Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы 14
1.1. Насекомые 14
1.2. Энтомопатогенные микроорганизмы и методы заражения насекомых. 15
1.3. Приборы и реактивы. 17
1.4. Исследование зараженных тканей насекомых. 18
1.5. Отбор гемолимфы и приготовление гомогенатов внутренних органов 19
1.6. Определение активности и спектра неспецифических эстераз, активности глутатион-Б-трансферазы . 20
1.7. Определение продукции активированных кислородных метаболитов 22
1.8. Определение активности супероксиддисмутазы и концентрации тиолсодержащих соединений. 24
1.9. Определение паттерн-распознаюших белков 24
1.9.1. Определение агглютинрующеи активности гемолимфы капустной совки. 24
1.9.2. Определение паттерн-распознаюших белков в гемолимфе большой вощиной моли. - 26
1.10. Определение белка 26
1.11. Статистическая обработка
экспериментальных данных. 27
Глава 2. Генерация активированных кислородных метаболитов у насекомых и ее изменение при различных патогенезах . 28
2.1. Источники и основные свойства АКМ. 29
2.1.1. Строение и свойства АКМ. 29
2.1.3. Источники АКМ в организме 34
2.1.4. Фенолоксидазоактивирующая система 37
2.2. Методические подходы при изучении активированных кислородсодержащих метаболитов .48
2.2.1. Люминол-зависимая хемилкзминесценция 49
2.2.2. Метод восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) 52
2.2.2.1. Влияние активаторов фагоцитоза на восстановление нитро-синего тетразолиевого в гемоцитах насекомых. 58
2.2.2.2. Влияние ингибиторов на восстановление НСТ в гемоцитах насекомых. 69
2.2.3. Метод спиновых ловушек. 78
2.3. Генерация активированных кислородных метаболитов при различных патогенезах. 87
2.3.1. Образование АКМ при микроспоридиозе насекомых..88
2.3.1.1. Влияние микроспоридиоза на фенолоксидазную активность гемолимфы. - 92
2.3.1.2. Влияние микроспоридиоза на восстановление нитросинего тетразолия в гемоцитах личинок G. mellonella 97
2.3.1.3. Окисление СР-Н гемолимфой личинок G. mellonella при микроспоридиозе 99
2.3.2. Изменение продукции АКМ насекомых при бактериозах. 104
2.3.2.1. Изменение продукции АКМ при инъекции бактерий в гемоцель насекомых. 105
2.3.2.2. Изменение продукции АКМ у личинок G. mellonella в течение бактериоза 115
2.3.3. Изменение продукции АКМ насекомых при микозах.. 120
2.3.4. Заключение 125
Глава 3. Детоксицируюшие ферменты насекомых . 128
3.1.1. Микросомальные монооксигеназы. 130
3.1.2. Неспецифические эстеразы насекомых. 131
3.1.3. Глутатион-3-трансферазы. 134
3.1.4. Факторы, влияющие на активность детоксицирующих ферментов 136
3.2. Изменение активности детоксицирующих ферментов насекомых при патогенезе 138
3.2.1. Влияние микроспоридиоза на спектр и активность неспецифических эстераз 139
3.2.1.1. Изменение активности и спектра эстераз гемолимфы G. mellonella 139
3.2.1.2. Изменение активности и спектра эстераз жирового тела G. mellonella 143
3.2.1.3. Изменение активности и спектра эстераз среднего кишечника личинок G. mellonella 144
3.2.1.4. Типирование неспецифических эстераз 152
3.2.1.5. Влияние микроспоридиоза на активность глутатион-Б-трансфераз 155
3.3. Влияние микозов на спектр и активность неспецифических эстераз 161
3.3.1. Типирование неспецифических эстераз при микозах.178
3.3.2. Влияние микозов на спектр и активность глутатион-S- трансфераз и микросомальных монооксигеназ 183
3.3.4. Изменение чувствительности G.mellonella к инсектицидам при микозах. 186
3.5. Влияние кристаллообразуюших бактерий на спектр и активность неспецифических эстераз личинок большой вощиной моли. 189
3.5. Заключение 195
Глава 4. Антиоксидантная система насекомых . 197
4.1. Ферментативные антиоксиданти. 197
4.2. Неферментативные антиоксиданты. 204
4.3. Активность антиоксидантов в тканях личинок G. mellonella при различных заболеваниях . 207
4.3.1. Влияние микроспоридиоза на активность супероксиддисмутазы, 207
4.3.2. Изменение концентрации тиолсодержащих соединений в гемолимфе G. mellonella при микроспоридиозе 214
4.3.3. Уровень и активность антиоксидантов в кишечнике личинок G. mellonella при перроральном инфицировании бактериями Bacillus thuringiensis ssp.galleriae 218
4.4. Заключение. 225
Глава 5. Паттерн-распознающие белки насекомых. 226
5.1. Агглютинины капустной совки. 232
5.2. Паттерн-распознающие белки большой вощиной огневки. 240
Заключение 246
Выводы. 255
Список литературы 255
- Определение активности и спектра неспецифических эстераз, активности глутатион-Б-трансферазы
- Методические подходы при изучении активированных кислородсодержащих метаболитов
- Изменение активности детоксицирующих ферментов насекомых при патогенезе
- Активность антиоксидантов в тканях личинок G. mellonella при различных заболеваниях
Введение к работе
В окружающей среде существует большое количество различных микроорганизмов, а также многоклеточных организмов, способных поражать насекомых. Вполне закономерно, что у данной группы животных формируются эффективные системы, препятствующие проникновению в организм различных чужеродных агентов, способных их элиминировать и нейтрализовать токсичные продукты жизнедеятельности паразитов. В первую очередь сюда следует отнести различные покровы насекомых - кутикулу и перитрофическии матрикс. Однако многие патогены способны проникать через эти покровы. Тогда на первый план при формировании защиты организма насекомых выступают такие системы, как профенолоксидазная, клеточная, агглютинирующая, коагулирующая и антибактериальная системы [Nappi, Vass, 1993; Hultmark, 1996/1998; Nappi, Ottaviani, 2000; Lavine, Strand, 2002; Yu et al., 2002;Parrinello et al., 2003]. Как правило, активизация и взаимодействие данных систем с проникшим в гемоцель агентом происходит одновременно и при взаимодействии различных компонентов этих систем. В ряде случаев активизация одного из звеньев системы может привести к активизации ряда компонентов из других систем. Кроме того, существенное значение в процессах иммунного ответа насекомых приобретают детоксицирующие и антиоксидантные системы [Ahmad, 1992; Seslija et al., 1999; Rogina, Helfand, 2000]. Последние нейтрализуют и элиминируют как вторичные продукты метаболизма патогенных микроорганизмов, так и непосредственно продукты жизнедеятельности собственных клеток, которые могут образовываться при возникновении и течении ряда заболеваний (так называемые эндобиотики).
При активации профенолоксидазного каскада образуется большое количество кислородсодержащих радикалов и, как следствие - активированных кислородных метаболитов (АКМ), которые активно могут вовлекаться в механизмы элиминации чужеродных агентов. Предполагается, что основным кислородсодержащим радикалом в этих каскадных реакциях является семихинон [Nappi, Vass, 2002; Sugumaran, 2002], но к настоящему времени прямой регистрации данного соединения не было проведено в гемолимфе насекомых. Все выводы были сделаны по косвенным данным. Практически отсутствуют данные по изменению генерации АКМ при различных патогенезах, в течение которых может существенно изменяться баланс АКМ и антиоксидантной системы. Кроме того, существуют спорадические работы по изменению детоксицирующей системы насекомых при различных заболеваниях. Отсутствуют данные об изменениях уровня генерации АКМ, антиоксидантной и детоксицирующей системы в различных органах насекомых. Не исколючено, что уровень и активность компонентов вышеперечисленных систем будет существенно меняться в течение различных инфекций в организме насекомых. Нет данных по влиянию паттерн-распознаюших белков на активность гемоцитов и на генерацию АКМ в этих клетках. В результате практически отсутствует общие представления о взаимодействии этих систем при проникновении различных паразитов в организм насекомого.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное изучение основных механизмов конституционального иммунитета и их изменений в организме насекомых под влиянием различных заболеваний.
Для успешного выполнения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить генерацию активированных кислородных метаболитов у насекомых и ее изменение при различных патогенезах.
2. Исследовать влияние патогенов на изменение спектра и активности детоксицируюших ферментов.
3. Изучить влияние патогенов на активность ферментативных и неферментативных антиоксидантов.
4. Исследовать паттерн-распознающие белки насекомых и их участие в активации систем, продуцирующих активированные кислородные метаболиты.
Научная новизна. В работе впервые приводятся данные по свободно-радикальному окислению в организме насекомых. С использованием ряда современных модифицированных методик обнаружен полухиноновый радикал в каскаде реакций меланогенеза. Впервые при исследовании генерации активированных кислородных метаболитов (АКМ) в гемоцитах выявлено, что активация продукции АКМ происходит в результате адгезии и фагоцитоза. Продукция АКМ в гемоцитах осуществляется в результате деятельности ферментов дыхательной цепи и каскада реакций меланогенеза. Показано, что при бактериозе, микозе и микроспоридиозе происходит супрессия продукции АКМ в гемолимфе.
Впервые изучено изменение спектра и активности неспецифических зстераз и глутатион-Б-трансфераз, супероксиддисмутазы у насекомых при бактериозах, микозах и микроспоридиозах. Впервые показана экспрессия дополнительных изоформ эстераз и повьшение активности эстераз в гемолимфе насекомых при ранении, микозах и микроспоридиозах. При экспрессии дополнительных изоформ эстераз резко повышается устойчивость насекомых к ряду инсектицидов.
Впервые выявлены изменения в активности антиоксидантнов в различных органах насекомых при патогенезах. Показано, что паттерн-распознаюшие белки (агглютинины и адгезивные белки) способны усиливать ряд клеточных реакций с участием гемоцитов, которые являются ключевыми в клеточном иммунитете насекомых. Проводится анализ взаимодействия систем генерации АКМ, агглютинирующей, антиоксидантной и детоксицирующей при формировании иммунитета насекомых.
Практическая ценность. Выяснение взаимоотношений компонетов различных систем конститутционального иммунитета позволяет прогнозировать течение ряда широкораспространенных инфекций насекомых. Разработаны подходы для оценки состояния клеточного иммунитета как интегральной характеристики состояния организма насекомых. Данная оценка может позволить проводить прогноз динамики численности насекомых в природных популяциях. Выявлены факторы, обусловливающие синергизм биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов и химических инсектицидов, предложены оригинальные методы к созданию новых препаративных форм биопрепаратов.
Материалы диссертации используются при чтении курсов лекций по физиологии насекомых, патологии насекомых, биологическим средствам зашиты растений в Новосибирском и С-Петербургском Агроуниверситетах, Томском государственном университете. Материалы были также использованы при подготовке коллективной монографии «Патогенны насекомых: структурные и функциональные аспекты», изданной в 2001 г. в рамках федеральной президентской программы «Интеграция».
Основные положения, выносимые на защиту.
I. Основными активированными кислородными метаболитами гемолимфы, участвующими в формировании резистентности насекомых, являются семихиноны, производные тирозина, а в гемоцитах - семихиноны и продукты дыхательной цепи. Характер изменений в продукции активированных кислородных метаболитов при патогенезах меняется в зависимости от вида патогена и его стадии развития.
II. Существенную роль при элиминации паразита и детоксикации его метаболитов играют неспецифические эстеразы, экспрессия которых происходит на первых этапах инфицирования насекомого, что приводит к повышению резистентности насекомых к ксенобиотикам, в частности - к инсектицидам.
III. В механизмах детоксикации и элиминации метаболитов патогенов существенную роль играют ферментные и неферментные антиоксиданты, изменение уровня и активности которых зависит от типа патогенеза.
IV. В активации клеточного иммунитета большое значение имеют паттерн-распознающие белки, способные вызывать клампообразование, распластывание и дегрануляцию гемоцитов. Данные белки способны взаимодействовать с высокореакционными активированными метаболитами за счет тиоловых комопонентов, входящих в их состав. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территории" (Курган, март 1998), на конференции "Паразиты в природных комплексах и рисковые ситуации" (Новосибирск, июнь 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе (Чехия, август 1998), конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь,1998), на ежегодном координационном совещании (Annual Coordination Workshop US AID CDR/CAR and INTAS European Union, Ben Gurion, Israel, april-may, 1999), на Международном симпозиуме "Сохранение и защита горных лесов" (Ош, октябрь 1999), на шестом Международном симпозиуме «Chemical and biological mechanisms in susceptibility to and prevention of environmental diseases» (Paris, Universite Rene Descartes, July, 2000), на шестом Международном симпозиуме «Spip Traps, Nitroxides and Nitric Oxide: Spectroscopy, Chemistry and free Radical Biology» (Marseille, France, August, 2000), на XII съезде Русского Энтомологического общества (Санкт-Петербург, август 2002), на VII Европейском энтомологическом конгрессе (Греция, октябрь 2002), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Е.В.Талалаева, (Иркутск, 2002), на первой Международной школе-семинаре «Кровососущие насекомые - переносчики трансмиссивных заболеваний» (Москва, октябрь, 2002), на междунароной конференции «Физика и элементарные химические процессы» (VI Voevodsky Conference, «Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes», Новосибирск, июль, 2002), на отчетных сессиях ИСиЭЖ СО РАН (1994, 1996, 1998, 2000, 2002), на заседаниях микробиологического общества (2000, 2002) .
Публикации. Основные материалы изложены в 24 научных работах, опубликованных в центральных российских и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 82 рисунка. Работа состоит из введения, описания материалов и методов, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы.
Благодарности. Автор глубоко признателен своим учителям Н.В.Васильеву, Шарапову В.М., Лужковой А.Г., Панковой Т.Ф., Кривец С.А. за всестороннюю поддержку, неоценимые советы, терпимость и доброжелательность. Признателен коллективу лаборатории патологии насекомых ИСиЭЖ СО РАН за поддержку и помощь в проведении экспериментальных работ, Исси И.В. и Соколовой Ю.Я. за конструктивную критику и помощь в исследованиях микроспоридий, Слепневой И. А. и Комарову Д. А. за бесценные советы, обсуждение и конструктивную критику, за постановку ряда экспериментальных работ.
Определение активности и спектра неспецифических эстераз, активности глутатион-Б-трансферазы
Множественные формы зстераз выявляли в 7.5% полиакри-ламидном геле с использованием трис-глицинового буфера (рН 8.0) [Laemmli, 1970] с 0.1% тритоном Х-100. По окончании электрофореза гель инкубировали в субстрате, содержащем 50 мл ФБ, 5 мг 1-нафтилацетата, 10 мг 2-нафтилацетата, 5 мг 1-нафтилпропионата и 25 мг прочного синего РР [Корочкин и др., 1977]. Инкубацию геля в субстрате проводили в темноте при 28 С в течение 15 мин. Эстеразы, гидролизующие 1-нафтилацетат и 1-нафтилпропионат, представляли собой полосы черного цвета на окрашенной электрофоретической пластинке.
Полосы эстераз, окрашенные в красный цвет, гидро-лизовали 2-нафтилацетат [Lapenta et al., 1995]. Для типирования неспецифических эстераз гемолимфы G. mellonella использовали фосфорорганические соединения (1 мМ метафос, 10 7- 10 5 М диазоксон), соли тяжелых металлов (1 мМ сульфат меди), 1 мМ эзерин и 7 мМ фторид натрия [Филиппович, Коничев, 1987; Yefimenko et al., 2001]. Ингиби-рование проводили путем предварительной инкубации геля в растворе с ингибиторами в течение 30 мин при 4 С, после чего гель помещали в раствор субстрата для выявления эсте-разных зон. В качестве контроля использовали гель, который предварительно инкубировали в ФБ при тех же условиях. Спектрофотометрическое определение активности эстераз в гемолимфе и гомогенатах жирового тела и кишечника проводили по К. Асперену [Asperen, 1962] с незначительными изменениями. Инкубационная смесь содержала 1мл 0.54 мМ 1-нафтилацетата в ФБ и 15 мкл опытного образца. После инкубации в темноте в течение 30 мин при 30С реакцию останавливали путем добавления 0.25 мл красяще-фиксирующего раствора (0.25% прочного синего РР и 3.125% додецилсульфата натрия в ФБ) .
Оптическую плотность измеряли при длине волны 600 нм. За условную единицу удельной активности всех изучаемых ферментов принимали разницу оптической плотности инкубационной смеси до и после начала реакции за 1 мин на 1 мг белка. Активность ГТ определяли по отношению к ДНХБ методом В. Хабига [Habig et al., 1974]. Инкубацию проводили при 25С в течение 1 мин в 0.1 М калий-фосфатном буфере (рН 6.5), содержащем 1 мМ глутатиона, 1мМ ДНХБ и 10 мкл опыт ного образца. Реакцию инициировали добавлением раствора ДНХБ в ацетоне. Концентрацию 5-(2,4-динитрофенил)-глутатиона, образующегося во время реакции, определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Цитохимическое выявление продукции активированных кислородных метаболитов (АКМ) оценивали по восстановлению НСТ и регистрации фенолоксидазной активности в гемоцитах [Глупов и др., 1997] . Для получения гемоцитов гемолимфу от 5 личинок собирали в АБ, гемолимфу центрифугировали при 4С, в течение 5 мин при 500 д. Полученные клетки дважды промывали (5 мин при 500 д) в АБ и перед использованием в ФБ.
Суспензию гемоцитов наслаивали на предметное стекло и инкубировали при 24С, в течение 15 мин во влажной камере. Затем, если в клетках выявляли фенолоксидазную активность, монослой фиксировали ацетоном 20 мин, промывали ФБ и инкубировали при 24С в течение 1 ч с 4 мг/мл ДОФА в ФБ. Если в клетках изучали восстановление НСТ, то монослой без предварительной фиксации инкубировали 1 ч при 24С в ФБ с 1.7 мг/мл НСТ, после чего гемоциты фиксировали в течение 4 мин формалин-глутаровым фиксатором (1.6 % формалина, 0.25 % глутарового альдегида в ФБ) и промывали в дистиллированной воде. Спектрофотометрическое определение фенолоксидазной активности проводили в соответствии с методом М. Бидочка с соавт. [Bidochka et al., 1989] с незначительными измене ниями. Реакционная смесь содержала 1 мг ДОФА, 1 мл ФБ и 30 мкл гемолимфы, свободной от клеток. Инкубацию проводили при 22С в течение 5 мин. Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм. Скорость образования АКМ определяли в гемолимфе, свободной от клеток, с помощью спиновой ловушки СР-Н [Dikalov et al., 1997ab; Slepneva et al., 1999], которая неспецифично окисляется различными АКМ (супероксид-радикалом, гидроксильным радикалом, пероксинитритом и другими высокореакционными метаболитами) с образованием стабильного нит-роксильного радикала, СР. Скорость образования АКМ в образцах гемолимфы определяли методом ЭПР, тестируя кинетику накопления радикала СР по увеличению амплитуды низкополь-ной компоненты спектра. Концентрацию радикала в образцах определяли, используя зависимость амплитуды спектра ЭПР от концентрации СР. Для того, чтобы определить вклад супероксидного радикала в кинетику окисления СР-Н, использовали СОД в качестве конкурентного реагента [Dikalov et al., 1997b]. Образцы готовили в ФБ-Д (ФБ, содержащий 50 мкМ дефе-роксамин мезилата, рН 7,4). Гемолимфу разводили в 40 раз в ФБ-Д, 10 мкл смешивали с 100 мкл 1 мМ СР-Н и помещали в стеклянные капилляры объемом 100 мкл, с внутренним диаметром 1 мм для ЭПР измерений. Конечные концентрации ДОФА и СОД в смесях гемолимфы со спиновой ловушкой СР-Н составляли соответственно 0.2 мг/мл и 100 U/мл.ЭПР измерения проводили при комнатной температуре, используя спектрометр ER 200D-SRC Х-диапазона при следующих
Методические подходы при изучении активированных кислородсодержащих метаболитов
Свободно-радикальные окислительные процессы являются одними из наиболее распространенных процессов, протекающих в живых организмах [Зенков и др., 2001; 2003; Auroma, 1999; Nappi, Ottaviani, 2000; Bogdan et al., 2000; Kendall et al., 2001; Kruidenier, Verspaget, 2002 и т.д.]. Короткоживущие кислородсодержащие радикалы (супероксидный, пероксинитрит, оксид азо та), время жизни которых менее секунды, играют ключевые роли в многочисленных химических и биохимических реакциях. Имеющиеся методы основаны на прямой регистрации супероксидного радикала: гистохимическим методом - по выявлению восстановленных продуктов ловушек, подобных нитросинему тетразолиевому (нитросиний тетразолиевый также используется в спектрофото-метрических методах), хемилюминесцентньми методами и методом с использованием эффекта электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), применение которого возможно лишь при температуре жидкого азота, что неприемлемо для большинства исследований. К тому же, спектрофотометрические определения невозможны в дисперсных и непрозрачных средах. Гистохимические методы также имеют ряд недостатков, связанных с низкой специфичностью и недостаточной чувствительностью используемых ловушек.
Правда, использование ряда ингибиторов дает возможность сделать вывод об участии некоторых молекулярно-биологических систем в генерации АКМ. Метод люминол-зависимой хемилюминесценции состоит в том, что продукция АКМ фагоцитами, в первую очередь супероксида-ниона, сопровождается люминесценцией клеток, которая может быть усилена люминолом. В клетках позвоночных животных и ряда беспозвоночных (моллюски) люминол-зависимая хемилюминесценция усиливается в присутствии активаторов фагоцитоза, таких как форбол-миристат-ацетат (ФМА.), липополисахарид из бактериальных стенок (ЛПС, как правило - из Escherihia coli), и т.д. (Дуглас, Куй, 1983; Маянский и др., 1987, Pipe, 1992). При использовании люминола мы не выявили достоверного увеличения хемилюминесценции гемоцитами G. mellonella в ответ на добавление стимуляторов фагоцитоза ФМА. или ЛПС в течение одного часа инкубации (рис.4). Для сравнения на рисунке 4 показана кривая регистрации люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов человека в ответ на добавление ФМА. Не зарегистрировали увеличение хемилюминесценции гемоцитами из личинок G. mellonella, ранее инъецированными бактериями Bacillus thuringiensis. Стимуляция гемоцитов личинок, инъецированных бактериями (через три часа и сутки после инъецирования), ФМА и ЛПС также не привела к увеличению хемилюминесценции. Как отмечалось выше, исследования способности фагоцитов продуцировать АКМ у беспозвоночных животных с использованием метода люминол-зависимой хемилюминесценции проводились в основном на моллюсках.
При этом продукция АКМ при фагоцитозе регистрировалась у многих видов моллюсков (Dikkeboom et al., 1987,1988; Pipe, 1992). В то же время гемоциты некоторых видов моллюсков не обладают подобным феноменом (Cheng, 1976; Kumazava et al., 1993, Lopez et al., 1994). Ранее у насекомых подобные исследования проводились на личинках совок Spodoptera exigua (Mazet et al., 1994). Авторы также не смогли зарегистрировать образование АКМ в гемоцитах Spodoptera exigua при фагоцитозе грибных клеток (Mazet et al., 1994). Не исключено, что при фагоцитозе гемоциты насекомых продуцируют АКМ, но зарегистрировать продукцию АКМ с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции невозможно. Вероятно, в гемоцитах могут существовать разнообразные факторы «гашения», которые могут предотвращать световую эмиссию люми-нола. Например, эффект «гашения» вызывают фенольные соединения (Дуглас, Куй, 1983). А поскольку гемоциты насекомых содержат многочисленные фенольные соединения (компоненты фено-локсидазного каскада), постольку использование метода люминол-зависимой хемилюминесценции для регистрации продукции АКМ фагоцитами насекомых становится проблематичным. Для определения продукции АКМ в клетках используют метод восстановления нитросинего тетразолиевого (НСТ). НСТ является акцептором электронов, донорами которых могут служить кислородные радикалы. Восстанавливаясь, НСТ переходит в нерастворимый формазан, который откладывается в местах восстановления НСТ и имеет синюю или фиолетовую окраску (Пирс, 1962; Дуглас, Куй, 1983; Досон и др., 1991).
Изменение активности детоксицирующих ферментов насекомых при патогенезе
Наряду с перечисленными выше факторами, инфекционные заболевания также влияют на изменение спектра и активности детоксицирующих ферментов насекомых. Так, при бактериальной инфекции, вызванной Escherihia coli, у личинок тутового шелкопряда Bombyx mori зарегистрировано повышение активности карбоксилэстераз, а также выявлен индуцибельный изофермент [Shiotsuki, Kato, 1999]. Установлено, что инфицирование комаров Aedes aegypti арбовирусом Чикугунья сопровождается повышением активности неспецифических эстераз и ГТ. Повышение активности этих ферментов обусловливает снижение чувствительности комаров к инсектициду малатиону [Mourya et al., 1995]. При изучении микроспоридиозов личинок некоторых чешуекрылылых и сверчка были зарегистрированы изменения в спектре и активности эстераз [Кольчевская, Кольчевский, 1988; Ефименко, 1989; Соколова, Сундуков, 1999; Yefimenko et al., 2001]. Исследования Т.М. Ефименко и соавт. [Yefimenko et al., 2001] продемонстрировали влияние микроспоридиозной инфекции на активность эстераз у гусениц озимой совки. Было обнаружено, что эстеразная активность в брюшных нервных цепочках личинок Agrotis segetum. увеличивается от моментавнедрения микроспоридии Vairimorpha antheraeae в ткани хозяина до начала спорогонии. При этом период наибольшей активности эстераз соответствует вегетативному размножению паразита, а наименьшей - массовому спорообразованию микроспоридий [Ефименко, 1989; Yefimenko et al., 2001]. Результаты исследования эстеразной активности у сверчка Gryllus bimaculatus показали, что при микроспоридиозе происходит ингибирование активности ферментов в гемолимфе, гемоцитах и жировом теле зараженных насекомых [Соколова, Сундуков, 1999].
Изучение множественных форм и активность неспецифических эстераз было проведено в гемолимфе, жировом теле и средней кишке личинок большой вощиной огневки.В результате изучения спектра множественных форм неспецифических эстераз гемолимфы личинок G. mellonella было выявлено, что эстеразы гидролизуюшие 1-нафтилацетат и 1-нафтилпропионат, обладают наибольшей электрофоретической подвижностью и представляют собой полосы черного цвета наокрашенной электрофоретической пластинке. Изоформы эстераз, характеризующиеся низкой электрофоретической подвижностью, гидролизовали 2-нафтилацетат. Установлено, что через 1 и 2 суток после заражения насекомых спорами микроспоридии V. ephestiae различия в спектре неспецифических эстераз гемолимфы контрольных и инфицированных личинок отсутствуют. Через 3 суток после заражения в спектре эстераз гемолимфы инфицированных личинок зарегистрированы индуцибельные изоформы IE и IE], (рис. 40А) . Более широкий спектр эстераз выявлен в гемолимфе через б суток после начала эксперимента, т.е. после завершения линьки насекомых на четвертый возраст. При этом в контрольной группе обнаружены изоформы LEi и LE2 и выявлено, что в гемолимфе зараженных личинок изоформа ІЕі не является индуцибельной (рис. 4ОБ). Повышенная экспрессия изоформы IE в гемолимфе зарегистрирована через 6 суток после заражения, вместе с тем, изоформы с наибольшей электрофоретической подвижностью Е4 и Е5 исчезают из спектра эстераз зараженных насекомых (рис. 4ОБ). Такие изменения в эстеразном спектре гемолимфы инфицированных микроспоридией личинок G. mellonella сохраняются весь последующий период наблюдений (до 15 суток после заражения). Оценивая удельную эстеразную активность гемолимфы, необходимо отметить достоверные различия между интактными и зараженными насекомыми на протяжении всего эксперимента (рис. 41). Так, уже через сутки после инфицирования спорами микроспоридий эстеразная активность в гемолимфе зараженных личинок
Рис. 41. Изменение эстеразной активности в гемолимфе личинок G. mellonella при микроспории-диозе: М - личинки, зараженные V. ephestiae; К - контроль. - р 0.05.повышается в 1.7 раза. Через 3 суток после заражения, когда в спектре эстераз была выявлена индуцибельная изоформа, удельная эстеразная активность в гемолимфе при микроспоридиозе возрастает в 2.1 раза, а через 9 суток - в 4.1 раза по сравнению с контролем. Через 15 суток после заражения уровень эстеразнои активности снижается, причем в гемолимфе как инфицированных, так и нативных личинок (рис. 41).
Активность антиоксидантов в тканях личинок G. mellonella при различных заболеваниях
Активность СОД определяли в гемолимфе, свободной от клеток, в гомогенатах гемоцитов, жирового тела и среднего кишечника личинок G. mellonella. Проведенные эксперименты показали, что лимфа характеризуется наименьшей активностью фермента, что составляет от 1.1 + 0.09 до 3.0 ± 0.27 единиц активности, а жировое тело - наибольшей - от 13.9 ± 1.7 до 146 ± 5.49 единиц активности, в зависимости от возраста личинок. Полученные результаты не противоречат исследованиям С. Ахмада с соавт. [Ahmad et al., 1991], которые обнаружили, что в жировом теле и кишечнике личинок совки Trichoplusia пі регистрируется более высокий уровень активности СОД по сравнению с гемолимфой. Вероятно, это связано с тем, что СОД является преимущественно внутриклеточным ферментом [Зенков и др., 2001]. Через 3 суток после заражения насекомых, во время пролиферативнои стадии развития микроспоридий, паразиты оказывают супрессивное действие на активность СОД гемолимфе, гемоцитах и жировом теле личинок G. mellonella (рис. 63 - 64) . В среднем кишечнике зараженных насекомых активность фермента, напротив, возрастает (рис. 65) . Возможно, это связано с тем, что при экструзии спор микроспоридий клетки кишечника повреждаются, при этом увеличивается продукция АКМ, в том числе супероксид-аниона, и как следствие, возрастает активность СОД. Снижение активности СОД регистрируется и у других видов беспозвоночных, зараженных паразитами. Обнаружено, что паразитирование Probopyrus ringueleti в организме креветок Palaemonetes argentinus подавляет активность СОД в гомогенатах целого тела [Neves et al., 2000]. Через б суток после заражения в гемолимфе, гемоцитах и жировом теле достоверные различия в активности СОД между зараженными и контрольными насекомыми выявлены не были. Необходимо отметить, что в этот период наблюдений мы не зарегистрировали изменений в генерации АКМ в гемолимфе и гемоцитах инфицированных личинок по сравнению с контролем (глава 2) . Однако, в среднем кишечнике через б суток после заражения было обнаружено снижение активности СОД у насекомых с признаками микроспоридиоза (рис. 65) . Трудно объяснить причину изменения ферментативной активности, но, возможно, данный факт связан с особенностями развития паразита в организме насекомых.
Через 13 суток после заражения личинок G. mellonella микроспоридиями было зарегистрировано достоверное повышение активности СОД во всех изучаемых тканях (рис. 63-65). Уровень ферментативной активности оказался наиболее высоким в жировом теле и превышал в 10.5 раза уровень активности СОД в интактных насекомых (рис. 64). Вероятно, это обусловлено особенностями взаимоотношений паразита с клеткой хозяина, поскольку именно клетки жирового тела личинок G. mellonella являются местом массового размножения микроспоридии V. ephestiae. Кроме того, период спорогонии заканчивается деструктивными изменениями клеток хозяина, что может сопровождаться повышенной продукцией АКМ и как следствие этого, возрастает активность антиоксидантных ферментов, в том числе и СОД. Рассматривая динамику активности СОД при других патогенезах можно отметить, что в культуре клеток чешуекрылых, зараженных вирусом ядерного полиэдроза наблюдается снижение активности Мп-СОД в первые 2 суток после инфицирования, в последующие 2 суток ферментативная активность возрастает, но не превышает уровень контроля [Wang et al., 2001а].
Таким образом, в гемолимфе, гемоцитах и жировом теле зараженных личинок G. mellonella в период пролиферативных стадий развития микроспоридий зарегистрировано снижение активности СОД, а в период спорогонии паразита в данных тканях и среднем кишечнике - напротив, обнаружено повышение активности фермента. Характер изменения активности антиоксидантных ферментов в различных тканях личинок G. mellonella при микроспоридиозе позволяет предположить, что в гемолимфе различные ферментативные антиоксиданты действуют синхронно: на начальных этапах микроспоридиоза активность СОД и ГТ уменьшается, а при спорогонии паразита -увеличивается. В жировом теле антиоксидантные ферменты проявляют взаимокомпенсаторный характер действия: на начальных этапах развития микроспоридий активность ГТ увеличивается, тогда, как активность СОД у зараженных насекомых снижается, во время образования спор активность ГТ, наоборот, уменьшается, а уровень активности СОД у инфицированных личинок существенно возрастает по сравнению с контролем.
Известно, что помимо ферментативных систем важную роль в антиоксидантной защите организма играют SH соединения [Зенков и др., 2001; 2003; Auroma, 1999], поэтому мы изучили изменение уровня тиолсодержащих соединений в гемолимфе личинок G. mellonella при их заражении микроспоридией V. ephestiae. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в первые б суток после инфицирования концентрация низко- и высокомолекулярных тиолсодержащих белков гемолимфы при I микроспоридиозе не изменяется по сравнению с контролем J (рис. бб, 67) . Через 13 суток после заражения зарегистрирован повышенный уровень содержания высокомолекулярных SH-соединений в гемолимфе зараженных j насекомых (рис. 68), однако различия оказались t недостоверными. Трудно объяснить стабильность концентрации тиолсодержащих соединений в гемолимфе инфицированных и нативных насекомых. Возможно, это связано с высокой скоростью восстановления окисленных форм (S-S).