Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Инфекционно-воспалительные заболевания нижнего отдела женской репродуктивной системы, принципы диагностики. Состояние микробиоценоза влагалища и локальный иммунитет (обзор литературы) 12
1.1 Воспалительные заболевания влагалища. Условно-патогенные микроорганизмы как одна из причин развития инфекционно-воспалительных заболеваний 12
1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища женщин репродуктивного возраста и беременных женщин, а также факторы, влияющие на его состояние 15
1.3 Дисбиотические состояния микробиоценоза влагалища 19
1.4 Состояние локального иммунитета влагалища 26
1.5 Лабораторная диагностика инфекционно-воспалительных процессов, протекающих на слизистой влагалища 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Общеклинические методы исследования 45
2.2 Специальные методы исследования 46
2.3 Статистические методы исследования 52
Глава 3. Результаты собственных исследований 57
3.1 Исследование микрофлоры влагалища небеременных женщин методом пцр 57
3.3 Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин 61
3.4 Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста 63
3.5 Состояние локального иммунитета влагалища беременных женщин 78
3.6 Осложнения родов и послеродового периода 93
Глава 4. Обсуждение 95
Выводы 107
Список литературы 108
- Воспалительные заболевания влагалища. Условно-патогенные микроорганизмы как одна из причин развития инфекционно-воспалительных заболеваний
- Лабораторная диагностика инфекционно-воспалительных процессов, протекающих на слизистой влагалища
- Специальные методы исследования
- Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин
Введение к работе
Актуальность. Проблема инфекционно-воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы продолжает оставаться одной из самых важных в акушерско-гинекологической практике. В настоящее время, наряду со снижением роли абсолютных патогенов в развитии инфекционно-воспалительных процессов влагалища, все большее значение в патогенезе таких заболеваний приобретают микроорганизмы, относящиеся к группе условно-патогенных: бактерии, грибы, микоплазмы, являющиеся составной частью нормальной микрофлоры [Липова E.B., 2009; Ширева Ю.В., 2010].
Заболевания урогенитального тракта, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), принято рассматривать как дисбаланс биоты – дисбиоз [Болдырева М.Н., 2009]. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища в большинстве случаев связано с развитием локального инфекционно-воспалительного процесса, характеризующегося рядом различных клинических проявлений: от бессимптомного носительства (например, кандидоносительство, мико-, уреаплазменная инфекция) до развернутой картины воспаления. Практическая диагностика таких состояний влагалища вызывает значительные трудности.
С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественной ПЦР-РВ), задачи лабораторной диагностики дисбиотических состояний решаются более успешно [Ворошилина Е.С., 2011].
Остается нерешенным вопрос определения степени реактивности и динамического изменения компонентов локального иммунитета при воспалительных состояниях, обусловленных, в том числе, и дисбиотическими нарушениями. Оценка локального иммунитета слизистой влагалища в рутинной практике в настоящее время осуществляется в большинстве случаев единственным способом - путем подсчета количества лейкоцитов в поле зрения микроскопа в нативном материале. Ввиду многообразия микроорганизмов и многогранности иммунного ответа, единичный показатель - количество клеток - не отражает в полной мере состояние мукозального иммунитета и является малоинформативным. Кроме того, результаты данного теста являются достаточно субъективными и во многом зависят от квалификации врача клинической лабораторной практики [Дмитриев Г.А., 2010; Schwiertz A. et. al., 2006]. В связи с этим установление объективных маркеров, способных более полно отразить состояние локального иммунитета является крайне актуальным.
На сегодняшний день в научной литературе существует большое количество информации относительно диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища [Campos A. et. al., 2012; Hickey D. et. al., 2011]. Однако данные научные наработки до сих пор не нашли широкого применения в практике врачей акушеров-гинекологов.
В настоящее время к генам, контролирующим иммунный ответ, наряду с генами главного комплекса гистосовместимости относят широкий спектр генов, участвующих в его регуляции.
Учитывая преимущества метода ПЦР-РВ, а именно: его быстроту (в среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов) и объективность, перспективным является изучение транскриптов (мРНК) генов иммунного ответа непосредственно в тканях, что позволит дать оценку динамическому состоянию организма, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и факторов внешней среды.
Результатом совместного использования современных молекулярно-генетических методов оценки экспрессии генов иммунного ответа и методов математической статистики, может явиться новый способ диагностики локального воспаления слизистой влагалища, который будет отражать состояние местного иммунитета.
Цель работы: изучить молекулярно-генетические особенности местного иммунитета при вагинитах у беременных и небеременных женщин и оценить возможность использования транскрипционного профиля генов иммунного ответа для совершенствования методов диагностики локального воспаления.
Задачи
-
На основании клинической картины у небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин перед родами и оценки состояния биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ сформировать исследуемые группы.
-
С помощью количественной ПЦР-РВ и метода обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) охарактеризовать и сравнить профиль представленности транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, TNFА, IFNG, TGFB1 и LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, FOXP3 и RORC), Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RА) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.
-
Сравнить профиль экспрессии исследуемых генов иммунного ответа в клетках слизистой влагалища в группах здоровых беременных и здоровых небеременных женщин.
-
На основании количественной оценки транскриптов в клетках вагинальных соскобов отобрать наиболее информативные гены для оценки состояния слизистой влагалища.
-
Выявить роль изменений локального иммунитета влагалища в развитии осложнений родового акта и послеродового периода.
-
На основании экспериментальных данных и методов математической статистики предложить диагностическую модель оценки воспалительных состояний влагалища, основанную на определении количества мРНК генов иммунного ответа.
Научная новизна. Впервые получены данные об уровне экспрессии мРНК широкого спектра генов иммунного ответа (IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, IL23, IL2RA, GNLY, TNFA, TGFB1, LIF, IFNG, TLR2, TLR4, TLR9, TBX21, GATA3, RORC, FOXP3, CD45, CD68, CD69) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.
Выявлена ассоциация экспрессии 14 генов (IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFА, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) из 24 исследуемых с проявлением местного воспаления.
В результате количественной оценки транскриптов генов провоспалительных цитокинов IL12A и IL18, а также общего макрофагального рецептора CD68 и основного транскрипционного фактора Th2-клеток GATA3 показано достоверное снижение экспрессии этих генов в клетках слизистой влагалища при наличии местного воспаления, что не согласуется с представлениями классической иммунологии.
Разработан метод диагностики локального воспалительного процесса, протекающего на слизистых влагалища, на основании определения количества транскриптов генов IL1B, IL18, IL10, TLR4, CD68 и GATA3 для беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста.
Практическая значимость. Установлены маркеры воспалительного процесса. При вагинитах в клетках слизистой влагалища беременных и небеременных женщин повышается количество транскриптов генов IL1B, IL8, IL10, TNFA, TLR2, TLR4, CD45, CD69, а количество транскриптов генов GATA3, CD68, TGFB1, IL12A, RORC, IL18 уменьшается.
Предложен новый метод диагностики локального воспаления с использованием значений количества мРНК генов IL1B, IL18, IL10, CD68, TLR4 и GATA3 с чувствительностью и специфичностью в области порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных женщин, так и для небеременных женщин.
Создана основа для разработки диагностических тест-систем с использованием предложенной модели.
Показана возможность практического использования разработанного метода для диагностики локального воспалительного процесса во влагалище в практике акушеров-гинекологов.
Определены перспективы практического использования ОТ-ПЦР для оценки состояния локального иммунитета путем измерения мРНК генов иммунного ответа: учитывая схожее строение слизистых оболочек организма, полученные результаты могут быть перенесены на другие участки слизистых, что позволит расширить границы применения полученных результатов.
Показано, что наличие местной воспалительной реакции, определяемое по профилю экспрессии генов иммунного ответа, является важным диагностическим критерием, позволяющим объективно разграничить бессимптомное носительство условно-патогенной микрофлоры от проявлений вагинита.
Внедрение в клиническую практику современных методов исследования локального иммунитета влагалища у беременных женщин перед родами позволит объективно оценить наличие или отсутствие воспалительной реакции, а также своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых воспалительных осложнений.
По результатам диссертационной работы подана заявка на изобретение № 201147924 «Способ диагностики вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках».
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций. Материалы исследований были представлены на Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011г.), VI Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.), V Российской конференции "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012г.).
Диссертация частично выполнена в рамках работ по государственному контракту №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011г.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 74 русскоязычных источника и 123 источника на иностранном языке. Работа содержит 11 таблиц и 24 рисунка.
Воспалительные заболевания влагалища. Условно-патогенные микроорганизмы как одна из причин развития инфекционно-воспалительных заболеваний
Проблема женского репродуктивного здоровья является одной из самых актуальных проблем современного общества. Для врачей акушеров-гинекологов наибольший интерес представляет проблема воспалительных заболеваний нижних отделов женской репродуктивной системы [34; 52]. Актуальность этой проблемы очевидна: данная патология может привести к нарушению функций как репродуктивной, так и других систем организма женщин. Эти изменения могут являться причиной утраты трудоспособности, хронизации патологического процесса, нарушения детородной функции, что обусловливает социальный и экономический аспект данной проблемы [41; 62].
В настоящее время наряду со снижением регистрации случаев инфекций, передающихся половым путем, в структуре урогенитальных заболеваний прослеживается устойчивая тенденция к увеличению доли инфекционно-воспалительных процессов: в РФ воспалительные заболевания занимают от 28 до 60% в структуре гинекологической заболеваемости и не имеют тенденции к снижению [35]. Все большее значение в развитии таких заболеваний приобретает условно-патогенная биота [33; 48; 49; 73; 75; 88; 167].
Среди нарушений микроэкологии влагалища и вульвы наиболее значимыми являются бактериальный вагиноз (БВ), вульвовагинальный кандидоз (ВВК) и анаэробный вагинит (АВ) [4; 22; 52], этиологическим агентом которых являются как раз УПМ.
Под вагинитами подразумевают комплексный синдром, включающий все инфекционные и неинфекционные воспалительные процессы, развивающиеся в генитальном тракте [4].
Дифференциальная диагностика воспалительных состояний влагалища порой вызывает значительные трудности в практике врачей акушеров-гинекологов. И если в отношении специфических вагинитов, в роли этиологических агентов которых выступают абсолютные патогены, данная проблема решает достаточно успешно, то в отношении неспецифических вагинитов до сих пор нет единого мнения, как среди отечественных, так и среди западных специалистов в отношении того, какие именно УПМ способны вызывать воспалительные состояния влагалища.
Согласно IUSTI (International Union against Sexually Transmitted Infections) на 2011 год [170] основными причинами вагинитов являются следующие инфекционные формы: бактериальный вагиноз (22-50% симптоматичных женщин), вульвовагинальнй кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%), а так же аэробный вагинит, который ранее в рекомендациях отдельно не выделяли. Процент выявления данных нозологии разнится в зависимости от исследуемой популяции. По данным Anderson M.R. в 30% случаев причина воспаления остается невыясненной [80].
В противоположность IUSTI, большинство отечественных специалистов считает, что бактериальный вагиноз является общим инфекционным невоспалительным синдромом, связанным с количественными и качественными изменениями в структуре биоценоза влагалища, при которых наблюдается снижение или отсутствием лактофлоры и ее замена на полимикробные ассоциации анаэробов [3; 13; 30; 34; 37; 45; 46; 58; 66]. Диагностика воспалительных состояний, ассоциированных с УПМ, вызывает определенные трудности. С одной стороны, это обусловлено широким разнообразием представителей микробиоценоза влагалища (бактерии, грибы, вирусы) [8; 10; 11]. С другой стороны, симбиоз между микро- и макроорганизмом обеспечивается за счет скоординированной работы гормональной, нервной и иммунной систем. Нарушение функций одной из систем, как правило, приводит к дисбалансу всего комплекса, что проявляется замещением нормальных микроорганизмов условно-патогенными и/или патогенными. В случае нарушения биотопа влагалища возникают дисбиотические состояния, сопровождающиеся клиническими проявлениями, степень выраженности которых может варьировать от бессимптомного носительства до выраженной клинической манифестации.
В настоящее время лабораторные исследования приобретают первостепенное значение при диагностике заболеваний урогенитального тракта. Современные микробиологические и молекулярно-генетические методы диагностики на основе количественной ПЦР позволяют решить проблему оценки качественного и количественного состава микробиценоза. В тоже время, для дифференциального диагноза между бессимптомным носительством УПМ и вагинитами, ассоциированным с этими же микроорганизмами, необходимо понимать состояние локального иммунитета. На сегодняшний день, помимо визуальных клинических признаков воспаления, состояние местного иммунитета оценивают по количеству лейкоцитов в нативном материале (микроскопия вагинальных мазков). Следует отметить, что данный способ оценки достаточно субъективный. Результаты зависят от многих факторов: точности забора материала (непосредственно со стенок слизистой влагалища, а не из области шейки матки и слизистой пробки), правильности подготовки мазка (нанесения отделяемого на предметное стекло), квалификации врача клинической лабораторной диагностики и др. Данный метод является мало информативным и не отражает в полной мере функциональное состояние иммунокомпетентных клеток. Клинические признаки вагинитов, такие как гиперемия, отек слизистой являются также достаточно субъективными и их не всегда можно однозначно интерпретировать, что делает актуальным поиск информативных маркеров, способных охарактеризовать состояние местного иммунитета в норме и при развитии патологических процессов, протекающих на слизистых оболочках влагалища.
Лабораторная диагностика инфекционно-воспалительных процессов, протекающих на слизистой влагалища
Лабораторная диагностика инфекционно-воспалительных процессов состоит из двух этапов: оценки состояния биоценоза влагалища и определения функциональной активности иммунокомпетентных клеток слизистой влагалища, т.е. оценки состояния местного иммунитета.
Традиционно лабораторное исследование биоценоза включает микроскопию нативных и окрашенных метиленовым синим и по Граму препаратов и культуральное исследование.
Микроскопия мазка позволяет увидеть клетки эпителия генитального тракта, лейкоциты, определить морфологию микроорганизмов, населяющих слизистые половых органов, и оценить их приблизительное количество в мазке, помещенном на предметном стекле. Результаты данного теста являются в значительной степени субъективными и во многом зависят от квалификации врача клинической лабораторной диагностики [14; 169].
Классическая микробиология до настоящего времени является «золотым стандартом» лабораторной диагностики любого патологического процесса, поскольку позволяет выполнить количественную характеристику, идентифицировать микроорганизм до вида и определить чувствительность выделенного штамма к лекарственным препаратам. Однако этот метод не лишен ряда недостатков: сложные условия культивирования, большое количество питательных селективных сред, специализированные лаборатории, оснащенные необходимым лабораторным оборудованием для выращивания анаэробов, длительные сроки культивирования (в среднем 7 дней) и т.п [8; 10]. На основании данных микроскопии мазка и классической микробиологии рядом отечественных авторов (Анкирская А.С., Кира Е.Ф.) были предложены различные классификации биоценозов влагалища.
Анкирская А.С. с соавторами [2; 4] предложила микробиологические критерии оценки состояния микробиоценоза влагалища по отдельным нозологическим нормам у женщин репродуктивного возраста: нормоценоз, БВ, кандида-инфекция (ВВК, кандидоносительство, сочетание БВ и ВВК), неспецифический или анаэробный вагинит (АВ), а также промежуточный вариант биоценоза (мезоценоз) (смотреть ниже).
Е.Ф. Кира [21] разработал классификацию биоценоза влагалища, в которой представлена микроскопическая характеристика 4 типов биоценоза влагалища соответствующая основным нозологическим формам:
1. Нормоценоз, характеризующийся доминированием лактобактерий, отсутствием грамотрицательной микрофлоры, спор и мицелия дрожжеподобных грибов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых» эпителиальных клеток. Подобная картина отражает типичное состояние нормального биотопа влагалища.
2. Промежуточный тип - умеренное или сниженное количество лактобактерий, наличие грамположительных кокков, грамотрицательных палочек. Обнаруживаются лейкоциты (до 10), моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Является пограничным типом, часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается жалобами и клиническими проявлениями.
3. Дисбиоз влагалища, выражающийся в незначительном количестве или полном отсутствии лактобактерий, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой микрофлорой, наличием «ключевых клеток». Количество лейкоцитов вариабельно, отмечается отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Соответствует микробиологической картине БВ. 4. Вагинит (воспалительный тип мазка) - полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов (более 10), макрофагов, эпителиальных клеток, отмечается выраженный фагоцитоз.
В мировой же практике диагноз БВ верифицируется на основании критериев Амсела [88; 151; 171], куда не входит такой пункт как количество лейкоцитов. В нашей же стране диагноз БВ помимо наличия соответствующего симптомокомплекса и определенной микробиологической картины ставится при условии отсутствия и наличии незначительного количества лейкоцитов при микроскопии мазка. В настоящее время наряду с исследованием 16S РНК большинства известных бактерий и развитием молекулярно-генетических методов, а именно количественно ПЦР в режиме реального времени, методик сервенирования и клонирования появилась возможность идентифицировать большое число микроорганизмов, а также оценивать их количественное соотношение в структуре микробиоценоза [8; 11; 72; 76; 97; 162; 185]. Таким образом, оценка состояния биоценоза влагалища на сегодняшний успешно решается с использованием современных молекулярно-генетических методов. Помимо понимания состояния биоценоза влагалища одним из ключевым моментов диагностики воспалительных состояний влагалища является понимание состояния локального иммунитета. Особенного это актуально для диагностики таких состояний как бессимптомное носительство УПМ. Оценка локального иммунитета слизистых влагалища в рутинной практике в настоящее время осуществляется путем подсчета количества лейкоцитов в поле зрения микроскопа в нативном материале, но этот метод является малоинформативным. На сегодняшний день, по данным отечественных и зарубежный авторов, охарактеризовать состояние локально иммунитета слизистых оболочек можно, оценив уровень про- и противовоспалительных цитокинов в цервикальной слизи с помощью ИФА [25; 112; 120; 188]. Однако данный метод является крайне трудоемким и имеет ряд ограничений при работе с образцами, содержащими слизь, что препятствует его внедрению в клиническую лабораторную практику. С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной ОТ-ПЦР, появилась возможность оценки профиля активности различных генов в широком спектре биологического материала на базе стандартной ПЦР лаборатории.
Для оценки состояния мукозального иммунитета перспективным является изучение локальной экспрессии генов иммунного ответа, что позволит судить об активации определенных клеточных популяций и направлении иммунного ответа. Полученные данные позволят расширить существующие представления об иммунных процессах, которые имеют не только теоретическое, но и отчетливое прикладное значение.
Специальные методы исследования
Микроскопический метод. Метод использовали для оценки состояния вагинального микроценоза. Вагинальные мазки после фиксации в этаноле окрашивали по Граму и микроскопировали с иммерсией. Учитывали следующие показатели: характер вагинального эпителия -принадлежность к поверхностному, промежуточному или парабазальному слоям, их количество в поле зрения, наличие «ключевых клеток» (клеток поверхностных слоев с адгезированными на них в массивном количестве бактерий, по морфологии сходных с гарднереллами, бактероидами или вибрионоподобными формами), наличие лейкоцитарной реакции (количество лейкоцитов в поле зрения), общую микробную обсемененность (скудное, умеренное, большое, массивное), морфологический состав микрофлоры и количественное соотношение микробных морфотипов, в том числе наличие дрожжеподобных грибов, бластоспор или мицелия.
На основании выше изложенного предлагаются следующие микробиологические критерии оценки состояния микроценоза влагалища по отдельным нозологическим нормам у женщин репродуктивного возраста [2; 4].
Нормоценоз
- вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоев, реже встречаются клетки промежуточного слоя; - лейкоцитарная реакция отсутствует или слабо выражена - единичные лейкоциты в поле зрения; - общее количество микроорганизмов умеренное или большое; - доминирующий морфотип - лактобациллы, другие морфотипы либо отсутствуют, либо их количество исчисляется единичными микробными клетками в редких полях зрения. Бактериальный вагиноз - вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоев, редко встречаются промежуточные клетки, часто «ключевые клетки»; - лейкоцитарная реакция, как правило, отсутствует (если она выражена, врачу следует думать о смешанной инфекции); - общее количество микроорганизмов - массивное, реже большое; - преобладают морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы; морфотипы лактобацилл отсутствуют или определяются как единичные не во всех полях зрения. Кандида-инфекция
В зависимости от концентрации грибов в отделяемом влагалища и сопутствующей микрофлоры выделяют 3 формы Candida инфекции влагалища.
1. Кандидозный вагинит (Candida в виде моноинфекции)
- вагинальный эпителий преимущественно поверхностных слоев, но может быть много промежуточных и даже парабазальных клеток;
- лейкоцитарная реакция от умеренной (10-15 лейкоцитов в поле зрения) до резко выраженной (30-50 и более лейкоцитов в поле зрения);
- общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
- доминируют морфотипы лактобацилл, присутствуют дрожжевые клетки, фрагменты псевдомицелия с бластоспорами.
2.Сочетание бактериального вагиноза и кандидозного вагинита
- вагинальный эпителий преимущественно поверхностных слоев, присутствуют «ключевые клетки»;
- умеренная или выраженная лейкоцитарная реакция;
- общее количество микроорганизмов - массивное, реже большое;
- доминируют морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы, присутствуют дрожжевые клетки и /или фрагменты псевдомицелия гриба;
- лактобациллы отсутствуют или выявляются единичные морфотипы в поле зрения.
3. Бессимптомное носительство грибов
- вагинальный эпителий представлен преимущественно клетками поверхностных слоев; - лейкоцитарная реакция не выражена, единичные лейкоциты в поле зрения;
- общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
- доминируют морфотипы лактобацилл, в редких полях зрения встречаются единичные дрожжевые клетки.
Аэробный вагинит
- вагинальный эпителий представлен поверхностными и промежуточными клетками, при выраженном воспалительном процессе встречаются парабазальные клетки;
- выражена лейкоцитарная реакция (более 10 лейкоцитов в поле зрения);
- общее количество микроорганизмов умеренное;
- лактобациллы отсутствуют или их количество резко снижено;
- преобладают морфотипы УМП - колиморфные палочки или грамм (+) кокки.
Промежуточный вариант микроценоза (мезоценоз)
- вагинальный эпителий представлен поверхностными клетками, могут встречаться единичные «ключевые клетки» или отмечается склонность к их формированию;
- количество лейкоцитов не более 10 в поле зрения;
- общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
- доминируют морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы в сочетании с умеренно сниженным тиром лактобацилл.
Исследование микрофлоры влагалища методом количественной ПЦР «Фемофлор». Взятие биологического материала (отделяемое задней стенки влагалища) осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. Осаждение клеток и бактериальных агентов проводили путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 минут. Полученные клетки ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора.
Для выделения ДНК использовали наборы «Проба ГС» («ДНК-Технология», Россия). Метод основан на лизисе в растворе гуанидинтиоционата, сорбции ДНК на сорбенте, последующих отмывках сорбента в промывочных растворах и элюции ДНК с сорбента в ТЕ-буфер. Объем образцов после выделения составил 100 мкл. При количественной оценке биоценоза влагалища («Фемофлор», ДНК-Технология, Россия) учитывалось общее количество микроорганизмов (общая бактериальная масса (ОБМ)), количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп УПМ, включая факультативно-анаэробные микроорганизмы {Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp)., облигатно-анаэробные (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp. /Fusо bacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. и Candida spp. Также было проведено обследование женщин методом ПЦР на наличие абсолютных патогенов: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и герпесвирусов (HSV-1, HSV -2, CMV) (ДНК-Технология, Россия).
Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин
По количеству копий мРНК в биологическом материале все гены можно условно разделить на 3 группы: гены с высоким уровнем экспрессии концентрацией транскрипта от 10 до 10 копии мРНК на образец (1L8, IL1B, IL18, TGFB1, CD68, GATA3); гены со среднем уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 10 до 10 копии мРНК на образец (IJNrA, CD45, IL12A, IL23, TLR2, TLR4, CD69, RORC, IL10) и гены с низким уровнем экспрессии - менее 10 копии мРНК на образец (1Ы5, гОХРЗ, Ыг, TLR9, GNLY, ТВХ21, IFNG, IL6, IL2RA). Следует отметить, что экспрессия последней группы генов довольно часто не детектировалась в клетках соскобов слизистой влагалища, а в ряде случаев лежала за областью линейного диапазона. По общим для всех тест-систем данным область линейного диапазона составила от 180-600 до 10 копии мРНК на образец.
Сравнительный анализ профиля экспрессии мРНК генов показал, что воспалительные состояния влагалища сопровождаются изменением количества транскриптов исследуемых генов. Нормированные значения медиан и квартилей генов с высоким и средним уровнем экспрессии приведены в таблице 3. За 1 принято значение медианы в группе здоровых небеременных женщин. Достоверность различий между группами определяли с помощью теста Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р 0,05.
Зкспрессия генов с количеством транскрипта менее 10 копии мРНК на образец (IL15, FOXP3, LIF, TLR9, GNLY, ТВХ21, IFNG, IL6, IL2RA) детектировалась не во всех образцах. Для установления различий между группами использовали %2 (для качественных признаков). В таблицах 4 и 5 представлены данные по количеству образцов (в процентах) с детектируемым уровнем экспрессии перечисленных выше генов в группах сравнения небеременных женщин и значения %2 для анализируемых групп небеременных женщин в сравнении со здоровыми небеременными женщинами. Различие групп полагали статистически значимым при р 0,05.
Анализ данных нормированных значений экспрессии генов иммунного ответа показала, что в группе небеременных женщин с вагинитами достоверно повышен уровень экспрессии MPFIK генов IL1B в 4,0, IL8 в 5,7, TLR2 в 4,4, TLR4 в 4,8 раза по сравнению с группой здоровых небеременных женщин. Увеличение количества транскриптов данных генов обусловлено активацией иммунокомпетентных клеток (эпителиальных клеток, дендритных клеток, макрофагов, нейтрофилов и др.). По экспрессии гена TNFA и IL23 не было получено значимых различий между группой небеременных женщин с вагинитами и группой здоровых небеременных женщин (рисунок 9).
Об активации Т-клеточного звена иммунной системы можно судить, исходя из достоверного повышения количества транскриптов генов общего лейкоцитарного антигена CD45 в 3,5 раза и раннего активационного антигена Т-клеток CD69 в 3,3 раза в группе небеременных женщин с вагинитами по сравнению с группой здоровых небеременных женщин (рисунок 10).
В отношении экспрессии гена регуляторного цитокина IL10 детектировали достоверное повышение уровня экспрессии в 3,6 раза группе женщин с воспалительным состоянием влагалища по сравнению группой здоровых женщин (рисунок 10).
При анализе экспрессии мРНК в клетках соскобов слизистой влагалища было отмечено, что в группе небеременных женщин с воспалительными состояниями детектировалось достоверное снижение количества транскриптов следующих генов: IL12A в 4, IL18 в 8, CD68 в 3, GATA3 в 8, RORC2 в 2, TGFB1 в 2 раза по сравнению с группой здоровых небеременных женщин (рисунок 11).
При анализе экспрессии генов с концентрацией транскрипта менее 10 копии мгНК на образец, в группе небеременных женщин с вагинитами в клетках соскобов слизистой влагалища достоверно чаще детектировали экспрессию генов IL6, GNLY, ТВХ21, IL2RA, IFNG.
Таким образом, при вагинитах происходит активация как врожденного, так и адаптивного звена иммунной системы по ТЫ-типу.
Группу небеременных женщин с кандидоносительством составили 14 женщин с количеством Candida spp. более 10 гэ/мл в вагинальных мазках, сохраненной нормофлорой и незначительной выраженностью воспаления со стороны слизистой влагалища (число лейкоцитов менее 10). Данная группа мало отличалась от группы здоровых небеременных женщин по уровню экспрессии исследуемых генов, за исключением гена TGFB1, экспрессия которого была в 2 раза выше, чем в группе здоровых небеременных женщин.
Группу небеременных женщин с уреаплазмой составили 10 женщин с количеством ureaptasma spp более 10 гэ/мл в вагинальных мазках, сохраненной нормофлорой и незначительной выраженностью воспаления со стороны слизистой влагалища (число лейкоцитов менее 10). Данная группа женщин, по профилю экспрессии анализируемых генов, была сходна с группой небеременных женщин с вагинитами и характеризовалась достоверным повышением экспрессии генов TLR2 в 5,1, TLR4 в 2,5, IL1B в 2,4, IL8 в 4,9, CD45 в 2,8, CD69 в 3,1 раза, и снижением - CD68 в 2,0, IL18 в 3,3 и GATA3 в 2,2 раза по сравнению с группой здоровых небеременных женщин. Также в данной группе достоверно чаще детектировалась экспрессия гена IL6. Достоверных различий в отношении экспрессии остальных генов получено не было.
Группу небеременных женщин с облигатно-анаэробным дисбиозом составили 15 женщин с данным видом дисбиоза и незначительной выраженностью воспаления со стороны слизистой влагалища (число лейкоцитов менее 10). Анализ профиля экспрессии изучаемых генов показал достоверное снижение количества транскриптов генов CD68 в 2,5, IL18 в 4,8, GATA3 в 4,0 и IL12A в 2,5 раза в сравнении с группой здоровых небеременных женщин. Достоверного повышения экспрессии генов отмечено не было. Также в данной группе достоверно чаще детектировалась экспрессия гена IL6.