Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Цели и задачи работы 9
3. Обзор литературы 10
4. Материалы и методы 64
5. Результаты исследования 77
6. Обсуждение результатов 99
7. Выводы 133
8. Заключение 135
9. Библиография 137
Введение к работе
Актуальность исследования.
Зависимость от алкоголя формируется у разных больных по-разному, с неодинаковой скоростью: от быстрого злокачественного течения до столь медленного, что часто трудно провести четкую границу между периодом злоупотребления алкоголем и наступлением собственно заболевания (Иванец Н.Н., Игонин АЛ. 1983). Данные медицинской статистики (АвербахЯ.К., 1992) показывают, что лишь небольшая часть потребляющих алкоголь заболевают алкоголизмом, иными словами, потребление алкоголя является необходимым, но не достаточным условием возникновения алкогольной зависимости.
В литературе широко обсуждается значительная роль наследственных факторов в патогенезе зависимости от алкоголя, в частности в виде биологической врожденной предрасположенности к развитию алкогольной зависимости (Анохина И.П., 1988,1994; Cloninger C.R.,1988; Walker R.D.,1996; Heath A.C.,2001). Данные классической генетики, в частности, результаты семейных исследовании и близнецового метода (Cotton N.S. ,1979; George F.R.,1989), убедительно показывают, что риск заболевания значительно повышается при наличии в роду больных алкоголизмом: у таких пациентов часто, хотя и не всегда, зависимость формируется стремительно и в раннем возрасге(СгаЬЬе J.C.,1985; Goodwin D.W., 1979). При этом установлено, что закономерности наследования предрасположенности к зависимости от алкоголя не носят характера "менделевского" расщепления признаков, что заставляет предполагать вероятную полигеннную природу заболевания.
Экспериментальный подход выявил факт разделения популяции животных на группы с противоположным отношением к алкоголю в условиях свободного выбора: только часть животньж явно предпочитала алкоголь и усиленно потребляла его (Анохина И.П.,1994). Исследования на животньж "чистых" линий, селекционный отбор которых велся на основе противоположных реакций на алкоголь, установили значительные врожденные особенности функционирования ряда нейрохимических систем у этих животньж. (French ТА., 1985,1993; Wand G.S.,1993;Lukas L.R.,1998;Sands SA., 2000).
С биологической точки зрения врожденная предрасположенность понимается как комплекс генетически обусловленньж особенностей нейрохимических систем мозга, благодаря которым при злоупотреблении алкоголем состояние алкогольной зависимости развивается очень бистро и протекает злокачественно. Изучение биологических механизмов формирования зависимости от алкоголя на протяжении последних сорока лет убедительно доказало, что функциональные изменения обмена дофамина (ДА) в мезолимбической системе головного мозга являются пагогенеги-
РОС национальная) БИБЛИОТЕКА I
ческой основой зависимости от алкоголя. Впервые «дофаминовая гипотеза» патогенеза алкоголизма была сформулирована И.П. Анохиной (1975-1979).
Таким образом, на наш взгляд, дальнейшие исследования патогенеза алкоголизма, в частности врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости, должны быть сфокусированы на изучении структурных и функциональных особенностей генов, контролирующих дофаминовую ненротрансмитгерную систему. Ведущая роль в регуляции дофаминовой системы мозга принадлежит тирозингидроксилазе (ТГ) - ключевому ферменту биосинтеза катехоламинов, что обуславливает особый интерес к гену этого фермента. Роль гена ТГ в патогенезе зависимости от алкоголя и связь этого гена с врожденной предрасположенностью к зависимости от алкоголя остается неизученной. Выявление структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы, специфических для состояния врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя, могло бы прояснить, хотя бы частично, генетическую основу алкогольной зависимости.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы стало изучение структурных и функциональных особенностей гена тирозингидроксилазы у животньж с генетически детерминированной индивидуальной реакцией на алкоголь, а также у больных алкоголизмом с различной степенью наследственной отягощенности алкоголизмом и при различных клинических вариантах течения болезни.
В связи с этим в ходе настоящей работы решались следующие задачи:
Оценить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у инбредных линий животньж с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.
Изучить особенности влияния острого введения этанола на уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животньж инбредньж линий с генетически детерминированной различной реакцией на этанол.
Изучить уровень экспрессии гена ТГ в дофаминэргических структурах мозга у животньж со сформированной зависимостью от алкоголя, возникшей в результате хронического потребления этанола.
Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с наличием или отсутствием наследственной отягощенности этим заболеванием.
Провести сравнительное изучение структуры полиморфных локусов гена ТГ у больных алкоголизмом с различной тяжестью течения заболевания.
Основные результаты исследования и их новизна
Впервые показано, что у животных врожденная предрасположенность к зависимости от алкоголя ассоциируется с высоким уровнем экспрессии гена тирозингидроксилазы в дофаминовой мезолимбической системе мозга.
Впервые выявлен факт снижения уровня экспрессии гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга под воздействием однократной дозы этанола только у «предрасположенных» к зависимости животных до уровня «не предрасположенных» к зависимости животных.
Впервые показано, что хроническое потребление алкоголя вызывает снижение уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы в дофаминэргической нейротрансмигтерной системе мозга, гораздо более выраженное у животных, ставших зависимыми от алкоголя после хронической алкогольной интоксикации.
В ходе генотипирования больных алкоголизмом по полиморфному локусу HUMTH01 гена ТГ были впервые выявлены два генотипа, ассоциированные с алкоголизмом. Показано, что носители генотипа 9U0-1 имеют выраженную семейную отягощенность по алкоголизму, а носители генотипа Д10-1 характеризуются более «легким» течением алкоголизма. Возможно, генотип 7U0-1 обладает «протекторными» свойствами в отношении тяжести течения алкоголизма.
Таким образом, впервые показано значение структурных и функциональных особенностей гена ТГ в механизмах формирования зависимости от алкоголя и тяжести течения алкоголизма.
Научно-практическое значение работы
Высокая функциональная активность гена ТГ в мезолимбической дофаминовой системе мозга « предрасположенных» животных и факт ее быстрого снижения под действием однократной дозы этанола могут являться одним из механизмов нейрохимической «готовности» к развитию зависимости. Обнаруженное нами резкое снижение экспрессии гена ТГ в ДА системе мозга животных с развитой зависимостью от алкоголя можно оценивать как один из биологических маркеров зависимости, а высокий врожденный уровень экспрессии гена ТГ в этой же нейрохимической системе - как маркер врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя.
Выявленная ассоциация структурных особенностей гена ТГ с клиникой алкоголизма важна с точки зрения понимания молекулярньж основ как собственно зависимости от алкоголя, так и важнейших типов алкоголизма. Выявление у пациента генотипа 9М0-1, характерного для больных из семей с высокой степенью наследственной отягощенности по алкоголизму может служить признаком врожденной предрасположенности к алкогольной зависимости и возможным маркером
повышенного риска возникновения алкоголизма. На основе полученных результатов также возможно прогнозирование степени тяжести течения алкоголизма: выявление у больного генотипа Д10-1 может служить основанием для прогнозирования «легкого» течения болезни, отсутствие этого генотипа делает более вероятным тяжелое течение, что может быть успешно использовано для подбора соответствующей патогенетической терапии.
Апробация работы -
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии Национального Научного Центра Наркологии 25 декабря 2003 года.
Объем и структура диссертации '
Диссертация состоит из введения,- обзора литературы, описания' материалов и методов, результатов исследования, обсуждения и выводов. Она, изложена на 170 страницах машинописного текста и содержит 9 рисунков и 5 таблиц. Библиографический указатель состоит из 324 источников.
Цели и задачи работы
Непременным условием понимания сущности патологического процесса и выработки адекватного терапевтического воздействия является раскрытие патогенетических механизмов заболевания в совокупности с выявлением специфичных этиологических факторов. По современным представлениям, зависимость от алкоголя выступает ключевым признаком алкоголизма, стержневым патогенетическим феноменом, вокруг которого формируются прочие проявления заболевания (Портнов А.А., Пятницкая И.Н.,1973; Пятницкая И.Н.,1988; Иванец Н.Н., 2000). С клинической точки зрения, зависимость проявляется в виде патологического влечения к алкоголю, имеющего разнообразные проявления (Стрельчук И.В. 1976; Альтшулер В.Б., 1990).
Проблема зависимости от алкоголя изучается достаточно давно, однако механизмы, посредством которых алкоголь вызывает зависимость, а также генетические факторы, делающие некоторых подверженными зависимости, остаются непонятыми. Доступные способы и виды лечения не дают достаточных результатов и остаются малоэффективными. Основной задачей для успешного лечения и предупреждения заболевания представляется поиск возможных нейрохимических механизмов патогенеза зависимости от алкоголя и генетической предрасположенности к ней.
Актуальность исследования. Зависимость от алкоголя формируется у разных больных по-разному, с неодинаковой скоростью: от быстрого злокачественного течения до столь медленного, что часто трудно провести четкую границу между периодом злоупотребления алкоголем и наступлением собственно заболевания (Иванец Н.Н., Игонин А.Л. 1983). Данные медицинской статистики (Авербах Я.К.,1992) показывают, что лишь небольшая часть потребляющих алкоголь заболевают алкоголизмом, иными словами, потребление алкоголя является необходимым, но не достаточным условием возникновения алкогольной зависимости , огромное значение имеет индивидуальные биологические, а также личностные и социальные особенности больного.
В литературе широко обсуждается значительная роль наследственных факторов в патогенезе зависимости от алкоголя, в частности в виде биологической врожденной предрасположенности к развитию алкогольной зависимости (Анохина И.П., 1988,1994; Cloninger C.R.,1988; Walker R.D.,1996; Heath A.C.,2001). Данные классической генетики, в частности, результаты семейных исследовании и близнецового метода (Cotton N.S. ,1979; George F.R.,1989) убедительно показывают, что риск заболевания значительно повышается при наличии в роду больных алкоголизмом: у таких пациентов часто, хотя и не всегда, зависимость формируется стремительно и в раннем возрасте (Crabbe J.C.,1985; Goodwin D.W., 1984). При этом установлено, что закономерности наследования предрасположенности к зависимости от алкоголя не носят характера "менделевского" расщепления признаков, что заставляет предполагать вероятную поли-геннную природу заболевания.
Экспериментальный подход выявил факт разделения популяции животных на группы с противоположным отношением к алкоголю в условиях свободного выбора: только часть животных явно предпочитала алкоголь и усиленно потребляла его (Анохина И.П.,1994). Исследования на животных "чистых" линий, селекционный отбор которых велся на основе противоположных реакций на алкоголь, установили значительные врожденные особенности функционирования ряда нейрохимических систем у этих животных. (French Т.А.,1985,1993; Wand G.S.,1993; Lukas L.R.,1998; Sands S.A., 2000).
Все это позволяет говорить о существовании определенной биологической предрасположенности к развитию зависимости от алкоголя, которая носит врожденный характер и закреплена генетически. С биологической точки зрения врожденная предрасположенность понимается как комплекс генетически обусловленных особенностей нейрохимических систем мозга, благодаря которым при злоупотреблении алкоголем состояние алкогольной зависимости развивается очень быстро и протекает злокачественно. Изучение биологических механизмов формирования зависимости от алкоголя на протяжении последних сорока лет убедительно доказало, что функциональные изменения обмена дофамина (ДА) в мезолимбической системе головного мозга являются патогенетической основой зависимости от алкоголя. Впервые «дофаминовая гипотеза» патогенеза алкоголизма была сформулирована И.П. Анохиной (1975-1979).
Согласно этой гипотезе, состояние зависимости от алкоголя определяется специфическими сдвигами метаболизма дофамина (ДА), формируется нейрохимический «порочный круг» в структурах дофаминовой мезолимбической системы мозга, поддерживающий стремление больного к все новым приемам алкоголя.
Таким образом, с одной стороны, важным этиологическим фактором алкоголизма является генетически закрепленная, врожденная предрасположенность к развитию зависимости от алкоголя, с другой стороны, нейрохимической основой патогенеза алкогольной зависимости считают патологические изменения в структурах дофаминовой мезолимбической системы мозга.
Отправной точкой нашего исследования послужило предположение о том, что врожденная предрасположенность проявляется на уровне генома в виде неких структурных, а, следовательно, и функциональных, особенностей генов, контролирующих дофаминовую неромедиацию. Именно эти особенности обеспечивают такой уровень функционирования ДА системы, при котором встреча с алкоголем приводит к быстрому и необратимому развитию зависимости. Представляется вероятным, что до контакта с алкоголем или в состоянии длительной ремиссии после непродолжительного потребления, врожденные нейрохимические особенности существуют в состоянии субкомпенсации или неустойчивой компенсации, что позволяет организму нормально функционировать при достаточно стабильных условиях среды.
Ведущая роль в регуляции дофаминовой системы мозга принадлежит тирозингидроксилазе - ключевому ферменту биосинтеза катехолами-нов, что обуславливает особый интерес к гену этого фермента. Роль гена тирозигидроксилазы в патогенезе зависимости от алкоголя остается неизученной. Мы не обнаружили литературных данных по этому вопросу. Некоторые авторы (Ishiguro Н. et al., 1998; Kawada Y. et al.,1995) пытались выявить связь между структурой гена тирозингидроксилазы и алкоголизмом. Чаще всего изучалась недифференцированная, общая группа больных с диагнозом «алкоголизм» в сравнении с контрольной группой (Lobos Е.А., Todd R.D., 1997), несмотря на известную клиническую и, вероятно, патогенетическую неоднородность алкоголизма, что, на наш взгляд, и обусловило отрицательные результаты этих исследований.
Обзор литературы
Значительный вклад наследственности в патогенез алкоголизма признается многими исследователями (Goodwin D.W., 1985; Schuckit М.А., 1981,1996; Heath A.C.et al.,2001; de Wit H. et al, 1990; Gilligan S.B. et al., 1987; Jones R.W., 1972), однако клинические характеристики и диагностические критерии « наследственного» алкоголизма остаются невыявлен-ными.
В результате применения методов популяционной генетики человека (генеалогического, близнецового и метода изучения приемных детей), было показано, что у 40- 70% больных алкоголизмом выявляется алкоголизм среди родственников 1-й степени родства, а с учетом родственников 2-й степени родства доля «наследственного» алкоголизма возрастает еще на 5-10% (Cotton N.S.,1979; Goodwin D.W., 1985). Риск заболевания алкоголизмом у детей в семьях с наследственной отягощенностью алкоголизмом составляет 3-5% ( Goodwin D.W., 1985). При этом установлено, что частота встречаемости алкоголизма у детей, хотя бы один родитель которых болен алкоголизмом в 2-6 раз выше, чем у детей здоровых родителей. Вероятность заболевания еще более повышается в случае болезни обоих родителей (Hesslbrock V.M., 1985).
Конкордантность среди монозиготных (МЗ) близнецов по хроническому алкоголизму по сравнению с дизиготными близнецами (ДЗ) составила 58% (МЗ) и 28% (fl3)(Schuckit М.А., 1981), что служит весомым аргументом в пользу несомненной генетической компоненты в патогенезе заболевания. Характерно стремительное нарастание риска заболевания пробанда при повышении степени кровного родства больным алкоголизмом родственником. Так по данным Rounsaville B.J. (1987), риск заболевания алкоголизмом для монозиготного близнеца в 10 раз выше среднего по популяции, 33 % для дизиготного близнеца и только 12 % для внуков больного.
В работах Goodwin D.W. et al.( 1973,1974,1977) показано, что частота заболеваний алкоголизмом среди сыновей, чьи биологические родители страдали алкоголизмом, в 4 раза выше, чем у сыновей здоровых родителей. Оказалось, что этот показатель сохранялся и в случаях воспитания этих детей приемными родителями, что однозначно подчеркивает определяющую роль биологического, наследственного фактора.
Обнаружено, что частота алкоголизма среди полусибсов пробанда составляет 46-50% при наличии больного родителя и резко снижается (до 8-14%) при здоровых родителях. При сравнении полусибсов, имеющих или не имеющих биологического родителя-алкоголика, частоты составили 62 и 20% cootbetctbehho(Schuckit М.А. et al., 1972).
В то же время, многочисленные случаи заболевания алкоголизмом среди лиц, не имеющих больных алкоголизмом родственников, заставляют с осторожностью отнестись к проведению прямой зависимости между наследственной отягощенностью и алкоголизмом или пониманию наследственной отягощенности алкоголизмом как безусловной детерминанты непременного развития зависимости от алкоголя.
Особый интерес представляет тип наследования подверженности алкоголизму, анализ которого не выявляет «менделевских» закономерностей. С точки зрения популяционной генетики, алкоголизм, как сложный биологический признак, обладает высокой частотой встречаемости в популяции (до 10% для мужчин, до 3-5% для женщин), отличается разнообразием клинических форм, варьирующим возрастом манифестации, значительными половыми и возрастными различиями в популяционной частоте отдельных клинических форм. Кроме того, наблюдается относительно низкий уровень конкордантности среди монозиготных близнецов (менее 60%) и выраженное несоответствие закономерностей наследования классическим менделевским правилам. Совокупность этих свойств дает возможность отнести подверженность алкоголизму к так называемым «мультифакторно наследуемым» признакам (Crabbe J.C.et al., 1985; Gilligan S.B.et al.,1987). Многие авторы предполагают полигенный тип наследования подверженности алкоголизму, имея в виду вероятный вклад нескольких генов или их тандема в формирование высокого риска заболеваемости алкоголизмом (George F.R.et al., 1989; Soyka M.et al.,1996; Heath A.C. et al., 2001).
Знание упомянутых особенностей алкоголизма, как мультифактор-ного наследственного заболевания, заставляет уделять особое внимание индивидуальному изучению семейной истории пациента: числу больных алкоголизмом родственников, выраженности заболевания, а значит и тяжести течения болезни у пациента, что достижимо только при дифференцированном подходе к формированию экспериментальных групп. Разнообразие клинических форм алкоголизма, вероятно различимых и патогенетически, дает основание предполагать «полигенность» наследования в более широком смысле, когда близкая клиническая картина алкоголизма может быть сформирована особенностями разных генов или их сочетаний, каждое из которых обуславливает особые клинические нюансы при сохранении единого стержня - зависимости от алкоголя.
Материалы и методы
Экспериментальная часть работы выполнена на 80 нелинейных крысах-самцах (ср. вес 180-200гр.) , 50 мышах- самцах инбредных линий HAFT ( high acute functional tolerance) и LAFT( low acute functional tolerance), 20 мышах-самцах инбредных линий LS (long sleep) и SS (short sleep) (ср. вес 18-25rp). Животные выращивались и содержались в стандартных условиях. Все линейные животные были получены в питомнике Медицинской школы Университета штата Колорадо (г. Денвер. США).
Животные этих инбредных линий использовались в качестве экспериментальной модели врожденной предрасположенности к зависимости от алкоголя. Селекция линейных животных велась на основе различной, генетически детерминированной, реакции животных на алкоголь: для линий LS и SS - различное время сна животных после введения однократной дозы этанола из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно, для линий HAFT и LAFT - различное время восста-новления способности животного передвигаться по наклонной плоскости после повторной дозы этанола из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно.
При моделировании сформированной зависимости от алкоголя использовалась традиционная процедура хронической принудительной алкогольной интоксикации животных в течение 9 месяцев с последующим отбором в группы « предпочитающих» и «отвергающих» алкоголь животных в условиях свободного выбора. «Предпочитающие» алкоголь животные считались «условно зависимыми» от алкоголя. В процессе алкоголизации контрольная (20 животных) и опытная (60 животных) группы находились в одинаковых условиях содержания и питания в течение 9 месяцев. Опытная группа в качестве единственного источника жидкости получала 15% раствор этанола. После окончания периода алкоголизации проводился отбор по признаку предпочтения алкоголя воде: животные опытной группы были помещены в условия свободного выбора между 15% раствором этанола и водой. В течение 14 дней производились замеры потребления каждым животным объема воды или раствора этанола. Для отбора животных использовался коэффициент потребления этанола (КПЭ), представляющий собой отношение объема потребленного раствора этанола к общему объему потребленной жидкости. Животные, имеющие КПЭ 0,7 относили к группе «предпочитающих» этанол (ПЭ), группу «отвергающих этанол» (ОЭ) составили животные с КПЭ 0,1. Животные с промежуточными значениями КПЭ были исключены из дальнейшего исследования.
Функциональную активность гена ТГ в виде уровня экспрессии гена ТГ оценивали путем измерения уровня матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) для ТГ с использованием Northern Blot анализа индивидуально по каждому животному в следующих структурах головного мозга, замороженных на сухом льду: фронтальная кора головного мозга, средний мозг, гипоталямус, стриатум, locus ceruleus (LC). Выделение тотальной РНК проводилось гуанидин-тиоцианатным методом с фенол-хлороформной экстракцией. Аликвоты тотальной РНК, обычно в объеме 15 мкл, разделяли посредством горизонтального электрофореза. Полученные электрофореграммы использовали для блоттинга РНК путем капиллярной диффузии на мембраны " HYBOND-N (Amersham) в течение 12-14 часов с последующей гибридизацией - включением радиоактивных меченых зондов в структуру мРНК для ТГ. В качестве зонда использован синтетический олигонуклеотид отечественного производства, комплиментарный последовательности нуклеотидных пар участка мРНК для ТГ. В структуру олигонуклеотида вводили радиоактивную метку (альфа-32Р АТФ) посредством энзиматической реакции с ферментом терминальная трансфераза. После гибридизации мембраны экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 16-72 часов. Для количественного определения концентрации мРНК измеряли относительную оптическую плотность мест засветки рентгеновской пленки, соответствующую наличию радиоактивного зонда, связанного с мРНК для ТГ.
Для исследования динамики изменений уровня мРНК после однократной дозы этанола мыши получали инъекцию 15% раствора этанола в физиологическом растворе из расчета 3,75 г\кг веса внутрибрюшинно. Контрольная группа получала эквивалентный объем физиологического раствора. Животные забивались путем декапитации группами по 5 животных каждой линии через 2,4 и 6 часов после инъекции этанола.
Результаты исследования
Первой задачей экспериментальной части работы была попытка выяснить, является ли функциональная активность гена ТГ, определяемая в виде уровня его экспрессии, врожденным признаком и различна ли она у животных с генетически детерминированной реакцией на алкоголь. В результате экспериментов по изучению экспрессии гена ТГ в структурах мозга мышей линий LS и SS (Рис.1), обнаружено, что во фронтальной коре головного мозга уровень мРНК для ТГ у SS мышей более чем в 2 раза выше, чем у LS-мышей (р 0,05). Напротив, в стриатуме уровень мРНК для ТГ у SS-мышей снижен в 3 раза по сравнению с LS мышами (р 0,05). В гипоталямусе имеется значительная тенденция к повышению уровня мРНК для ТГ у SS мышей по сравнению с LS мышами.
Таким образом, уровень экспрессии гена ТГ у SS мышей повышен в мезолимбической ДА системе (фронтальная кора и гипоталямус) и снижен в нигростриальной (стриатум). В норадренэргической нейротрансмиттер-ной системе (LC) различий между линиями не обнаружено. Известно, что LS и SS мыши обладают одинаково нормально функционирующим ферментом ТГ с неизмененной относительной активностью, однако уровни дофамина и ДОФА в мозге SS мышей существенно отличаются от LS мышей (French Т.А., 1985,1989), особенно при воздействии этанола (Baizer L.,1981). French Т.А (1995) показал, что инъекция этанола вызывает более выраженное снижение относительной активности ТГ в тканях мозга LS мышей по сравнению с SS мышами, что может отражать изначально высокий уровень экспрессии гена ТГ у SS мышей и косвенно подтверждать наши данные. В экспериментах с мышами линий HAFT и LAFT было обнаружено (Рис.2), что во фронтальной коре головного мозга у LAFT-мышей уровень ТГ мРНК в 3 раза превышает таковой у HAFT-мышей (р 0,05), а в Locus ceruleus(LC) уровень ТГ мРНК у LAFT- мышей был в 3,5 раза выше, чем у HAFT- мышей (р 0,05, Рис.2). В гипоталямусе, напротив, уровень ТГ мРНК у LAFT- мышей снижен в 3 раза в сравнении с HAFT-мышами (р 0,05).Таким образом, уровень экспрессии гена ТГ у LAFT мышей повышен в мезолимбической ДА системе (фронтальная кора) и в норадре-нэргической нейротрансмиттерной системе (LC), но не изменен в нигро-стриальной ДА системе (стриатум).
Вторая задача экспериментальной части работы была направлена на изучение эффекта однократной дозы этанола на уровень экспрессии гена ТГ в структурах мозга животных с генетически детерминированной различной реакцией на алкоголь (линии мышей HAFT и LAFT, Рис.3). В результате однократной инъекции этанола во фронтальной коре головного мозга у LAFT мышей уровень мРНК для ТГ значительно снижается и составляет 37% от контроля через 2 часа, 14% от контроля через 4 часа и 24% от контроля через 6 часов после инъекции (р 0,05, Рис.ЗА). У HAFT-мышей этанол не влияет на уровень мРНК для ТГ, экспрессия остается стабильной через 2, 4 и 6 часов после инъекции. Аналогично, в Locus ceruleus (LC) через 2 часа после инъекции этанола уровень мРНК для ТГ у LAFT-мышей снижается до уровня 34% от контроля и различия с HAFT-мышами исчезают. Через 4 часа мРНК для ТГ остается сниженным - 49% от контроля, через 6 часов составляет 25% от контроля. Все изменения достоверны (р 0,05, Рис. ЗБ). Этанол снижал уровень мРНК для ТГ и в стриатуме, причем наблюдались однонаправленные изменения у обеих линий, значительно более выраженные у LAFT-животных: через 2 часа-15% от контроля, через 4 часа-19% от контроля, через 6 часов -11% от контроля (р 0,05 для всех временных точек, Рис. ЗВ). У HAFT-животных также обнаружено снижение данного показателя, но статистически недостоверное.
В гипоталямусе исходно низкий уровень ТГ мРНК у LAFT- животных через 2 часа после инъекции этанола незначительно возрастает и только через 4 часа после инъекции существенно снижается до уровня 13% от контроля(р 0,01,Рис.ЗГ), через 6 часов остается сниженным и достигает 40% от контроля. Интересно, что только в гипоталямусе обнаруживается реакция уровня экспрессии гена ТГ у HAFT-мышей на введение этанола. Исходно высокий, через 2 часа уровень экспрессии гена ТГ остается стабильным, и только через 4 часа после инъекции этанола также снижается и составляет 10% от контроля, через 6 часов составляет 21 % от контроля (р 0,05 для всех временных точек). Обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на обратное соотношение как исходных уровней экспрессии гена ТГ, так и динамических изменений экспрессии в гипоталямусе, результатом разнонаправленных изменений уровня мРНК для ТГ является исчезновение различий между линиями по этому показателю (Таб.4).
Таким образом, врожденные различия в уровне экспрессии гена ТГ в структурах мозга животных с генетически детерминированным отношением к этанолу исчезают после введения однократной дозы этанола в основном за счет снижения врожденного высокого уровня экспрессии и не проявляются вновь в течение, по крайней мере, 6 часов. Marcel D.et al (1998) показали, что применение препарата RU 24722, вызывающего длительное повышение экспрессии гена ТГ, приводит к " выравниванию" уровней экспрессии гена ТГ в ДА структурах мозга между линиями мышей С57 (условно «зависимые» от алкоголя) и DBA (условно «независимые» от алкоголя) за счет изменений на уровне транскрипции.
