Введение к работе
Актуальность исследования
Взаимодействие вируса и хозяина является сложным процессом, в который, так или иначе, вовлекаются практически все системы организма, хотя их роль в инфекционном процессе неравноценна. Современный уровень знаний позволяет говорить о том, что ведущую роль в защите организма от вирусов играет иммунная система. Эффективность индукции и динамика иммунного ответа во многом определяют развитие и исход заболевания.
В этой связи крайне актуальной задачей является поиск и оптимизация применения иммунокоррегирующих и вакцинных препаратов с лечебной и профилактической целями. Очевидно, что в процессе решения этой задачи важно иметь хорошую математическую модель или экспертную систему, которая позволяла бы быстро оценивать воздействие иммуномодуляторов, оптимизировать их дозу и схему применения в зависимости от характера развития инфекционного процесса. Считается, что в основе эффективно работающей экспертной системы могут лежать методы системной биологии, в том числе методы математического моделирования инфекционного процесса и системы иммунитета, а также методы проектирования противовирусных препаратов и вакцин.
Учитывая сложность системы взаимодействия «вирус + хозяин», предсказание развития инфекции в зависимости от влияния той или иной динамической характеристики вируса, реакции иммунной системы или состояния неспецифических механизмов защиты представляется возможным только при наличии адекватной (имитационной) динамической модели, удовлетворительно описывающей поведение вируса в организме. Поэтому для решения как фундаментальных, так и прикладных задач в различных областях биологии и медицины, чрезвычайно актуальной задачей является создание имитационных математических моделей целевых биологических систем «вирус + хозяин».
В данной работе технология математического моделирования использовалась для анализа механизмов противовирусного иммунитета при инфекциях, вызывающих социально значимые заболевания, среди которых особую роль занимают вирус гриппа
(ВГ) и вирус иммунодефицита I типа (ВИЧ-1), обладающие высокой антигенной изменчивостью.
В силу очень высокой изменчивости вируса гриппа, защитные барьеры организма не всегда справляются с данной инфекцией, поэтому вирус периодически вызывает эпидемии и пандемии и может приводить к высокому уровню летальных исходов. В последнее время интерес к исследованию ВГ значительно возрос в связи с возникновением нового высоко патогенного штамма H5N1 вируса гриппа птиц и опасностью его перехода в популяцию людей [Claas et ah, 1998]. Среди выявленных случаев заражения человека этим вирусом смертность составила более 50% ( influenza/en/). Постоянная угроза возникновения новых, высоко патогенных для человека штаммов ВГ требует разработки новых нетрадиционных методов лечения. Математическое моделирование жизненного цикла вируса гриппа в инфицированной клетке дает основу для исследования закономерностей его размножения и поиска таких методов лечения.
Одним из важных факторов неспецифического противовирусного иммунитета является интерферон (IFN). Развитие и результат инфекции предопределяются эффективностью индукции интерферона, а также его антивирусной и иммуномодулирующей активностями. Исследование молекулярных механизмов индукции и антивирусного действия интерферона представляется актуальным для лучшего понимания регуляции и функционирования системы интерферона. От этого зависит успешное использование интерферона и его индукторов в качестве лечебно-профилактических препаратов при вирусных инфекциях и некоторых других патологических состояниях. Сложная сеть взаимоотношений в системе вирус-интерферон в определенных ситуациях делает трудным прямой экспериментальный анализ вклада индивидуальных механизмов в регуляцию системы. В связи с этим актуальным становится проведение теоретического анализа закономерностей индукции и действия интерферона и использование для этих целей технологии математического моделирования с прогнозирующими возможностями компьютерного эксперимента.
ВИЧ-1 является этиологическим возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). После открытия в 1983 году ВИЧ-1 это заболевание продолжает распространяться по всему миру, охватывая как развитые, так и в развивающиеся страны.
Важным фактором специфической защиты организма от вирусов является индуцируемый вакциной противовирусный иммунитет. Однако в случае ВИЧ-инфекции известные стратегии создания вакцины, основанные на использовании различных форм вирусного антигена, оказались неэффективными. Разработка безопасной и эффективной анти-ВИЧ/СПИД вакцины затруднена из-за наличия ряда факторов, среди которых высокая генетическая вариабельность ВИЧ-1, недостаток знаний иммунных механизмов защиты, отсутствие адекватных и предсказуемых моделей и сложность проведения эффективных испытаний, особенно в развивающихся странах. Кроме того, неудачи сначала вакцины VaxGen (октябрь 2003 г.), а затем вакцины MRKAd5 HIV-1 gag/pol/nef (октябрь 2007 г.) еще более осложнили ситуацию с разработкой вакцины против ВИЧ-1. Необходимо преодолевать существующие проблемы и создавать вакцину, способную индуцировать как Т-, так и В-клеточный ответы против широкого спектра изолятов ВИЧ-1. При этом необходимо основной упор делать на разработку новых технологий, концепций и подходов к созданию безопасных и эффективных вакцин против ВИЧ/СПИД, учитывая особенности иммунитета и патогенеза ВИЧ-1.
В связи с этим особенно актуальными становятся работы по рациональному дизайну вакцин с применением методов биоинформатики, системной биологии и математического моделирования.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы явилось проведение комплексного теоретического исследования специфических и неспецифических механизмов противовирусного иммунитета с использованием методов системной биологии. Для достижения этой цели решались следующие задачи.
-
Изучение закономерностей функционирования сложных биологических систем с использованием технологии математического моделирования путем анализа альтернативных механизмов регуляции этих систем и интерпретации полученных результатов;
-
Построение математической модели, позволяющей анализировать ключевые звенья в регуляции основных стадий внутриклеточного размножения вируса гриппа, которые являются потенциальными мишенями для действия противовирусных препаратов.
-
Построение математической модели, позволяющей анализировать ключевые звенья регуляции и функционирования интерфероновой системы;
-
Построение математической модели регуляции иммунного ответа при вирусной инфекции для выявления потенциальных мишеней для действия противовирусных препаратов, а также для анализа эффективности применения вакцин при иммунизации против ВИЧ-1;
-
Разработка новых подходов к созданию эффективных и безопасных вакцин против ВИЧ-1, индуцирующих высокие уровни ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ CTL или ЦТЛ), на основе оптимизации экспрессии, процессинга и представления иммунной системе целевого иммуногена;
-
Дизайн и конструирование новых искусственных поли-СТЪ-эпитопных иммуногенов - кандидатов для использования в качестве эффективной и безопасной ДНК-вакцины против ВИЧ-1.
Научная новизна и практическая значимость работы
В данной работе впервые проведено комплексное теоретическое исследование механизмов противовирусной резистентности с использованием системного подхода и комплекса имитационных математических моделей, описывающих процессы регуляции инфекционного процесса и системы противовирусного иммунитета на молекулярно-генетическом, клеточном и организменном уровнях. Численное исследование моделей позволило получить ряд новых знаний об особенностях регуляции инфекционного процесса и системы противовирусного иммунитета при инфекциях, вызываемых вирусом гриппа и ВИЧ-1.
Обоснованы наиболее принципиальные механизмы регуляции селективной экспрессии генов ВГ в течение его внутриклеточного размножения.
Впервые проведено комплексное исследование закономерностей регуляции экспрессии и противовирусного действия интерферона с помощью набора математических моделей, описывающих процессы регуляции различных звеньев системы интерферона на молекулярно-генетическом и клеточном уровнях. Сделан ряд заключений о ключевых механизмах индукции и действия интерферона.
С помощью математической модели регуляции иммунного ответа при ВИЧ-инфекции показано, что проблемы создания вакцины против ВИЧ-1 могут быть обусловлены не столько высокой изменчивостью ВИЧ-1, сколько его иммунопатогенными свойствами. Фактически полученные в рамках модели результаты указывают на то, что рациональный дизайн вакцин должен учитывать как механизмы иммунитета, так и механизмы иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции.
Разработан новый подход к созданию эффективных и безопасных вакцин против ВИЧ-1 для индукции высоких уровней ответов CD8+ CTL на основе оптимизации экспрессии, процессинга и представления иммунной системе целевого иммуногена. Эффективность подхода подтверждена экспериментально. Полученные данные вносят вклад в рациональное проектирование вакцин, способных индуцировать стабильно высокие уровни ответов CD8+ CTL на все включенные детерминанты.
Сконструированный в данной работе полиэпитопный Т-клеточный иммуноген TCI является ДНК-вакцинным компонентом двух созданных во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД «Сал-ВИЧ Д» и «КомбиВИЧвак». В настоящее время проведены доклинические испытания кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «Сал-ВИЧ Д». Показано, что обе вакцины индуцируют формирование ВИЧ-специфического гуморального и клеточного ответов и не оказывают негативного воздействия на функцию основных физиологических систем организма. Полученные при иммунизации животных сыворотки обладали вируснейтрализуюіцей активностью in vitro.
Положения, выносимые на защиту
Предметом защиты настоящей диссертации является комлекс математических моделей, описывающих процессы регуляции инфекционного процесса и системы противовирусного иммунитета на молекулярно-генетическом, клеточном и организменном уровнях, а также искусственные полиэпитопные иммуногены -кандидаты для использования в качестве ДНК-вакцины против ВИЧ-1.
Используя технологию математического моделирования, в работе получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.
Ранняя амплификация фрагментов генома вируса гриппа, кодирующих нуклеопротеин и неструктурный белок NS1, связана с действием белка NS1, а поздняя амплификация фрагментов, кодирующих гемагглютинин, нейраминидазу и матриксный белок, обусловлена действием белка NS2;
В основе индукции экспрессии гена интерферона лежит антирепрессорная модель, согласно которой лимитирующей стадией индукции промотора интерферона является удаление конститутивных репрессоров;
Интерферон и вирус вызывают синергическое повышение регуляции экспрессии белка Mxl, что является важным фактором противовирусной резистентности.
Рациональный дизайн вакцин должен учитывать как механизмы иммунитета, так и механизмы иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции, поскольку проблемы создания вакцины против ВИЧ-1 обусловлены как высокой изменчивостью ВИЧ-1, так и его иммунопатагенными свойствами.
Обеспечение высоких уровней CD8+ CTL ответов можно достигнуть путем оптимизации основных стадий процессинга целевого поли-СТЪ-эпитопного иммуногена и представления полученных эпитопов иммунной системе.
Апробация работы и публикации
Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: Международном симпозиуме "HIV Vaccines: Progress and Prospects" (Банфф, Канада, 2008); Международном рабочем совещании "Статус исследования вакцин против ВИЧ\СПИД: перспективы и потенциал развития ВИЧ вакцины" (Санкт-Петербург, 2007); Международной конференции "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2006); 3-й и 5-й Международной конференции "Bioinformatics of Genome Regulation and Structure" (Новосибирск, 2002, 2006); XVI Международной конференции по СПИД (Торонто, Канада, 2006); Международной конференции " Biotechnology and Medicine " (Москва, 2006); Первом Российско-Немецком рабочем совещании "Infection and Immunity. Tools and Strategies for Novel Vaccines" (Берлин, Германия, 2005); Международной конференции "New Approaches to Vaccine Development
- From the bench to the field" (Берлин, Германия, 2005); Международной конференции
"Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных
заболеваний" (Новосибирская область, 2004); Международной конференции
"International Informatics and Biotechnology Convergence" (Лондон, Англия, 2004); 11-й и
13-й Межународном симпозиуме "HIV and Emerging Infection Diseases" (Тулон, Франция,
2001, 2004); X Юбилейном Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство"
(Москва, 2003); 7-й, 8-й и 10-й Международной конференции "СПИД, РАК И
РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт Петербург, 1998, 2000, 2002); Международной
конференции "DNA vaccines" (Эдинбург, Шотландия, 2002); Английско-Российском
семинаре по биотехнологии "Policy Issues, International Partnerships & Commertial
Opportunitis" (Эдинбург, Шотландия, 2001); Международной конференции "The
Increasing Threat of Infectious Diseases'01" (Стокгольм, Швеция, 2001); 5-й
Международной конференции по молекулярной биологии (Москва, 2001); IV Семинаре
Научного совета МНТЦ по фундаментальным наукам (Новосибирск, 2001); Международной конференции "Оценка спонсируемых биологических исследований в России в новом тысячелетии" (Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 1999.); Ежегодной конференции ISICR (International Society for Interferon & Cytokine Research) (Балтимор, США, 1995. Первой, Второй и Третьей Всесоюзных конференциях "Геном человека" (Москва, 1990, 1991 и 1993);
Благодарности
Работа выполнена в 1991-2007 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ: "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего", по проекту МНТЦ №2153р "Дизайн, конструирование и биологическое тестирование ДНК-вакцины против ВИЧ-1, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1". На разных этапах выполнения работы в ней приняли участие В.А. Лихошвай, В.В. Чуйков, О.Е. Белова, П.А. Белавин, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также A.M. Ерошкин, СВ. Серегин, Н.К. Данилюк, И.Н. Бабкина, Л.И. Карпенко, Р.В. Ужаченко, Т.Н. Ильичева, А.А. Ильичев, Г.М. Игнатьев, В.А. Иванисенко, Е.А. Ананько, Т.М. Хлебодарова, Н.А. Кашеварова -автор приносит им искреннюю благодарность.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 34 статьи, получено 3 патента Российской Федерации.
Структура и объем работы
Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы (427 ссылок) и двух приложений. Каждая глава содержит обзор литературы, основные результаты и заключение, посвященные теме исследования данной главы. Работа изложена на 317 страницах, включая 64 рисунка и 28 таблиц. Нумерация рисунков, таблиц и формул приводится отдельно для каждой главы.
