Содержание к диссертации
Введение
1 Малоинвазивные методы дигностики рака мочевого пузыря (обзор литературы) 17
1.1 Общие сведения, эпидемиология, этиология и патогенез рака мочевого пузыря 17
1.2 Классификация опухолей мочевого пузыря 24
1.3 Современные методы диагностики рака мочевого пузыря 28
1.4 Экспериментальные малоинвазивные диагностические методики рака мочевого пузыря 36
1.5 Недостатки существующих методов диагностики рака мочевого пузыря 56
2 Материалы и методы обследования больных 60
2.1 Характеристика больных 60
2.2 Дизайн и методы исследования 64
2.2.1 Определение матрикс - металлопротеаз мочи 64
2.2.2 Фотодинамическая диагностика 68
2.2.3 Оптико-когерентная томография 81
2.2.4 Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия 87
2.3 Документация 89
3 Диагностическая ценность матрикс - металлопротеаз 2 и 9 в неинвазивном определении рака мочевого пузыря 90
3.1 Введение 90
3.2 Диагностическая ценность ММП-2 и ММП-9 мочи при раке мочевого пузыря 91
3.3 Обсуждение результатов исследований 97
4 Значение фотодинамическои диагностики для малоинвазивного определения локализации рака мочевого пузыря 101
глава 4.1 Введение страница 101
4.2 Чувствительность и специфичность АПК- флюоресцентной цистоскопии 102
4.3 Методы повышения эффективности применения флюоресцентной цистоскопии 105
4.4 Влияние фотодинамической диагностики во время ТУР мочевого пузыря на риск возникновения рецидивов опухоли 112
4.5 Обсуждение результатов исследований 119
5 Малоинвазивное определение границ распространения и глубины прорастания рака мочевого пузыря оптико-когерентной томографией 130
5.1 Введение 130
5.2 Сравнительная характеристика ОКТ- снимков и гистологических изображений стенки мочевого пузыря 131
5.3 Чувствительность и специфичность ОКТ в диагностике рака мочевого пузыря 142
5.4 Повышение объективности оценки ОКТ- изображений 145
5.5 Обсуждение результатов исследований 153
6 Диагностические возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для малоинвазивного определения степени дифференцировки раковых клеток слизистой мочевого пузыря in vivo 170
6.1 Введение 170
6.2 Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия нативных тканей мочевого пузыря 171
6.3 Обсуждение результатов исследований 173
7 Комплексная оценка возможностей совместного применения малоинвазивных методов в диагностике рака мочевого пузыря 179
7.1 Введение 179
7.2 Технические принципы комплексного применения малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря 180
7.3 Обсуждение 185
Выводы 193
Практические рекомендации 195
Список литературы 197
- Классификация опухолей мочевого пузыря
- Определение матрикс - металлопротеаз мочи
- Диагностическая ценность ММП-2 и ММП-9 мочи при раке мочевого пузыря
- Методы повышения эффективности применения флюоресцентной цистоскопии
Введение к работе
3.2 Диагностическая ценность ММП-2 и ММП-9 мочи при раке мочевого пузыря
3.3 Обсуждение результатов исследований ЗНАЧЕНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОИ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ МАЛОИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ страница глава
4.1 Введение
4.2 Чувствительность и специфичность АПК- флюоресцентной цистоскопии
4.3 Методы повышения эффективности применения флюоресцентной цистоскопии
4.4 Влияние фотодинамической диагностики во время ТУР мочевого пузыря на риск возникновения рецидивов опухоли
4.5 Обсуждение результатов исследований МАЛОИНВАЗИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРАНИЦ РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ГЛУБИНЫ ПРОРАСТАНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ОПТИКО-КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИЕЙ
5.1 Введение
5.2 Сравнительная характеристика ОКТ- снимков и гистологических изображений стенки мочевого пузыря
5.3 Чувствительность и специфичность ОКТ в диагностике рака мочевого пузыря
5.4 Повышение объективности оценки ОКТ- изображений
5.5 Обсуждение результатов исследований ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОНФОКАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ МАЛОИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РАКОВЫХ КЛЕТОК СЛИЗИСТОЙ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
6.1 Введение
6.2 Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия нативных тканей мочевого пузыря
6.3 Обсуждение результатов исследований КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТЕЙ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ МАЛОИНВАЗИВНЫХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
7.1 Введение
7.2 Технические принципы комплексного применения малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря
7.3 Обсуждение ВЫВОДЫ ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ страница СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 197 СОКРАЩЕНИЯ
5-ALA - 5-Amino- Levulin Acid, аминолевулиновая кислота АЛК - аминолевулиновая кислота KT - компьютерная томография КСЛМ — конфокальная сканирующая лазерная микроскопия ММП - матрикс- металлопротеаза МРТ - магниторезонансная томография МП - мочевой пузырь ОКТ - оптическая когерентная томография ПНР - полимеразная цепная реакция пг - пикограмм ТИММП - тканевые ингибиторы матрикс- металлопротеаз ТУР - трансуретральная резекция УЗИ - ультразвуковое исследование ФДД - фотодинамическая диагностика ВТА - (bladder tumor antigen), антигены опухоли мочевого пузыря cis - карцинома in situ СК - citokeratin, цитокератин FDP - фактор деградации фибрина ISUP - Международное Общество Урологической Патологии LIF - коэффициент интенсивности флюоресценции (КИФ) п - количество NMP - белок матрикса ядра max - максимальное значение min - минимальное значение MHz - мегагерц PPIX - протопорфирин IX WHO - Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) ВВЕДЕНИЕ • Актуальность темы Рак мочевого пузыря является самым частым новообразованием мочевыводящих путей (Лопаткин Н.А., 1998; Матвеев Б.П. и соавт., 2001; Jemal А. и соавт., 2004). Несмотря на активные разработки методов ранней диагностики, хирургической тактики, эффективных схем комбинированного лечения, химио- и иммунопрофилактики, остаётся большой частота рецидивирования (27-81%) и прогрессирования (24-3 8%) первичного и рецидивного рака мочевого пузыря (Ворбьев Д.В и соавт., 2002; Аль-Шукри Х. и соавт., 2000; Grimm М.О. и соавт., 2003). Для разработки более эффективных диагностических и лечебных подходов при раке мочевого пузыря необходимо более детальное и глубокое изучение биологических особенностей этого вида опухоли.
Основными причинами, препятствующими точному прогнозированию развития опухолей, имеющих схожие морфологические характеристики, являются недостатки стандартных методов исследования. Несмотря на попытки улучшить качество диагностики рака мочевого пузыря при помощи дополнительных клинических, морфологических, иммуногистохимических и других показателей, до настоящего времени универсального диагностического метода найти не удалось.
Биопсия с последующим патоморфологическим исследованием является наиболее точным стандартным методом постановки диагноза (Лопаткин Н.А., 2003; May F. и соавт., 2003; Mitropoulos D. и соавт., 2005). Инвазивный характер биопсии и невозможность диагностики в реальном времени и на живых тканях заставляет находить малоинвазивные и дистанционные диагностические методики диагностики рака.
Цитологическое исследование мочи является традиционным рутинным методом диагностики уротелиальной карциномы, используемым в клинической практике (Матвеенко А.А. и соавт., 2002; Raab S.S. и соавт., 2007). Данное исследование мочи имеет высокую чувствительность только при низкодифференцированном раке мочевого пузыря (Гориловский Л.М., 2002; Su С. и соавт., 2007). Недостаточная чувствительность данной методики при дифференцированном раке заставляет разрабатывать новые методы с использованием опухолевых маркеров содержащихся в моче.
Перспективным количественным методом оценки агрессивности опухолей в настоящее время считается определение эндогенных ферментов протеолиза (Kader А.К. и соавт, 2006). В механизме инвазии злокачественных опухолей происходит протеолитическое разрушение базальной мембраны опухолевыми клетками. К эндогенным ферментам, участвующим в этом процессе, относятся матрикс - металлопротеазы (ММП). Экспериментальные исследования in vitro и in vivo показали, что при раке рост концентрации ММП взаимосвязан с инвазией и метастазированием (Forsyth Р.А. и соавт., 1999; Naylor M.S. и соавт., 1994; Sier S.F. и соавт., 1996). Однако, данные об эффективности ММП, полученные этими исследовательскими группами, оказываются противоречивыми. Нахождение объективных показателей рецидивирования и прогрессирования рака мочевого пузыря, путём определения концентрации ММП в моче больных с опухолью является актуальным в разработке неинвазивных диагностических методик. В ходе нашего исследования были изучены особенности клинической картины заболеваний в зависимости от концентрации ММП. Цитологическое исследование и диагностические маркеры определяют наличие рака, но не определяют локализацию опухоли. Это заставляет развивать оптические методики диагностики новообразований мочевого пузыря.
Среди оптических методов диагностики уротелиальных карцином «золотым стандартом» остаются цистоскопия и гистологическое исследование кусочков ткани, взятых при щипковой биопсии или резекции. Несмотря на применение современных цистоскопов, при стандартной цистоскопии часто не удаётся распознать плоские формы или мелкие сателлиты опухоли (Комяков Б.К. и соавт., 2004; Лопаткин Н.А. и соавт., 2004; Vogeli Т.А., 1992). Рандомная биопсия подозрительных участков слизистой мало информативна и может вызывать реимплантацию раковых клеток (May F. и соавт., 2003; Taguchi I. и соавт., 1998). Гистологическая постановка диагноза возможна только ex vivo и не позволяет интраоперационно, динамически контролировать абластичность проводимой операции. Всё это заставляет проводить клиникоэкспериментальные исследования по внедрению различных оптических методов, обладающих высокой разрешающей способностью и специфичностью при установке диагноза во время эндоскопического исследования. Попытки объединить такие методы, как методика определения ММП, фотодинамическая диагностика, оптико-когерентная томография, конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, позволяют соответственно определить наличие и локализацию опухоли, глубину её прорастания и дифференцировку раковых клеток. Эти одновременно применяемые методы называют «оптической биопсией» (Koenig F. и соавт., 2003).
Уротелиальная карцинома мочевого пузыря, особенно на ранней стадии, вызывает незначительное утолщение слизистой, что очень часто не даёт возможности визуально обнаружить рак. Такое новообразование выглядит как неспецифическое воспаление или как абсолютно нормальная слизистая. Эти изменения в слизистой во время трансуретральной электрорезекции опухоли при стандартном белом освещении можно легко не заметить, что не даёт возможности провести прицельную биопсию, коагуляцию или резекцию. У 38-
63% пациентов при первичной операции не полностью удаляется опухоль.
Частота возникновения резидуальной опухоли через 6 - 1 2 недель после первичной резекции поверхностного переходноклеточного рака мочевого пузыря колеблется от 7 до 75% (Мартов А.Г. и соавт., 2005; Kurth К.Н. и соавт., 2000; Schenkman Е. и соавт., 2004; Vogeli Т., и соавт., 1998).
Последние 15 лет исследователи пытаются найти методику светового маркирования уротелиальньгх карцином с использованием 5-аминолевулиноаой кислоты (АЛК) (Аль-Шукри Х. и соавт., 2000; Хролович А.Б. и соавт., 2005; Kennedy J.C. и соавт., 1992). После инстилляции АЛК, благодаря красному свечению опухоль легко определяется, её границы становятся чёткими. Это особенно важно, когда опухоль имеет плоскую форму или микросателлиты, которые часто пропускаются при обычной эндоскопии. Не все специалисты единодушны в эффективности применения АЛК в диагностике рака (Miller К. и соавт., 1998). Они относят к недостаткам высокий процент ложноположительных результатов, большой разброс данных о специфичности и чувствительности флюоресцентной цистоскопии в* различных исследовательских группах и отсутствие отдалённых результатов применения^ ФДД. Поэтому существует необходимость, в собственном исследовании определить чувствительность и специфичность АЛК- метода, развить технику и повысить эффективностыфотодинамического исследования в онкоурологии, а так же получить отдалённые результаты применения АЛК-флюоресценции во время трансуретральной резекции мочевого пузыря.
В*течение 15 лет развивается оптическая когерентная томография (ОКТ) для получения изображения структуры биологических тканей (Fercher A.F. и соавт., 1993; Huang D. и соавт., 1991). Цель современной медицинской науки в области ОКТ - получить прижизненное изображение тканей на клеточном уровне, приблизить качество изображения к гистологическому, сохранить глубину проникновения излучения до нескольких миллиметров, подводить источник света на глубину живого изучаемого биологического объекта.
Наиболее перспективным считается применение ОКТ на тканях, имеющих слоистое строение, а также там, где строение поверхностного слоя до 2 мм является решающим при постановке диагноза. Предварительные разработки многих исследовательских групп из Америки, Европы и России в области ОКТ (Гладкова Н.Д. и соавт., 2002; Brand S. и соавт., 2000; Gerckens U. и соавт., 2003)- свидетельствуют о необходимости сконцентрировать дальнейшие исследования на создании принципиально нового эндоскопа с использованием ОКТ, создать программы по оценке получаемого сигнала, провести исследования на прижизненных тканях, сравнить получаемое изображение ОКТ с гистологическим изображением этих же участков тканей мочевого пузыря.
В последние годы появились работы по использованию конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (КСЛМ) для получения изображения на клеточном уровне живых биологических тканей (Michael C.W. и соавт., 1997).
Современная КСЛМ позволяет получить изображения с разрешением 0,5-1,0 мкм. Существующий классический процесс фиксации тканей для гистологического исследования-часто изменяет конфигурацию и положение отдельных участков ткани- искажая > истинное изображение. Кроме этого стандартным способом можно получить только фиксированную картину тканей ех< vivo; Предварительные исследования группы авторов (Koenig F. и соавт., 2003) показали; что КСЛМ позволяет получить высоко разрешающее изображение внутриклеточного строения стенки мочевого пузыря крыс.in vivo.
Хотя эндоскопический вариант КСЛМ у пациентов в настоящее время является невозможным,, существует необходимость дальнейшего развития данной методики с использованием тканей мочевого пузыря после биопсии и цистэктомии.
Таким образом, разработка1 новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря является актуальной проблемой, а большой* процент резидуальных опухолей; после; трансуретральной; резекции диктует необходимость выполнения1 настоящего; исследования. .
Диссертация выполнена по плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО СПб ГМУ им. акад. И.П.Павлова (государственный регистрационный: номер 01940002759) и связана с планом НИР проблемной комиссии 40.01 Научного совета "Урология и нефрология" РАМН: • Цель и задачи исследования Целью исследования явилось клиническая оценка комплексного использования новых малоинвазивных методов, диагностики рака мочевого пузыря.
Задачи исследования:
1. Изучить диагностическую ценность показателей ММП-2 и ММП-9 в моче для определения наличия рака мочевого пузыря, глубины инвазии и степени дифференцировки;
2. Повысить чувствительность! и специфичность. АЛК- флюоресцентной цистоскопии в диагностике рака мочевого пузыря, а также оценить прогностическое значение в отношении риска рецидивирования и прогрессирования. поверхностного переходно-клеточного рака мочевого.
пузыря после ТУЕ:
3. Разработать методику* проведения- оптико-когерентной томографии мочевого пузыря, провести сравнение* между изображениями его нормальных и* неопластически трансформированных тканей при ОКТ и: гистологическом исследовании, оценить чувствительность. и специфичность, ОКТ-цистоскопиш при диагностике и определении степени местного распространения рака.
4. Изучить возможность использования; конфокальной сканирующей лазерной микроскопии в определении степени дифференцировки рака мочевого пузыря
5. Обосновать необходимость ш возможность комплексного г применения традиционных и-малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузырят vivo:, • Научная новизна Доказано, что определение новых онкомаркеров ММП-2 и ММП-9 мочи является высокочувствительной методикой диагностики карцином мочевого пузыря и их концентрация зависит от стадии роста и степени дифференцировки клеток опухоли. Впервые установлено, что показатели уровня ММП-2 и ММП9 применимы для динамического контроля за течением рака мочевого пузыря, для ранней диагностики рецидивов и могут быть дополнительным прогностическим фактором опухолевого прогресса.
Найдены более эффективные технические принципы проведения фотодинамической диагностики рака мочевого пузыря, позволяющие повысить чувствительность и специфичность выявления уротелиальных неоплазий, особенно плоских, мелких форм опухоли и карциномы in situ. Применение фотодинамической диагностики во время трансуретральной резекции поверхностного рака позволяет более точно диагностировать и удалять все части опухоли. В рандомизированном исследовании впервые доказано, что более абластично проведённая операция, благодаря применению красного флюоресцентного маркирования, приводит к значительному снижению риска рецидивирования и прогрессирования уротелиальнои карциномы, которое сохраняется на протяжении пятилетнего срока послеоперационного наблюдения.
Установлено, что ОКТ исследование даёт на тканевом уровне двухмерное изображение внутреннего строения слизистой оболочки мочевого пузыря, сходное с гистологическим изображением. Анализ полученных результатов показал, что с помощью ОКТ- эндоскопии с большой достоверностью можно определять диспластические и раковые изменения уротелия. Это делает возможным в реальном времени распознавать наличие опухоли и границы инвазии рака без получения материала для гистологического исследования.
Установлено, что чувствительность и специфичность распознавания рака мочевого пузыря методом эндоскопической ОКТ значительно выше, чем при стандартной цистоскопии. Впервые найдены специфические показатели оптических свойств тканей мочевого пузыря, используемые в разработанной ЭВМ-программе «Tomo View 1.0», которые позволяют повысить точность распознавания рака мочевого пузыря.
Выявлены возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, позволяющей проводить исследование живых тканей слизистой мочевого пузыря на клеточном уровне и количественно оценивать элементы её внутриклеточного строения, форму, размеры, структуру ядер клеток и определять степень дифференцировки раковых клеток.
Предложена новая методика постановки диагноза рака мочевого пузыря при помощи «оптической биопсии», объединяющей в себя визуальные способы диагностики in vivo: ФДД ОКТ, КСЛМ и позволяющей без биопсии ставить диагноз, близкий к патоморфологическому. Решено несколько конструктивных задач и проведено теоретическое и практическое обоснование создания устройства, объединяющего оптические методики, необходимые для проведения оптической биопсии рака мочевого пузыря.
• Практическая значимость работы Использование новых онкомаркеров в диагностике рака мочевого пузыря позволяет неинвазивным способом более точно осуществлять его диагностику и проводить контроль рецидивирования заболевания. Данная методика ориентирует уролога в выборе объёма оперативного или консервативного лечения и в прогнозировании заболевания.
Фотодинамическая диагностика помогает урологу найти все участки неоплазии слизистой оболочки мочевого пузыря и повысить абластичность проводимой трансуретральной резекции опухоли. Применение АЛКдиагностики во время ТУР приводит к снижению количества рецидивов опухоли и уменьшению числа повторных операций, что, в свою очередь, снижает стоимость лечения, необходимого для пациента.
Оптико-когерентная томография позволяет врачу во время эндоскопического исследования определять истинные границы опухоли внутри слизистой мочевого пузыря- и глубину инвазии без взятия материала для гистологического исследования. Визуальные данные внутреннего строения позволяют отказаться от проведения неприцельной и небезопасной биопсии и дают возможность точнее контролировать границы резекции удаляемой опухоли.
Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия позволяет урологу во время исследования живых тканей мочевого пузыря определять степень дифференцировки клеток уротелия, что может определить ход проводимой операции и прогноз заболевания.
Используемые методы диагностики: ФДД, ОКТ, КСЛМ являются малоинвазивными методиками, которые совместно могут дополнить стандартную1 биопсию и позволить избежать излишнюю травматизацию рандомной биопсии, уменьшить риск реимплантации раковых клеток и снизить, риск возникновения осложнений.
• Основные положения, выносимые на защиту
1. Ферменты протеолиза ММП-2 и ММП-9 мочи являются высокочувствительными онкомаркерами наличия рака мочевого пузыря, определение их концентрации позволяет судить о глубине инвазии и степени дифференцировки рака, а также прогнозировать клиническое течение заболевания.
2. Новая методика проведения фото динамического маркирования во время цистоскопии позволяют повысить чувствительность и специфичность выявления поверхностного рака мочевого пузыря, снизить риск его рецидивирования в ранние и поздние сроки наблюдения после трансуретральной резекции и уменьшить риск прогрессирования заболевания.
3. Эндоскопическая ОКТ дает возможность получить интравитальное изображение внутреннего строения слизистой оболочки мочевого пузыря, является высокочувствительным методом диагностики рака мочевого пузыря, который позволяет также определить границы и глубину инвазии опухоли.
4. Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия позволяет определить размеры и оценить форму клеток и клеточных ядер при раке мочевого пузыря, что дает возможность уточнить степень его дифференцировки на этапе получения опухолевой ткани при оперативном вмешательстве.
5. Дополнение традиционных методов диагностики рака мочевого пузыря новыми малоинвазивными методиками позволяет повысить ее чувствительность и специфичность, дает возможность получить информацию о глубине инвазии и степени дифференцировки новообразования, а также приводит к снижению риска рецидивирования и прогрессирования рака в послеоперационном периоде.
• Личный вклад автора Научный материал, представленный в диссертационной работе, был собран непосредственно автором в период с 1998 по 2007 годы. Автор самостоятельно участвовал в обследовании, лечении и наблюдении больных со злокачественной опухолью мочевого пузыря, лично участвовал в проведении всех экспериментальных и клинических исследований, описанных в диссертационной работе. Автор лично провёл статистический анализ собранного научного материала и опубликовал результаты в ведущих отечественных и зарубежных научных журналах.
• Внедрение и апробация работы Разработанные в диссертации малоинвазивные методы диагностики рака мочевого пузыря внедрены в работу клиники урологии Медицинского Университета «Шарите», Берлин, Германия. Кроме этого, результаты докторской диссертации на тему: «Клиническая оценка и внедрение новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря» используются в учебном процессе курса урологии постдипломного обучения на кафедре урологи ГОУ ВПО СПб ГМУ им.акад.И.П.Павлова и кафедре урологии Медицинского Университета «Шарите» Берлина.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Российской онкологической конференции (Москва, 2000), научно-практической конференции: «Туберкулёз и рак мочевой системы: вопросы дифференциальной диагностики и лечения» (Новосибирск, 2002), научнопрактической конференции: «Диагностика и комбинированное лечение больных раком мочевого пузыря» (Москва, 2002), международной биомедицинской конференции «BiOS 2003» (Сан-Хосе, США, 2003), всемирном конгрессе лазерной медицины «ISLM» (Мюнхен, Германия, 2003), V Всероссийской научно-практической конференции, по онкоурологии (Обнинск, 2003), VII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2003), XI конференции по лазерной оптике «LO'2003» (СПб, 2003), международной конференции фотобиологии «Photonics West» (Сан-Хосе, США, 2004), Российско - Германской научно-практической конференции по урологии (СПб, 2004), научном заседании общества урологов Берлина (Берлин, Германия, 2004), 16 симпозиуме по экспериментальной урологии (Любек, Германия, 2004), 35 конгрессе немецкого общества медицинской физики (Лейпциг, Германия, 2004), международной конференции оптической физики «OSAV2004», (СПб, 2004), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004), 56 конгрессе общества немецких урологов (Висбаден, 2004), международной конференции оптических технологий, биофизики и медицины «SPIE» (Саратов, 2004), IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005), урологической конференции «Современные технологии диагностики и лечения заболеваний мочеполовой системы» (Новосибирск, 2005), XX конгрессе Европейской Ассоциации урологов (Стамбул, Турция, 2005), 100 конгрессе Ассоциации Американских урологов (Сан-Антонио, США, 2005), IV международном урологическом симпозиуме (Н. Новгород, 2006), 90 конгрессе общества немецких патологов (Берлин, Германия, 2006), урологической конференции университета Шарите «Поверхностный рак мочевого пузыря» (Берлин, Германия, 2006), 4 международной конференции «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (СПб, 2007), 59 конгрессе общества немецких урологов (Берлин, 2007), XXIII конгрессе Европейской Ассоциации урологов (Милан, Италия, 2008), 103 конгрессе Ассоциации Американских урологов (Орландо, США, 2008).
• Публикации По материалам диссертации опубликован 51 научный труд: 21 публикация в ведущих русских и зарубежных научных журналах, рекомендованных ВАК, по теме диссертации на соискание ученой степени доктора наук по специальности урология, написано 4 главы в монографиях, получено 1 свидетельство на изобретение ЭВМ-программы, получен сертификат Европейской Ассоциации урологов за лучшее научное сообщение в разделе диагностики рака мочевого пузыря на европейском урологическом конгрессе (Турция, Стамбул, 2005).
• Объем и структура работы Диссертация изложена на 226 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, в котором приведен 293 источника, в том числе 34 источника на русском языке и 259 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 78 рисунками.
Классификация опухолей мочевого пузыря
Нормальная слизистая мочевого пузыря обычно состоит минимум из 3 и максимум из 7 клеточных слоев. Клетки базального слоя лежат на тонком слое lamina propria, который содержит сосуды. Мышечный слой состоит из комплекса сети пучков гладкомышечных волокон. Основная часть (98%) опухолей мочевого пузыря имеют уротелиальную природу: 95% переходноклеточный рак, 3% плоскоклеточный рак, 2% аденокарцинома (Oosterlinck W. и соавт., 2002). Большинство, опухолей мочевого пузыря являются папиллярными и злокачественными. Истинные папилломы с количеством клеточных слоев не более 7 с отсутствием митотической клеточной активности составляют менее 3,5% всех опухолей мочевого пузыря. 80% всех опухолей имеют папиллярную форму, 17%- солидную форму, 3% -форму карциномы in situ. 70% опухолей развиваются на боковых и задней стенках пузыря, 20% - на дне мочевого пузыря, 10% - на верхушке мочевого пузыря. 60% опухолей имеют мультифокальную форму (Hautmann R., HulandH., 1997).
В настоящее время наибольшее распространение получила квалификация рака мочевого пузыря по системе TNM (The Tumor, Node, Metastases) и G (Grading). Эта классификация была предложена и неоднократно переработана Международным Противораковым Союзом совместно с Международным Обществом Урологической Патологии и впоследствии одобрена Всемирной Организацией Здравоохранения (Epstein Jil. и соавт., 1998; Oosterhuis J.W.A. и соавт., 2002; Eble J.N. и соавт., 2004). Клиническая классификация TNM: Т - глубина прорастания опухоли мочевого пузыря ТХ глубина прорастания опухоли не определена ТО отсутствие данных о первичной опухоли Та неинвазивная папиллярная карцинома Tis carcinoma in situ "плоская опухоль" ТІ опухоль распространяется в субэпителиальную соединительную ткань Т2 опухоль инфильтрирует мышцы Т2а опухоль инфильтрирует поверхностный слой мускулатуры (внутренняя половина) Т2Ь опухоль инфильтрирует глубокий слой мускулатуры (наружная половина) ТЗ опухоль инфильтрирует околопузырные ткани ТЗа микроскопически ТЗЬ макроскопически (эхтравезикальная опухоль) Т4 опухоль инфильтрирует предстательную железу, матку, влагалище, стенку таза; брюшную стенку Т4а предстательная железа, матка, влагалище Т4Ь стенка таза или брюшная стенка N- региональные лимфатические узлы Регионарными для опухолей мочевого пузыря являются тазовые лимфатические узлы ниже бифуркации подвздошных артерий. NX региональные лимфатические узлы не могут быть оценены N0 отсутствие метастазов в региональные лимфоузлы N1 метастаз в один лимфатический узел, 2 см или менее в наибольшем измерении N2 метастаз(ы) в отдельные лимфоузлы, размер метастаза более 2 см, но менее 5 см в наибольшем размере N3 метастазы в лимфоузлы, которые больше 5 см в наибольшем измерении М Отдалённые метастазы MX имеющиеся метастазы не могут быть.оценены МО отсутствие отдалённых метастазов Ml отдалённые метастазы Гистопатологическая градация G Степень дифференцировки клеток (Grading) подразделяется на Gx степень дифференцировки не может быть определена G1 высокая дифференцировка G2 средняя дифференцировка G3 низкая дифференцировка
Различают поверхностный и инвазивный рак мочевого пузыря. Опухоли (Та, ТІ, cis), которые ограничены слизистой и lamina propria, называют поверхностными опухолями (Андреева Ю.Ю. и соавт., 2006). Эти опухоли составляют 75 - 85% всех выявленных опухолей мочевого пузыря. Некоторые авторы предложили выделять субкатегории Т1а и Tib в зависимости от врастания рака в мышечную прослойку (muscularis mucosae) слизистой оболочки (Younes М. и соавт., 1990; Hasui Y. и соавт., 1994; Angulo J.C. и соавт., 1995), но частые случаи отсутствия формирования muscularis mucosae в некоторых областях мочевого пузыря и сложности ее идентификации в ткани после ТУР опухоли ограничили применение этого подхода на практике.
Под инвазивными раком (Т2 - Т4) понимают опухоли, которые пенетрируют в. собственную мышечную оболочку (muscularis propria). К ним относится солидный рак, прогноз при котором наименее благоприятен. 80 -90% всех случаев инвазйвной карциномьг- мочевого пузыря t устанавливаются при первичной диагностике.\Только 10 - 16% инвазивных.опухолей возникают в, результате прогрессии поверхностного рака. Некоторые российские онкоурологи совместно рассматривают поверхностный, рак стадии ТІ и инвазивный рак стадии Т2а как поверхностнолокализованную форму опухолевого процесса (Русаков И.Г. и Быстров А.А., 2003). Эти авторы предлагают применять у пациентов с данной-формой рака одинаковую тактику лечения. По данным Б.П. Матвеева и соавт. (2003) в нашей стране поверхностный и поверхностнолокализованный рак выявляют реже чем по некоторым данным зарубежных авторов. Так: в 1997 г. эти- формы опухоли мочевого пузыря; были обнаружены- 46,8% случаев, а ивазивный рак ТЗ, Т4 - в. 38,1% и- 15,1% случаев соответственно (Матвеев Б.П. и соавт., 2003). По данным немецких онкоурологов. поверхностная" карцинома мочевого1 пузыря при первичной диагностике выявляется в 75%, а. инвазивный- рак - в 25% случаев (Liedl В., 2003).
Определение матрикс - металлопротеаз мочи
В подгруппе исследования по изучению применения матрикс -металлопротеазы мочи при раке мочевого пузыря мы провели обследование у 130 пациентов. Они были разделены на 3 группы: группу больных с переходноклеточным раком мочевого пузыря, группу больных с циститом и контрольную группу. В моче каждого пациента однократно определяли концентрацию ММП-2 и ММП-9. Полученные относительные показания ММП соотносили с концентрацией креатинина в моче для устранения разницы диуреза пациентов. Этой корреляцией получали абсолютные значения ММП мочи, необходимые для-дальнейшего сравнения по труппам. Параллельно этим исследованиям мочу больных подвергали стандартным исследованиям: определяли рН; лейкоциты, эритроциты, белок, креатинин. Кроме этого, мочу всех больных исследовали на наличие раковых клеток. При этом сравнивали чувствительность и специфичность методов диагностики уротелиальных карцином при помощи стандартного цитологического исследования и методики цимографии по определению матрикс - металлопротеазы мочи-2 и -9:
Чувствительность.рассчитывалась по формуле: рщ + ЛО ИП- «истинно - положительный». Правильно поставленный диагноз методом ММП у больных с уротелиальной карциномой, подтверждённый, гистологическим исследованием. : ЛО- «ложно - отрицательный». Неправильно поставленный диагноз (пропуск) методом ММП у больных с уротелиальной- карциномой подтверждённый-гистологическимисследованием. Специфичность рассчитывалась по формуле: ио + ЛП ИО- «истинно- отрицательный». Правильно поставленный диагноз методом, исключающим неоплазию, подтверждённый гистологическим исследованием (истинно отрицательные случаи рака). ЛП- «ложно - положительный». Неправильно поставленный диагноз рака методом у больных с отсутствием-неоплазии, подтверждённый гистологическим исследованием, (ложно положительные случаи гипердиагностики). Результаты исследований оценивали статистической программой Graph Pad Prism 3;0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA) и SPSS 10,0 (SPSS Sofware , Miinchen).. Непараметрические данные обрабатывали программами: Kruskal-Wallis Test, Mann-Whitney-Uest и Spearmanrs корреляционный тест. Статистически достоверными считали результаты при р 0 05.
Биохимические принципы определенияММН- 2 и -9 мочи
ММП-2 и ММП-9 или желатиназы А и В интенсивно гидролизуют желатины, получаемые из различных типов коллагенов; в связи с чем их стали называть желатиназами. Название этих ферментов - коллагеназы IV типа -считается, неудачным1, так как кроме коллагена IV типа эти ферменты могут гидролизовать- коллагены других типов; а! также: ряд белков соединительнотканного» матрикса . в? том числе иг эластин. ММР-2 в: отличие; от. ММР-9 гидролизует фибронектин? и большой1 тенасцин-С, а- ММР-9?расщепляет энтактин и коллаген XIV типа. Первичная, структурах ММР-2; и ММР-9 изі разных источников; определена; по кДНК (Nagase Ш и соавт., 1996).. Оба: фермента имеют три повторяющиеся последовательности: по; 58 а. О;, которые составляют фибронектиновый домен;.отвечающий за связывание- ферментов ,с фибронектином, желатинами;, коллагенами I и IV типов и ламинином. Желатиназы гидролизуют коллагены по тем же связям, что и коллагеназы, но в коллагене IV типа, гидролизуемая желатиназами связь расположена на расстоянии 3/4 длины; молекулы с С-конца. РентгеноструктурныйТ анализ каталитического домена желатиназ; проведенный в 1994 году (Bode W. и соавт., 1994) показал; что его пространственная?структура; очень,сходна:coi структурой? каталитического-домена: коллагеназы.
Диагностическая ценность ММП-2 и ММП-9 мочи при раке мочевого пузыря
Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является протеолитическое разрушение базальной мембраны опухолевыми клетками (Stetler-Stevenson W.G. и соавт., 1996). К эндогенным ферментам, участвующим в этом процессе, относятся матрикс - металлопротеазы (ММП). Они влияют на различные компоненты внеклеточного матрикса (коллаген, желатин, эластин). ММП участвуют, например, в таких физиологических процессах перестройки тканей, как репарационный процесс или рост плаценты. Протеолитическое разрушение с участием ММП происходит при таких деструктивных процессах, как ревматоидный артрит, гепатит, миокардиальная дистрофия (Lamparter S. и соавт., 2000; Lein М. и соавт., 1998), а также при инвазивном и метастатическом проявлениях опухолевого процесса (Stetler Stevenson W.G. и соавт., 1996). Экспериментальные исследования in vitro и in vivo показали, что при раке молочной железы, толстой кишки, желудка и лёгких рост концентрации ММП взаимосвязан с инвазией и метастазированием.
С конца 90-х годов прошлого столетия начаты исследования соотношений ММП-2 и ММП-9 при раке мочевого пузыря. H.Kanayama и соавт. (1998) выявили RC-PCR методикой на инвазивных опухолевых тканях мочевого пузыря значительное повышение ММИ-2 в соотношении комплекса ММП-2/ ТИММП-2. B .Davies и соавт. (1993), сравнивая результаты биопсии здоровых и малигнезированных участков МП, нашли повышение ММП-2 и ММП-9. Биопсия показала статистически достоверное повышение ММП-2 и ММП-9 в участках инвазивного рака МП в сравнении с участками его поверхностной формы. Исследования методами ELISA и цимографии показали повышение концентрации ММП-2 и ММП-9 у пациентов с инвазивным раком мочевого пузыря.
Целью этого раздела нашего исследования было изучить изменения показателей ММП-2 и ММП-9 в моче больных с опухолью мочевого пузыря в сравнении с таковыми у здоровых людей, и пациентов с воспалительными заболеваниями; мочевой:системы:
Определение уровня ММП-2 и ММП-9 в моче в нашем исследовании проводили методом цимогрофии. Вначале были найдены нормальные значения уровня? ММП-2 и -9 в моче, .а также: было выяснено влияние на концентрацию ММП таких, факторов как возрасти полпациентов; Средние: показания: ММП-2 и ММП-9 в- соотношении; с. концентрацией креатинина ВІ моче: контрольной группы;, определяемой. цимографией в; 95% зоне непараметрических данных, составили соответственно 27б;9 Jig/g креатинина и 648; ug/g креатинина.
При помощи Spear-mam s корреляционного теста нами было проанализировано изменение уровня ММП-2 и ММП-9 в моче в зависимости от возраста и пола пациентов. Раздельный анализ в группах больных раком мочевого пузыря, цистита и контроля: показал отсутствие статистически достоверного влияния факторов пола и возраста на концентрацию1 ММП-2 и ММП-9, выделяемых с мочой; Значения показаний ММП-2 и ММП-9 определённые методом цимографии; для контрольной группы, для пациентов1 с воспалением и опухолью мочевого пузыря: были: статистически обработаны и графически представлены-на рисунке 311. Рисунок иллюстрирует статистически? достоверные- более высокие показатели ММР-2 и ММР-9 в моче пациентов страдающих: раком мочевого- пузыря: (278,7u.g/g креатинина и: 405,4 (4g/g креатинина) по сравнению с группойконтроля (83 5 jig/g креатинина и 92,1 u.g/g креатинина)Уровень концентрации ММИ-9 мочи в группе пациентов с циститом оказался повышенным по сравнению с группой больных карциномой мочевого пузыря (р 0,05) и контроля (р 0,01). Средние показатели ММП-9 мочи в коллективе пациентов с воспалением и раком мочевого пузыря составили соответственно 500 6 p.g/g. креатинина и 405,4 ug/g креатинина, но разница между этими показателями оказалась статистически недостоверной.
Нами был. произведён анализ выделения ММП-2 и ММИ-9 с. мочой в подгруппах больных с различной степенью инвазию злокачественной опухоли мочевого пузыря. Из; рисунка.3.2 отчётливо видны более высокие показатели концентрации ММП-2 и ММП-9 в- моче пациентов с инвазивным; раком мочевого пузыря - (T2j. ТЗ, Т4) по сравнению; с: показателями контрольной группы. При поверхностной? уротелиальной- карциноме (Та, Т1-) так же найден повышенный;уровень концентрации обеих; ММИу но: статистическая; обработка; показала: достоверно . более высокие; показатели-, толької для ММП-9;. Концентрация» ММИ-2; и ММП-9s в моче: вшодгруппе пациентов; с инвазивным раком? мочевого пузыря: (Т2)? была выше (887,4 p,g/g креатинина и: 1050,0і ug/g креатинина) на статистически: достоверную величину (соответственно р 0 05; и р 0,01); чем в подгруппе больных с поверхностной карциномой уротелия; (153i2jj.g/g креатинина и. 229,8і p,g/g креатинина).
Разница показателей; ММП внутри подгруппы, пациентов с поверхностным новообразованием мочевого пузыря? (между Та и ТІ) была статистически? недостоверной и составила для ММИ-2 р= 0,3 и ; для-ММП-9 р= 0,4. Различияш уровне;концентрации ММП-2 и ММПт9 в подгруппе больных с: инвазивной уротелиальной; карциномой (между ТЗ- и Т4) тоже: оказались. недостовёрнымшприфг1 0-1 для обеих; ММП.
Методы повышения эффективности применения флюоресцентной цистоскопии
Анализируя протоколы исследования, мы попытались выяснить причины эффекта ложно-положительной и ложно-отрицательной флюоресценции при различных состояниях мочевого пузыря и научились правильно трактовать эти явления при постановке диагноза.
Наши наблюдения во время флюоресцентной цистоскопии при синем освещении показали в области неизменённой шейки мочевого пузыря и треугольника Льето присутствие диффузного красного свечения.
Интенсивность этой флюоресценции уменьшалась постепенно от сильной в области простатической части уретры до слабой в области межмочеточниковой складки. Границы и интенсивность свечения были нечёткими и диффузными. Эффект свечения здоровых тканей в этой области мы связываем со следующими причинами. В слизистой оболочке шейки мочевого пузыря кроме переходноклеточного эпителия всегда в большей или меньшей степени присутствует плоскоклеточный эпителий. Эти клетки более активно усваивают раствор АЛК, вызывая этим позитивную флюоресценцию. Другой причиной «ложного» свечения является анатомическая особенность шейки мочевого пузыря, благодаря которой эта область в любом физиологическом положении тела человека более тщательно омывается раствором АЛК, способствуя лучшей его диффузии. Кроме этого, при наполнении мочевого пузыря физиологическим раствором для проведения цистоскопии, слизистая в шейке не расправляется, остаётся складчатой и более утолщенной по сравнению с другими областями мочевого пузыря. Слабая флюоресценция нормальной слизистой при хорошем наполнении мочевого пузыря частично блокируется- за счёт встроенного в цистоскоп жёлтого фильтра. При слабом наполнении мочевого пузыря остаточная флюоресценция суммируется и регистрируется глазом в области складок и других физиологических утолщений слизистой. При достаточном наполнении мочевого пузыря раствором для цистоскопии, на боковых стенках, где присутствует только переходноклеточный эпителий, мы часто видели красное свечение неизменённой слизистой. Оно было неинтенсивным, диффузным и не постоянным. Этот эффект менялся при изменении угла подведения цистоскопа к слизистой или при использовании оптической части цистоскопа с различными линзами, меняющими угол исследования (0, 30, 70). Этот эффект ложно-положительной флюоресценции называется тангенциальной флюоресценцией. Меняя угол проведения детекции, мы меняем интенсивность суммарной флюоресценции. При малом, касательном угле исследования мы просматриваем вдоль (тангенциально) большой участок эпителиального слоя, тем самым оптически „утолщаем" слизистую в несколько раз. При исследовании под углом, близкому к 90, нормальный эпителиальный слой мочевого пузыря толщиной 70 - 100 \хт при АЛК- индуцированной
цистоскопии не вызывает красное свечение. Наш опыт показал, что для избежания тангенциальной флюоресценции боковые и переднюю стенки мочевого пузыря лучше обследовать оптикой с углом 70, а заднюю стенку и верхушку - прямой оптикой (0 - 30). Некоторые доброкачественные изменения слизистой мочевого пузыря, например, гиперплазия, вызывают красное свечение за счет увеличения количества слоев эпителия. Суммарная флюоресценция становится видимой, но в отличие от неоплазии она не интенсивная и без чётких границ. Участки воспаления слизистой мочевого пузыря также вызывают ложно-положительное свечение. Этот факт широко обсуждается многими учёными (Комяков Б.К. и соавт., 2004; Filbeck Т. и соавт., 1999; Jichlinski Р. и соавт., 1997; Kriegmair М. и соавт., 1994; Miller К. и соавт., 1998). Хроническое воспаление и дисплазия слизистой являются предраковыми состояниями мочевого пузыря. Обмен веществ и окислительно-восстановительные процессы во многом аналогичны при воспалении и в раковых клетках. Этим объясняется повышенное усвоение АЛК и её преобразование в PPIX при воспалении, возникшем при некоторых заболеваниях или после оперативного вмешательства. В первые 8 недель после операции в области послеоперационного рубца обычно присутствует выраженное воспаление. Его часто ошибочно расценивают как рецидив опухоли при флюоресцентном исследовании. Для избежания этого, повторную флюоресцентную цистоскопию целесообразно проводить позже 8 недель, после стихания явлений воспаления. Несмотря на это, дифференциация in vivo между раковыми и предраковыми заболеваниями требует применения более объективных оптических методов исследования.
