости рта происходит значительное отклонение параметров ротовой жидкости от нормы: сдвиг рН в щелочную сторону; уменьшение содержания ионов кальция и белка, при этом увеличение содержания ионов фосфора и электролитных компонентов, что является результатом нарушения структурных и минерализующих свойств слюны.
3. С помощью термодинамических расчетов получена последовательность образования основных минеральных фаз: Caio(P04)6F2 Саіо(Р04)б(ОН)2 Р Са3(Р04)2 Са4Н(Р04)3-2.5Н20 СаНР04-2Н20 а-Са3(Р04)2, при этом отмечена наибольшая стабильность апатита, основного компонента зубных и слюнных камней человека. Присутствие аминокислот и микроэлементов в физиологической концентрации не влияет на состав твердой фазы.
4. При экспериментальном моделировании установлено, что компоненты слюны играют важную роль в поддержании стабильности биологической жидкости, тем самым, могут, как препятствовать образованию ОМА полости рта (белки, аминокислоты, ионы магния), так и способствовать данному процессу (глюкоза, мочевина).
Апробация работы. Основные результаты работы опубликованы в 20 научных статьях, 4 авторских свидетельствах на изобретение, а таюке более чем в 70 тезисах на международных и всероссийских конференциях: международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), IV международной конференции по наукам о Земле (Новосибирск, 2008), XII международном симпозиуме «Проблемы геологии и освоения недр» (Томск, 2008), всероссийской конференции «Химия твердого тела и функциональные материалы» (Екатеринбург, 2008), международной научно-практической конференции «Биоминералогия - 2008» (Луцк, 2008), международной научной конференции «Федоровская сессия» (Санкт-Петербург, 2008), V международной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации» (Иваново, 2008), XX симпозиума «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), международном минералогическом семинаре «Структура и разнообразие минерального мира» (Сыктывкар, 2008), II международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии» (Астрахань, 2008), всероссийской конференции «Химия под знаком сигма» (Омск, 2007, 2008), XV международной конференции «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008), II международной конференции «Кристаллогенезис и минералогия» (Санкт-Петербург, 2007), III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), XVI международном совещании «Кристаллохимия и рентгенография минералов» (Миасс, 2007), международном симпозиуме «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень» (Санкт-Петербург, 2004, 2007), V Всероссийской конференции «Молодежь XXI века — будущее российской науки» (Ростов-на-Дону, 2007, 2008), IV международном семинаре «Минералогия и жизнь» (Сыктывкар, 2007), международной конференции «Спектроскопия и кристаллохимия минералов» (Екатеринбург, 2007), VI международной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Нанокристаллизация. Биокристаллизация» (Иваново, 2006), международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006-2008), Topical Meeting "Nanoparticles, nanostructures and nanocomposites" (Saint-Petersburg, 2006,2007), International Workshop "Biosphere Origin and Evolution" (Novosibirsk, 2005).
Объем и структура работы. Диссертация содержит 156 страниц текста, 55 рисунков, 45 таблиц, список литературы из 243 наименований. Она состоит из введения, 6 глав и заключения.
Исследования были частично поддержаны грантами «Молодых ученых» ОмГУ № 01.2007 05568, программами УМНИК № 6325р/8775 и № 8773, а также Федеральной целевой научно-технической программой № 202.
Состав камнеобразующей среды и ее роль в формировании зубных и слюнных камней
Слюна - это жидкость, продуцируемая специализированными железами: околоушной слюнной железой (ОУСЖ), подчелюстной (ПЧСЖ), подъязычной (ПЯСЖ), открывающимися своими протоками в полость рта. Слюна образуется в результате энергозависимых процессов и по своим свойствам резко отличается от ультрафильтрата плазмы. Из больших слюнных желез ПЧСЖ выделяет около 70 %, ОУСЖ - 25%, ПЯСЖ - 3 4 %, малые слюнные железы - 1-2 % слюны. Эти цифры могут колебаться в зависимости от стимуляции и других факторов [60]. Следует уточнить, что в полости рта находится не чистый секрет слюнных желез, а биологическая жидкость, часто называемая ротовой жидкостью. Она представляет собой суммарный секрет всех слюнных желез, включающий также микрофлору полости рта, содержимое десневых карманов, десневую жидкость, продукты жизнедеятельности микрофлоры мягкого зубного налета, распада мигрирующих из слизистой оболочки и выделившихся со слюной лейкоцитов, остатки пищевых продуктов т.д. [61]. Часто понятия слюна и ротовая жидкость используются как синонимы. Ротовая жидкость представляет собой водный раствор органических и минеральных веществ (0,58%, из них 0,22% - неорганические вещества). На долю воды приходится 99,42% [62]. Неорганические компоненты слюны представлены макро- и микроэлементами (Н, К, Na, Са, Mg, Fe, Си, Р, S, CI, F и др.). Они могут находиться в ротовой жидкости как в ионизированной форме в виде простых (Н+, К+, Na+, Са2+, СГ и др.) и сложных (Н2Р04", НР042", Р043", НСОз", S042" и др.) ионов, так и в составе органических соединений - белки, белковые соли, хелаты и т.д. [63]. Минеральный состав ротовой жидкости достаточно хорошо изучен [10, 62 -73] (табл. 3). Данные разных авторов по содержанию основных минеральных компонентов в ротовой жидкости не противоречат друг другу (табл. 3), тогда как данные по составу чистых секретов слюнных желез немногочисленны и противоречивы (табл. 2).
Следует отметить, что практически отсутствуют данные о содержании микроэлементов в ротовой жидкости в «норме». Так, Л.Д. Гожая [73] определяла содержание Fe, Си и Мп в слюне человека в «норме» и при кариесе зубов. Статистическая обработка результатов, полученных при обследовании слюны здоровых людей, имеющих интактный зубной ряд, позволили принять за норму следующее содержание в мг/л для Fe - 0,11-0,19; Си - 0,007-0,018; Мп - 0,009-0,017. Ряд авторов приводят сведения о содержании элементов в слюне при некоторых стоматологических заболеваниях [74-79], заболеваниях слюнных желез [64] и т.д. М.В. Галиулина и др. [74 - 78] изучали изменение структурных свойств ротовой жидкости при кариесе зубов. Э.М. Гильмияров [79] рассматривал изменения слюны при частичной неполноте зубных рядов, а также при локальных очагах воспаления в полости рта и респираторных заболеваниях. Автором этой работы впервые обоснована концепция, показывающая роль соматической патологии, нарушений гомеостаза полости рта в развитии стоматологических заболеваний. Таким образом, минеральный состав ротовой жидкости достаточно хорошо изучен. Однако представляет интерес содержание макро- и микроэлементов в слюне человека в норме, а также в условиях камнеобразования в полости рта, и в особенности сравнение состава камней полости рта и среды их формирования для выявления факторов, способствующих данному процессу. Важным, на наш взгляд, является региональный аспект, а именно содержание элементов в ротовой жидкости жителей Омского региона в зависимости от ряда экологических факторов. Из органических веществ в слюне обнаружены простые (альбумины, глобулины) и сложные (гликопротеиды) белки и небелковые азотсодержащие компоненты - аминокислоты, мочевина и др., а также моносахариды и продукты их превращения - пировиноградная, лимонная и уксусная кислоты [61, 64 - 72, 80 - 82]. Н. Хи [83] идентифицировал в составе ротовой жидкости 437 белков. В.Л. Чернигиным [84] получены данные о наличии представителей всех основных классов липидов в ротовой жидкости, что свидетельствует о необходимости этих компонентов для обеспечения обменных процессов полости рта, установлена взаимосвязь между обменом липидов ротовой жидкости и активностью кариозного процесса. Аминокислотный состав ротовой жидкости вызывает особый интерес исследователей [10, 85 - 94], т.к. отклонения в содержании свободных аминокислот могут нарушать структурные свойства слюны и создавать неблагоприятные условия в полости рта и способствовать разрушению эмали. В.А. Храмов [85] количественно определил суммарное содержание аминокислот, а также иминодиазолсодержащих метаболитов в образцах ротовой жидкости здоровых и больных людей. Автор предположил, что уровень аминоазота в смешанной слюне будет коррелировать с количеством микроорганизмов в ротовой жидкости и их активностью. Л.А. Моисейцева [86] показала, что не наблюдается качественных различий в аминокислотном составе в зависимости от возраста и вида слюны, а также у людей со здоровыми зубами и при множественном кариесе.
В то же время при количественном анализе выявлены отчетливо выраженные изменения в содержании отдельных аминокислот. Выявлено статистически достоверное увеличение уровня таких аминокислот, как цистин, аргинин, серии, глутаминовая кислота и триптофан при кариесе, а также тенденция к уменьшению содержания тирозина, валина и метионина. По данным Б.С. Ван Уаукхаус [89] и Л. Враник [90], уровень содержания аргинина и лизина у здоровых людей выше, чем при кариесе зубов. При изучении влияния заболеваний пародонта на аминокислотный состав ротовой жидкости СМ. Сирайнен [91, 94] установил достоверное повышение концентрации глицина, пролина и тирозина по сравнению с контрольной группой. Слюна содержит антибактериальные компоненты [95], различные антиоксидантні, в том числе мочевую кислоту и глютатион [96 - 98]. При анализе литературных данных выявлен несомненный интерес исследователей к органической составляющей ротовой жидкости человека. При этом отсутствуют литературные данные о содержании аминокислот в слюне в условиях камнеобразования в полости рта, что, несомненно, является важным для понимания механизма процесса. Следует также отметить, что неизученным до настоящего времени остается вопрос о взаимосвязи между аминокислотным и микроэлементным составом ротовой жидкости в норме и при наличии зубных и слюнных камней. В последнее время возникли новые представления о структуре слюны и механизме ее воздействия на органы полости рта [61, 63, 74]. Минерализующая функция ротовой жидкости определяется, прежде всего, величиной рН и содержанием ионов Са2+ и НР042". По данным М.В. Галиулиной [77], рН слюны - главный естественный регулятор гомеостаза минеральных компонентов и равновесного состояния эмали. В.К. Леонтьев [63] установил, что минерализующая функция ротовой жидкости осуществляется вследствие ее пересыщенности ионами Са и НРО4 ". Основной механизм поддержания пересыщенности слюны этими ионами - в их мицеллярном состоянии. Ядро мицеллы состоит из Саз(Р04)2, потенциалопределяющие ионы - НР04 ", противоионы - Са" , они же входят в состав диффузного слоя. Мицеллы Саз(Р04)2 являются структурными единицами ротовой жидкости, минерализующая функция которой зависит от их устойчивости. В ротовой жидкости мицеллы защищены от агрегации в основном гликопротеидом муцином, который в силу своей высокой поверхностной активности способен адсорбироваться на коллоидных частицах, проявляя защитное действие.
Методика количественного рентгеноспектрального микрозондового анализа (РСМА) петрографических шлифов
Для изучения распределения элементов К, Na, Са, Р, S, Mg, CI, Si, F от центра к периферии в представленных слюнных камнях использовался метод количественного рентгеноспектрального микрозондового анализа петрографических шлифов. Определение элементов проводили на микроанализаторе «Camebax-Micro» (лаборатория рентгеноспектрального анализа Аналитического центра ОИГГиМ СО РАН г.Новосибирска). Для анализа изготавливались двусторонние полированные прозрачные шлифы на эпоксидной смоле толщиной 0,04 см. Анализ проводился по универсальной программе RMA-92 [185]. Оптимальные параметры съемки: ускоряющее напряжение 20 кВ, ток поглощенных электронов 40 нА, угол отбора 40, время счета 10 сек. на каждой аналитической линии, диаметр зонда 2-3 мкм. Стандартами служили однородные природные и синтетические минералы подобного образцам состава (прил. 1, табл. 2). В процессе расчета концентраций методом PAP (Pouchou, Pichoir, 1985) учитывалось наложение на аналитическую линию Рка линии CaKpi, а также взаимные наложения линий TiKa и BaLtx. Погрешность определений всех компонентов находилась в пределах 2 отн.%, за исключением F, погрешность определения которого при концентрациях 0,1-2,0 масс.% составляла 2-3 отн.%, а при более низких содержаниях элемента возрастала до 5 отн.%. 2.3.3 Методика атомно-эмиссионного спектрального анализа с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП) Количественное определение содержания элементов К, Са, Na, Р, Mg, Fe, Си, Mn, Zn, Ni в образцах слюнных камней было проведено методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (Optima 2000 DV, Perkin Elmer [186, 187]). Минерализацию пробы проводят в микроволновой печи. Рабочий стандартный раствор с концентрацией 10 - 50 мг/л (в зависимости от концентрации определяемых элементов в анализируемом продукте) приготавливают путем соответствующего разбавления стандартного одноэлементного или многоэлементного раствора с аттестованным значением содержания элементов. Градуировку спектрометра проводят перед началом измерения подготовленных проб.
Определение градуировочной характеристики и обработка результатов проводятся с использованием программного обеспечения прибора. Рекомендуемые режимы проведения измерений приведены в прил. 1 (табл. 3). Определение элементного анализа слюны проводят по ГОСТ Р 51309-99 [188]. Основной градуировочный раствор смеси элементов готовят из соответствующих ГСО элементов в соответствии с инструкцией по применению ГСО. В 1 см3 основного градуировочного раствора содержится 50 мкг соответствующего элемента. Контрольный раствор выбирается из серии градуировочных растворов в зависимости от ожидаемой массовой концентрации анализируемых проб. В качестве контрольного раствора рекомендуется раствор с массовой концентрацией элементов 0,05-10 мг/дм3. Результаты измерения массовой концентрации металлов в анализируемых пробах представляется в виде: где С - массовая концентрация элемента в пробе, мг/дм ; А - абсолютная погрешность определения массовой концентрации элемента, мг/дм ; при Р=0,95. Значение А рассчитывается по формуле: где 8 - доверительные границы погрешности определения элементов (см. прил. 1,табл. 4). Чувствительность метода составляла 10 8 - 10"2 масс.% для различных элементов [189], погрешность определений всех элементов находилась в пределах 3-7 отн.%. 2.4 Методика определения аминокислотного состава органической составляющей зубных, слюнных камней и ротовой жидкости Сущность методики заключается в кислотном гидролизе пептидных связей белка по методу Мура и Штейна с последующим определением аминокислотного состава гидролизата методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии [190, 191]. Для проведения измерений использовали хроматограф жидкостный Series 200 (Perkin Elmer) с флуоресцентным детектором (диапазон длин волн возбуждения от 200 до 850 нм, диапазон длин волн эмиссии от 250 до 900 нм, точность установки длины волны ±4 нм, относительное СКО выходного сигнала — не более 1,5%) и автодозатором (точность не хуже 0,5% СКО по площади пика). Хроматографический анализ проводят в следующих условиях: колонка - pecosphere 3x3 СІ8 (33x4.6 мм, 3 мкм), подвижная фаза: метанол и 1,5% ТГФ в растворе ацетата натрия с концентрацией 50 ммоль/л (рН=5.9); скорость подвижной фазы - 2.5 мл/мин. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений d и между результатами, полученными в разных условиях D, при доверительной вероятности Р=0,95 не должны превышать соответственно 10 и 25%.
Предел обнаружения при определении аминокислотного состава органической неминеральной составляющей составляет 10"4 масс.%, относительное стандартное отклонение 0,04. экспериментов При проведении эксперимента использовались значения диапазона концентраций основных неорганических компонентов и рН слюны и жидкой фазы зубного налета («plaque fluid») здорового взрослого среднестатистического человека. Концентрации катионов и анионов в различных сериях экспериментов отвечало их минимальному, среднему и максимальному значениям диапазона данного показателя характерного для состава биологической жидкости (табл. 6). При этом изучалось поведение систем при температуре 37.0±0.5С и четырех значениях рН: 5.50±0.05, 6.00±0.05, 7.00±0.05 и 8.00±0.05. В качестве исходных реагентов использовались соли марки ч.д.а и х.ч. и бидистиллированная вода. Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определялись таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к данным параметрам моделируемой системы. Для каждой серии экспериментов были приготовлены растворы, содержащие катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения. После смешения эквивалентных объемов растворов производили корректировку значений рН путем добавления 6М раствора NaOH. С целью предотвращения уменьшения концентрации в растворе карбонат ионов (за счет гидролиза в кислой среде) необходимое количество NaHC03 добавляли при рН 5.5 - 6.0. После корректировки рН моделируемого раствора до необходимого значения, добавляли определенную массу кристаллического NaCl, рассчитанную таким образом, чтобы ионная сила раствора была по-возможности максимально приближена к моделируемой системе. Готовый раствор сливали в стакан, подвешивали зуб и оставляли для кристаллизации на время 7-360 дней при температуре 37.0±0.5 С (рис. 6).
Аминокислотный состав органической составляющей зубных и слюнных камней
Исследование коллекции зубных и слюнных камней позволило определить количественное содержание 15 аминокислот. Как видно из приведенных данных (табл. 11), качественный набор аминокислот во всех случаях одинаков. камней Кластер №1 (образцы 1, 4, 5 и 7) в среднем содержит 10,5 масс.% аминокислот и характеризуется преобладанием глутаминовой кислоты (3:1). Такое же соотношение аминокислот характерно и для кластера №2 (образцы 2, 3 и 6), однако, среднее содержание здесь значительно ниже - 4,79 масс.%. При этом наблюдаются возрастные отличия: средний возраст пациентов кластера №1 составляет 47 лет, кластера №2 - 35 лет, это позволяет предположить, что в молодом возрасте в организме быстрее протекают процессы минерализации. Для кластера №3 (образцы 8-11) среднее содержание аминокислот составляет 6,6 масс.%, в составе образцов преобладает серии (1:1,3), что может свидетельствовать о разных условиях формирования соответствующих ОМА Сравнение ряда средних содержаний аминокислот в зубных и слюнных камнях: Зубные камни: Глуталшновая кислота серии станин глицин аспарагин лизин фенилаланин валин лейцин треонин изолейцин гистидин аргинин тирозин метионин Слюнные камни: Глуталшновая кислота серин фенилаланин лизин аргинин аспарагин тирозин лещин глицин валин станин гистидин изолейцин треонин метионин показало, что в обоих случаях преобладают глутаминовая кислота и серин. Высокое содержание в полученных рядах глутаминовой кислоты и лизина можно объяснить адсорбционным взаимодействием с гидроксилапатитом за счет наличия в их составе дополнительных боковых аминогрупп, тогда как серина и тирозина - за счет гидроксильных групп в молекуле аминокислоты. 3.4 Установление корреляционных зависимостей между содержанием микроэлементов и аминокислот в составе зубных и слюнных камней По результатам определения количественного содержания аминокислот и микроэлементов в зубных и слюнных камнях был проведен корреляционный анализ, при этом предполагалось наличие следующих линейных корреляционных зависимостей: зависимость суммарного содержания аминокислот от содержания химического элемента в камне; зависимость содержания отдельной аминокислоты от содержания химического элемента в камне.
Результаты корреляционного анализа приведены в табл. 13-15. Анализируя полученные данные (табл. 13), можно отметить существование обратной зависимости между суммарным содержанием аминокислот и фосфора в составе слюнных камней, что можно объяснить конкуренцией за ионы кальция в процессе формирования и роста камня. Особенно велика в этом процессе роль гистидина (табл. 14), поскольку, благодаря электронодонорным группам в боковой цепи, он является одним из наиболее сильных комплексообразующих реагентов среди аминокислот крови и слюны [204 - 208]. Следует также отметить достаточно высокие значения коэффициентов корреляции калия, натрия и магния с рядом аминокислот, что может быть результатом адсорбционного взаимодействия положительно заряженных ионов и анионных форм аминокислот в процессе формирования и роста камня. Исходя из предположения о мицеллярном строении слюны, ионы калия, натрия и магния могут входить в состав диффузного слоя мицелл и при достижении концентраций, превышающих пределы физиологических норм, способствовать переходу ионов диффузного слоя в адсорбционный и исчезновению диффузного слоя. Такие мицеллы теряют устойчивость и коагулируют, а ионы калия, натрия и магния входят в состав ОМА. В табл. 15 приведены коэффициенты корреляции между содержанием отдельных аминокислот и микроэлементов в зубных и слюнных камнях. Для ряда элементов Fe, Mn, Zn, Mo, Sr, Ni наблюдаются достоверно высокие значения коэффициентов корреляции, что указывает на их сродство с отдельными аминокислотами. Полученные результаты согласуются с литературными данными, в качестве примера можно привести значения ступенчатых констант устойчивости хелатных комплексов меди с глицином (pKi=8,l, рКі 2=15,2). Известно, что элементы присутствуют в крови и слюне человека в связанном с аминокислотами и белками виде [209], что согласуется с полученными нами результатами. Необходимо также отметить достаточно высокое значение коэффициента корреляции между содержанием аминокислот и содержанием селена в зубных камнях. Прямая зависимость также наблюдается между содержанием аминокислот и брома в зубных камнях, что указывает на определенное сродство брома и селена с органической составляющей белковой природы. На основании приведенных экспериментальных данных для коллекции зубных и слюнных камней жителей Омского региона можно выделить следующие закономерности: Минеральная составляющая зубных и слюнных камней представлена плохо окристаллизованным Са-дефицитным (по данным АЭС-ИСП) карбонат-гидроксилапатитом. Фазовый состав зубных и слюнных камней примерно одинаков и близок составу эмали и дентина зубов человека. Улучшение окристаллизованности гидроксилапатита в ряду эмаль дентин зубные камни слюнные камни можно объяснить увеличением в этом ряду содержания органических веществ. Установлено, что микроэлементный состав зубных и слюнных камней имеет определенные региональные особенности.
Так, в образцах Омской коллекции содержится больше титана, меди и циркония, чем в образцах коллекций Новосибирска, Владивостока и Москвы, а также практически отсутствуют селен и йод, что обусловлено спецификой соответствующего региона. Показано, что элементный состав камня меняется при переходе от центра к периферии. Это позволяет предположить, что в процессе формирования патогенных органоминеральных образований челюстно-лицевой сферы заметно меняются условия среды кристаллизации слагающих их соединений. В составе органической составляющей исследуемых образцов зубных и слюнных камней выявлено 15 аминокислот. Их суммарное содержание в слюнных камнях выше, чем в зубных; в обоих случаях преобладают глутаминовая кислота и серии. По результатам кластерного анализа показано, что группы зубных и слюнных камней неоднородны по своему составу (отличаются по содержанию глутаминовой кислоты и серина, имеются возрастные отличия). Отмечено существование обратной зависимости между суммарным содержанием аминокислот и фосфора в составе слюнных камней. Для ряда элементов наблюдаются достоверно высокие значения коэффициентов корреляции, что указывает на их сродство к отдельным аминокислотам, причиной которого, на наш взгляд, является образование устойчивых комплексных соединений, а также адсорбционное взаимодействие аминокислот с гидроксилапатитом в процессе роста патогенного образования. Ряд авторов указывают на важную роль слюны в образовании зубных и слюнных камней [51, 63, 74, 77]. Процесс камнеобразования в полости рта начинается с нарушений в минералообразующих средах. Изменение концентрации ионов Са2+, Mg2+, К+, СГ, а также недостаточный синтез защитных белков или нарушение их структуры превращают среду в кинетически нестабильную, что вызывает понижение агрегативной устойчивости ротовой жидкости. Для установления роли ротовой жидкости в образовании зубного камня проведены исследования слюны лиц с зубными отложениями (42 пациента) и здоровых, выбранных в качестве контрольной группы (47 человек). Группа пациентов с зубными отложениями была разбита на две подгруппы: 11 пациентов с камнеобразованием в полости рта без каких-либо других стоматологических и иных заболеваний (группа №2) и 31 пациент, принимающие сердечные лекарственные препараты (группа №1) (табл. 16).
Определение структурных свойств ротовой жидкости по типу микрокристаллизации
При ряде заболеваний полости рта может не наблюдаться существенных отклонений состава слюны от нормы, но происходит нарушение структурных свойств [107-116, 212, 213], что способствует возникновению и течению того или иного заболевания. Подобное нарушение структурных свойств происходит, например, под воздействием электромагнитного излучения [214, 215]. Для определения воздействия компьютерного излучения на слюну (возможности использования МКС в качестве диагностического параметра) были проведены следующие исследования [216]. Материалом исследования служила слюна кариесрезистентных лиц в возрасте (18-21 г.). В эксперименте слюну делили на 5 порций. Первая порция служила для фоновых показателей слюны. Вторую порцию оставляли при комнатной температуре, чтобы исключить влияние времени и температуры на состав слюны. Третью, четвертую и пятую порции слюны помещали в закрытых пробирках в разных местах компьютера на 7 часов (табл. 23). Затем образцы высушивали и определяли тип МКС. В порциях слюны, размещенных в разных местах компьютеров, происходит достоверное, по сравнению с исходной порцией слюны (рис. 30), разрушение кристаллических структур (рис. 31-33). В порциях слюны, оставленной при комнатной температуре на 7 часов, достоверных различий с исходной порцией не наблюдается. Таким образом, достоверно доказано, что компьютерное излучение при воздействии даже в течение 7 часов очень сильно изменяет картину микрокристаллизации слюны и, следовательно, эту биологическую жидкость можно использовать для диагностических целей. В ходе дальнейшего исследования были выделены две группы людей: 1) группа 1 - люди, чья профессиональная деятельность была связана с работой на персональном компьютере. Стаж работы по специальности составлял от пяти до десяти лет, средняя продолжительность времени, проводимого у экрана монитора -восемь часов в сутки и более, при этом люди регулярно обращаются к стоматологу с диагнозом множественный кариес зубов.
Исследована слюна 80 человек (63,0 %) без заболеваний ЖКТ, способных повлиять на результаты микрокристаллизации слюны. Результаты клинического обследования выявили нарушения состояния твёрдых тканей зубов кариозного и некариозного происхождения [216]. 2) контрольная группа - 47 человек (27,0 %). Взятую в качестве сравнения группу лиц, резистентных к заболеваниям, составили люди с одинаковым соматическим статусом «практически здоровые», а также без заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта. Для определения типа микрокристаллизации слюны использовались методики Леуса П.А. [217], Пузиковой О.Ю. [109]. При микроскопическом исследовании было обнаружено, что кристаллический узор неравномерен и неодинаков в различных участках (зонах) высушенной капли. В препарате можно различить три зоны: центральную, промежуточную и периферическую. Наиболее «благоприятный» рост в центре капли: там образуются типичные дендритные кристаллы в виде «папоротника», которые растут не только по плоскости, но и в объеме. Участок со структурами папоротника можно считать зоной свободного роста. Следовательно, оценку морфологии кристаллограммы можно проводить только в центре кристаллизации. А кристаллы, образовавшиеся по периферии, необходимо относить к «аномальным» (неправильным), так как они сформировались в неоптимальных условиях. Для результатов микрокристаллизации ротовой жидкости Рис. 34 МКС (4 балла) Рис. 35 МКС (3 балла) кариесрезистентных лиц характерен чёткий рисунок крупных удлинённых кристаллопризматических структур, идущих от центра капли, сросшихся между собой и имеющих древовидную или папоротникообразную форму (картина соответствует 5 баллам, рис. 30). При оценке результатов микрокристаллизации ротовой жидкости лиц, работающих с электромагнитным излучением, отмечается Выявляются следующие типы: рисунок крупных удлинённых кристаллопризматических структур, сросшихся между собой в произвольном порядке (4 балла, рис. 34); в центре капли видны отдельные кристаллы звёздчатой формы, по периферии сохранены укрупнённые древовидные кристаллы (3 балла, рис. 35); отдельные кристаллы в виде прута или веточки, расположенные по всему полю (2 балла, рис. 36); по всей площади капли большое количество изометрически расположенных кристаллических структур, звёздчатой, округлой и неправильной формы (1 балл, рис. 37); полное отсутствие кристаллов в поле зрения (0 баллов, рис. 31). При оценке фигур кристаллизации с помощью методов математической статистики также наблюдаются достоверные различия между группами, что подтверждено данными дискриминантного анализа (рис. 38). Согласно данным табл. 25 и 26, распространенность и интенсивность кариеса увеличивается с возрастом и стажем работы на ПК. I степень активности кариеса (КПУ 9) выявлена только в одной группе пациентов со стажем работы 2-3 года, III степень активности кариеса характерна для IV возрастной группы (КПУ 16). Остальные группы характеризуются средним уровнем резистентности зубов к кариесу.
Объяснение связи между электромагнитными полями и болезнями основано на том, что все биохимические процессы в клетках, так или иначе, зависят от электрохимических свойств участвующих в них молекул и ионов. Тем не менее, более точные механизмы этой связи не выяснены. Ряд авторов утверждают, что электромагнитное излучение приводит к некрозу твердых тканей зубов. Это состояние обозначается как «компьютерный некроз зубов» [218, 219]. Поражение твердых тканей зубов авторы связывают как с непосредственным воздействием излучения, так и с нарушением минерального и белкового обмена в организме, с изменением состава слюны и функционального состояния физиологических систем. Следует отметить, что изучение электролитного состава исследуемых образцов слюны существенных отличий не выявило (табл. 27). Таким образом, заболевания полости рта, в том числе и камнеобразование, возникают не только вследствие изменений состава ротовой жидкости, но и в результате нарушения ее структурных свойств, что может быть охарактеризовано с помощью типа микрокристаллизации слюны. На основании приведенных экспериментальных данных можно выделить изменения, происходящие в ротовой жидкости в условиях камнеобразования в полости рта: В условиях камнеобразования в полости рта происходит сдвиг рН в щелочную сторону, что создает благоприятные условия для образования гидроксилапатита. При образовании зубных камней в ротовой жидкости уменьшается содержание ионов кальция, но увеличивается содержание фосфора и электролитных компонентов - ионов натрия и калия. Наблюдается снижение содержания белка в ротовой жидкости пациентов с зубными камнями, что свидетельствует о нарушении структурных свойств слюны. По данным дискриминантного анализа показано, что по содержанию 10 элементов в ротовой жидкости (Са, Р, Na, К, Mg, Zn, Си, Fe, Mn, Al) происходит разделение на четыре группы: с кариесом зубов, камнеобразованием в полости рта, с некрозом твердых тканей зуба и контрольная. Установлено, что в условиях камнеобразования в полости рта повышается содержание цинка и железа. Установлено, что в условиях камнеобразования в ротовой полости происходит изменение аминокислотного состава слюны; наблюдается как увеличение содержания индивидуальных аминокислот, так и их суммарное количество.
