Введение к работе
Актуальность проблемы
Спустя несколько десятилетий интенсивных исследований и попыток разработать эффективные методы терапии рака, смертность от рака продолжает расти. В связи с этим усилия многих исследовательских групп по всему миру направлены на поиск новых способов лечения рака. Использование генной терапии в противоопухолевой медицине является одним из наиболее активно развивающихся, и кажущееся перспективным для создания противоопухолевых препаратов, направлений, в основе которого лежит доставка генов терапевтического вмешательства в клетки опухолей. При данном подходе создается возможность специфического воздействия противоопухолевого агента только на раковые клетки, за счет чего можно значительно снизить токсичность и побочные эффекты по сравнению с химио- и радиотерапией. Метод позволяет воздействовать и на дефектные гены, изменение экспрессии которых приводит к развитию заболевания.
Одним из главных требований, предъявляемых к генно-терапевтическому препарату, является высокий уровень экспрессии гена терапевтического вмешательства в клетках-мишенях, который определяется его регуляторными элементами - промоторами. Наиболее сильными среди изученных промоторов являются конститутивные вирусные промоторные системы, например, промотор ранних генов цитомегаловируса. Прямое использование таких промоторов для регуляции экспрессии трансгена в опухоли эффективно, но имеет серьезный недостаток – неспецифичность экспрессии, что приводит к токсичности терапевтического препарата для нормальных клеток и тканей.
Специфически «включить» экспрессию гена терапевтического вмешательства в клетках опухоли можно с помощью опухолеспецифических промоторов или промоторов, отвечающих на изменения условий, характерных для клеток опухоли (например, состояние гипоксии при твердых опухолях человека). Активность опухолеспецифического промотора ограничена раковыми клетками, то есть, экспрессия гена, направляемого таким промотором, наблюдается только в клетках опухоли. Спектр опухолеспецифических промоторов, известных на сегодняшний день, достаточно широк и частично отображает разнообразие видов рака. Большинство таких промоторов имеет специфичность только к определенным типам опухолей, что ограничивает их использование и сильно сужает рамки их применения. Обнаружено и исследовано несколько более универсальных промоторов, которые активны в большинстве опухолевых клеток. К ним относятся промоторы гена сурвивина человека (BIRC5) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT). Однако, многие из этих промоторов ингибируются активным белком р53, который сохраняет активность во многих типах опухолей.
Существенным недостатком всех опухолеспецифических промоторов является их низкая активность, повысить которую можно несколькими способами: изменить состав регуляторных элементов внутри такого промотора или использовать индуцибельные двухстадийные (бинарные) системы, позволяющие специфически экспрессировать ген терапевтического вмешательства на высоком уровне в опухолевых клетках. Примером бинарной системы регуляции экспрессии является Tat-TAR-система вируса иммунодефицита человека. В ее основе лежит способность белка tat трансактивировать промотор LTR ВИЧ-1 после взаимодействия с TAR-элементом вируса. В данной работе разработана векторная система, позволяющая использовать Tat-TAR-систему повышения активности промотора LTR ВИЧ-1 для усиления опухолеспецифической экспрессии генов терапевтического вмешательства в раковых клетках. Показано, что эффективность полученной системы не зависит от статуса белка p53 в клетках.
Цели и задачи работы
Цель данной работы заключалась в создании универсальной системы, позволяющей специфически усиливать активность опухолеспецифических промоторов.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
1. Создать бинарную систему, позволяющую оценить способность Tat-TAR-системы ВИЧ-1 усиливать экспрессию генов в клетках человека.
2. Получить систему, в которой ген tat находится под контролем опухолеспецифического промотора, а ген терапевтического вмешательства - под контролем TAR-элемента ВИЧ-1. На опухолевых клеточных линиях человека проверить эффективность полученной системы.
3. Провести сравнительный анализ активности разработанной системы и сильного неспецифического вирусного промотора.
4. Определить, влияет ли на эффективность полученной системы p53-статус трансфицируемых клеток.
5. Проверить функциональность разработанной системы в генной терапии рака, основанной на использовании ген-опосредованного внутриопухолевого превращения протоксина в токсин (gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT).
Научная новизна и практическая значимость работы
В данной работе была предложена система на основе Tat-TAR-взаимодействия ВИЧ-1 и опухолеспецифического промотора, позволяющая индуцировать высокий уровень экспрессии трансгена в опухоли. Эффективность разработанной системы сравнима с эффективностью промотора ранних генов цитомегаловируса и более чем в 100 раз выше эффективности опухолеспецифических промоторов. На примере гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk) был показан потенциал разработанной системы для терапии рака, а именно, специфическое подавление роста опухолевых клеток, независимо от их p53-статуса.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на российских конференциях: II международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009).
Объем работы
Диссертационная работа изложена на 95 страницах, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждений, основных выводов и списка литературы из 285 наименований. Диссертация содержит 6 таблиц и 27 рисунков.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы.
