Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления о значении полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов в прогрессировании хронического гломерулонефрита 11
1.1. Роль основных компонентов РААС в прогрессировании заболеваний почек... 11
1.1.1. Ангиотензин П как фактор прогрессирования нефропатий 11
1.1.2. Ангиотензинпревращающий фермент... 14
1.1.3. Альдостерон - новый фактор прогрессирования гломерулосклероза.
1.2. Полиморфные маркеры генов-кандидатов РААС 19
1.2.1. Ген ангиотензинпревращающего фермента 19
1.2.2. Ген синтетазы альдостерона 24
1.3. Комплексный подход к оценке вклада полиморфных маркеров РААС в течение хронических заболеваний почек
1.4. Полиморфные маркеры системы оксида азота эндотелием 25
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
II.1. Характеристика обследованных больных 31
II.2. Характеристика контрольной группы 36
II.З. Общеклиническое обследование 37
II.4. Морфологическое исследование биоптата почки 38
II.5. Идентификация аллелей полиморфных маркеров генов АСЕ
38
II.6. Статистический анализ 40
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
III.1. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP1B2 NOS3 с развитием ХГН 42
III.2. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и 44
0S3 с клиническими особенностями ХГН
III.2.1. Характеристика клинических особенностей дебюта ХГН в зави симости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP1IB2 и 44
NOS3
III.2.2. Характеристика клинических вариантов ХГН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
III.2.3. Характеристика морфологических вариантов ХГН в зависимоста от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
III.2.3.L Ассоциация полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 с характером морфологических изменений и клинико-лабораторными показателями у больных МПГН
III.2.4. Характеристика особенностей течения ХГН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11В2 и NOS3
III.З. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 со скоростью прогрессирования ХГН
III.З 1. Длительность ХГН до наступления ТПН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11В2 и NOS3
III.3.2. Оценка почечной выживаемости в зависимости от генотипа по
лиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3: моно- и многофакторный анализ
III.4. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 с эффективностью терапии ингибиторами АПФ
III.4.1. Оценка антигипертензивного эффекта ингибиторов АПФ в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
Ш.4.2. Оценка антипротеинурического эффекта ингибиторов АПФ в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP1JB2 uNOS3
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 87 с генетической предрасположенностью к развитию ХГН
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
с особенностями клинической картины в течение ХГН 89
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
с прогрессированием ХГН 95
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3
с эффективностью терапии ингибиторами АПФ 99
ВЫВОДЫ 104
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
- Роль основных компонентов РААС в прогрессировании заболеваний почек...
- Идентификация аллелей полиморфных маркеров генов АСЕ
- Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP1B2 NOS3 с развитием ХГН
- Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 87 с генетической предрасположенностью к развитию ХГН
Введение к работе
Прогрессирование хронических заболеваний почек и поиск способов его торможения остается одной из наиболее актуальных проблем нефрологии.
В настоящее время для изучения роли наследственных факторов в развитии полигенных заболеваний часто используется подход, основанный на исследовании полиморфных маркеров генов-кандидатов. В нефрологии в качестве генов-кандидатов, продукты экспрессии которых могут обусловливать скорость прогрессирования почечной недостаточности, рассматривают в первую очередь гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и системы синтеза оксида азота (N0) эндотелием, которые, регулируя системную и внутрипочечную гемодинамику, а также стимулируя гипертрофию и гиперплазию мезангиальных клеток и синтез ими межклеточного мат-рикса, участвуют в развитии нефросклероза.
Из генов-кандидатов РААС наиболее известен ген ангиотензинпревра-щающего фермента (АСЕ). Для него описан полиморфизм типа «вставка/отсутствие вставки» в 16 интроне. Показано, что данный полиморфизм ассоциирован с уровнем ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) в плазме [133]. В связи этим было высказано предположение, что аллель Д у носителей которого наблюдается повышенный уровень АПФ, является фактором риска поражения сердечно-сосудистой системы. Это предположение подтвердилось в исследованиях R. Zee и соавт. [185], Н. Shunkert и соавт. [145], Е. Ludwig и со-авт. [91], выявивших ассоциацию данного полиморфного маркера с артериальной гипертонией (АГ), гипертрофией левого желудочка и возникновением инфаркта миокарда. В то же время данные об ассоциации полиморфизма гена АСЕ с хроническими заболеваниями почек неоднозначны. Кроме того, остается открытым вопрос об ассоциации данного полиморфного маркера с эффективностью терапии ингибиторами АПФ. Несмотря на выявленную несколько лет назад в исследовании REIN ассоциацию между носительством аллеля D и лучшим ренопротективным ответом на терапию ингибиторами АПФ, существование целого ряда работ [106, 166, 167], свидетельствующих об отсутствии по-
7 добной связи или даже худшем ответе на терапию у гомозигот DD, требует проведения дальнейших исследований.
В последние годы появились работы, указывающие на то, что альдостерон, помимо регулирования баланса воды и электролитов, вызывает ряд патологических изменений со стороны сердечно-сосудистой системы, а также способствует развитию гломерулосклероза независимо от действия ангиотензина П. Это повлекло за собой активное изучение гена синтетазы альдостерона (CYP11B2\ в котором был обнаружен полиморфизм типа С(-344) Т. Выявлена ассоциация аллеля С гена CYP11B2 с повышенным уровнем альдостерона плазмы и с АГ, с высоким значением отношения уровня альдостерона плазмы к активности ренина плазмы, а также с увеличением размера левого желудочка и нарушением его диастолической функции [46, 86]. Ассоциация данного полиморфного маркера с течением заболеваний почек к настоящему времени крайне мало изучена: имеются лишь единичные работы, противоречивые результаты которых не позволяют сделать каких-либо определенных выводов.
Кроме того, практически не изучена ассоциация с прогрессированием нефропатий полиморфного маркера 4а/4Ь гена эндотелиальной синтетазы оксида азота (NOS3). Обнаруженная связь этого полиморфного маркера с уровнем нитратов и нитритов в плазме крови (у лиц с генотипом 4а/4а средний уровень этих соединений на 20% ниже, чем у носителей аллеля 4Ь) [162], позволяет говорить о генетическом контроле уровня оксида азота в плазме, а значит, и о возможной ассоциации данного полиморфного маркера с заболеваниями, сопровождающимися поражением эндотелия и развитием АГ.
В связи с этим, ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ было:
Изучить связь полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов с развитием, течением и прогрессированием хронического гломерулонефрита.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Исследовать ассоциацию полиморфных маркеров I/D гена ангиотензин-превращающего фермента {АСЕ), С(-344)Т гена синтетазы альдостерона
8 (CYP11B2) и 4a/4b гена эндотелиальной синтетазы оксида азота (NOS3) с генетической предрасположенностью к возникновению ХГН.
2. Проанализировать клинические особенности хронического гломеруло- нефрита (ХГН) в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов ACE,CYPllB2nNOS3:
Исследовать особенности дебюта ХГН.
Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 с клиническими вариантами ХГН.
Изучить ассоциацию данных полиморфных маркеров с морфологическими вариантами ХГН.
Выявить особенности течения ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3.
Оценить скорость прогрессирования ХГН в зависимости генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3.
Оценить эффективность терапии ингибиторами АПФ у больных ХГН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3:
Оценить антигипертензиный и антипротеинурический ответ на тера пию ингибиторами АПФ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые на большом клиническом материале исследована ассоциация полиморфных маркеров I/D гена АСЕ, С(-344)Т гена CYP11B2 и 4а/4Ь гена NOS3 с предрасположенностью к развитию ХГН.
Впервые у больных с первичным ХГН изучена ассоциация полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 с особенностями клинической картины ХГН в дебюте и в течение заболевания.
Впервые установлено, что носительство сочетания аллеля D теш АСЕ, аллеля С гена CYP11B2 и аллеля 4а гена NOS3 является фактором неблагоприятного прогноза ХГН.
9 Впервые продемонстрирована ассоциация полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 с выраженностью антигипертензивного и антипротеи-нурического ответа на терапию ингибиторами АПФ.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты проведенного исследования позволяют разработать дополнительные критерии для выделения групп больных ХГН с повьппенным риском прогрессирования почечной недостаточности, а также уточнить показания для назначения препаратов, блокирующих РААС.
Роль основных компонентов РААС в прогрессировании заболеваний почек
До недавнего времени РААС рассматривали как циркулирующую гормональную систему, которая играет ключевую роль в регуляции водно-электролитного обмена, а также в поддержании сосудистого тонуса [87]. Однако обнаружение ее компонентов в различных органах/тканях позволило говорить о наличии локальных РААС, функционирующих на интракринном, пара-кринном и аутокринном уровнях независимо от циркулирующей РААС [39, 51,52,59,79,80,107,109].
Установлено, что тканевые РААС играют важную роль в обеспечении как физиологических, так и патологических процессов. Так, локально-почечная РААС выполняет множество важных функций на этапе формирования почки в эмбриональном периоде [55, 163, 175, 176], а активация данной системы, возникающая в результате целого ряда заболеваний и, в том числе, при хроническом гломерулонефрите, стимулирует процессы, ведущие к прогрессированию почечной недостаточности [9, 16-18, 55, 78, 81, 82, 109, 176].
Из всех компонентов РААС наибольшее внимание к себе привлекает ангиотензин П (Анг-П), образующийся из неактивного белка ангиотензиногена в результате действия на него протеолитических ферментов (рис.1).
Связываясь со специфическими рецепторами, Анг-П оказывает целый ряд воздействий на сердечно-сосудистую систему, вызывая сужение сосудов, задержку натрия и воды, в том числе и за счет стимуляции выработки альдосте-рона, и, следовательно, повышение системного АД [47,160].
Системная АГ, в свою очередь, может быть причиной развития другого гемодинамического фактора прогрессирования - внутриклубочковой гипертен-зии [1, 5,6, 9]. У здоровых лиц сосуды почек «защищены» от передачи высокого АД феноменом ауторегулящш почечного кровотока, нарушение которого при заболеваниях почек, приводит к передаче высокого АД непосредственно на капилляры клубочка [174]. Повышение внутриклубочкового давления может быть также связано с прямым действием ангиотензина П на выносящую арте-риолу, что вызывает ее спазм и приводит к увеличению градиента почечного транскапиллярного давления [74].
Системная и внутрипочечная гштертензия вносят свой вклад в развитие и прогрессирование протеинурии. Этот факт имеет большое значение, поскольку результаты многочисленных исследований, проведенных в последние годы, свидетельствуют о наличии связи между выраженностью протеинурии и скоростью прогрессирования почечной недостаточности, вне зависимости от уровня АД и креатинина. Это позволяет рассматривать протеинурию в качестве независимого фактора прогрессирования поражения почек [61, 89, 121, 123, 132, 131].
Кроме того, в развитии протеинурии наряду с гемодинамическими факторами могут участвовать и негемодинамические. Показано, что Анг-П, действуя на структуры клубочка, увеличивает размер пор в капиллярах, повышая тем самым проницаемость клубочкового фильтра для белков плазмы [74, 104]. Такое увеличение проницаемости базальной мембраны клубочка приводит к тому, что белки, откладываясь в клетках мезангия и канальцев, вызывают их повреждение и инициируют процессы, в результате которых развивается гломерулоск-лероз [131].
В последние годы появились работы, свидетельствующие о том, что Анг-П, действуя как фактор роста, играет важную роль в развитии большого числа воспалительных и невоспалительных заболеваний почек, характеризующихся увеличением мезангия вследствие гипертрофии мезангиальных клеток и увеличения отложения депозитов в экстрацеллюлярном матриксе [98]. Установлено, что в культуре клеток Анг-П стимулирует пролиферацию эндотелиальных и мезангиальных клеток [138, 177], а также вызывает гипертрофию клеток проксимальных почечных канальцев [176]. Кроме того, Анг-П усиливает в них мито-генный эффект эпидермального фактора роста и стимулирует секрецию коллагена IV типа [140].
Идентификация аллелей полиморфных маркеров генов АСЕ
В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq, которая была получена от НПО «Биотех» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ООО «Синтол» (Москва). Выделение геномной ДНК из венозной крови человека осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции [9].
Ген А СЕ
Амплификацию полиморфного участка гена АПФ проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере РНС-2 («TECHNE», Великобритания) или РоІуСЬаіпП («Polygen», Германия) в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ Трис-HCl, рН 8.8,16.6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 1.0 мМ хлорид магния, соответственно, 0.2 мМ каждого dNTP, по 33 нг праймеров АСЕ1 (прямой праймер 5 -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 ) и АСЕ2 (обратный праймер 5 -GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 ), 1.5 ед. полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК. 35 циклов ПЦР проводили по следующей программе: 94С/1 мин, 57С/1 мин, 72С/1 мин, в том числе первая денатурация 3 мин, последний синтез цепи 7 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии этидиум бромида. Полученные полосы визуализировались в ультрафиолетовом свете. При амплификации были получены продукты длиной 490 пн (соответствуют вставке, аллель Г) и длиной 190 пн (соответствуют делеции, аллель D). В соответствии с наличием или отсутст 39 виєм вставки субъекты были классифицированы как // (гомозиготы по аллелю I), DD (гомозиготы по аллелю D) и ID (гетерозиготы). Ошибочное типирование геторозигот ID как гомозигот DD, вследствие преимущественной амплификации аллеля D и недостаточной амплификации аллеля I, было описано Shanmugam и соавт. [64]. Поэтому каждая проба с генотипом DD была ампли-фицирована повторно с набором праймеров, специфичных для последовательности вставки: 5 GGGACCACAGCGCCC X:CACTAG-3 и 5 CGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3 . ПЦР проводилась в условиях, идентичных условиям амплификации обеих аллелей гена АПФ, изменена была только температура отжига: 67С. При наличии аллеля І, в ходе реакции были получены продукты ДНК длиной 335 пн.
Ген CYP11B2
При проведении ПЦР использовался т.н. «hot start» на 80С, т.е. Taq-полимеразу в раствор для проведения ПЦР добавляли после того, как температура достигала 80С, а затем реакцию проводили по стандартной схеме: 35 циклов при температуре отжига 68С. Использованная концентрация
В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, образуется фрагмент ДНК длиной 537 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель -344С, расщепляется рестриктазой НаеШ (Си-бЭнзим), образуя продукты размерами 203, 138, 126 и 71 п.н.; в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель -344Т дает при расщеплении другой набор фрагментов: 274, 138 и 126 п.н. Т.о. наличие фрагмента длиной 274 п.н. и отсутствие фрагмента 203 п.н. после обработки НаеШ соответствует генотипу ТТ, обоих фрагментов (274 и 203 п.н.) - генотипу СТ и только фрагмента 203 п.н. -СС. Более легкие полосы, присутствующие на геле при электрофорезе, в рассмотрение не принимаются.
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP1B2 NOS3 с развитием ХГН
Генетическую предрасположенность к развитию ХГН оценивали путем сравнения распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 у 167 больных ХГН и 80 человек из контрольной группы.
Результаты генотипирования по локусам I/D гена АСЕ, С(-344)Т гена CYPI1B2 и 4а/4Ь гена ecNOS3 представлены в таблице 2. Во всех группах распределение генотипов подчинялось равновесию Харди-Вейнберга (т.е. ожидаемые частоты соответствовали наблюдаемым).
При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 в контрольной группе и среди больных ХГН статистически достоверных различий не было выявлено. Обращало на себя внимание двухкратное увеличение частоты генотипа 4а/4а гена NOS3 у больных ХГН, однако данное различие не было статистически значимым (р = 0,22).
Анализ клинических особенностей ХГН, скорости прогрессирования почечной недостаточности и эффективности терапии ингибиторами АПФ проводили в группах больных, выделенных в зависимости от генотипов исследуемых полиморфных маркеров:
для гена АСЕ - группы II, Ю и DD;
для гена CYP11B2 - группы ТТ, СТ и СС;
для гена NOS3 - группа 4Ь/4Ь и группа 4а, в которую вошли больные-носители генотипов 4а/4Ъ и 4а/4а (больные с данными генотипами были объединены в одну группу из-за малого количества гомозигот 4а/4а). Кроме того, в зависимости от носительства так называемых «небла гоприятных» аллелей- аллеля D гена АСЕ, аллеля Сгена CYPUB2 и аллеля 4а гена N0S3 - были выделены 2 комбинированные группы. В первую группу (группа D+C+4a) включены носители сочетания аллеля D (генотипы ID или DD), аллеля С (генотипы СТ или СС) и аллеля 4а (генотипы 4а/4Ъ или 4а/4а) - всего 8 комбинаций генотипов (рис. 10). Вторую группу (группа О) составили носители оставшихся сочетаний генотипов.
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, CYP11B2 и NOS3 87 с генетической предрасположенностью к развитию ХГН
Для оценки генетической предрасположенности к развитию ХГН мы использовали один из наиболее распространенных подходов: поиск ассоциации полиморфного маркера гена-кандидата с предрасположенностью или устойчивостью к развитию заболевания.
Подобная тактика уже оправдала себя ранее при изучении роли генетических факторов в развитии таких широко распространенных патологий, как заболевания сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет и его сосудистые осложнения [2, 3, 4, 96]. При этом к настоящему времени наиболее исследован полиморфный маркер 1/D гена АСЕ. Так, в ряде зарубежных и отечественных работ при анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АСЕ в группах больных и здоровых лиц, составлявших контрольную группу, была выявлена ассоциация генотипа DD и/или аллеля D с риском возникновения инфаркта миокарда [37, 38, 91], поражения коронарных артерий [111], развития АГ [125, 168] и гипертрофии левого желудочка [14, 145], а также с предрасположенностью к сердечно-сосудистым осложнениям у больных сахарным диабетом [2,4].
Активно изучается роль полиморфного маркера 1/D гена АСЕ и в возникновении заболеваний почек. В ряде зарубежных исследований обнаружена ассоциация аллеля D и/или генотипа DD как с первичными гломерулонефритами [23, 57, 63, 71, 88, 154, 180, 182], так и с поражением почек другой этиологии: поликистозом почек [28, 84], диабетической нефропатией [96,181]. Однако основное внимание отечественных исследователей привлекает проблема ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов РААС с поражением почек в рамках сахарного диабета [3, 4], в то время как вопрос о генетической предрасположенности к возникновению ХГН до настоящего времени остается открытым. В нашей работе впервые в отечественной литературе исследован характер распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера 1/D гена АСЕ при ХГН. Мы обнаружили, что у больных ХГН аллель D встречается несколько чаще, чем аллель /, что характерно для европейских популяций, в которых частота встречаемости аллеля D составляет 49-61% [63, 71,90,117]. В то же время, у представителей другой расы - японцев - доминирует аллель І, а аллель D встречается лишь в 33-37% случаев [180,182]. В нашем исследовании среди генотипов гена АСЕ преобладали гетерозиготы ID (50,9%); доли гомозигот DD и II существенно не отличались, составив 25,2% и 23,9% соответственно. Анало-гичный характер распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АСЕ наблюдался и в контрольной группе (у лиц без заболеваний почек и АГ). При сравнительном анализе частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АСЕ у больных ХГН и в контрольной группе достоверных различий нами не выявлено.
Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-344)Т гена CYPIIB2, ассоциированного с рядом заболеваний сердечно-сосудистой системы, в нашем исследовании было аналогично распределению, полученному в работах Е. Lovati и соавт. [90] и J. Song и соавт. [148]: как в группе больных ХГН, так и в контрольной группе несколько доминировал аллель Г; его частота составила 56,1% и 54,4% соответственно. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-344)Т гена CYPI1B2 у больных ХГН и в контрольной группе достоверно не отличалась.
