Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Биохимические защитные реакции в иммунитете насекомых. Обзор литературы 8
1.1. Гуморальный иммунитет насекомых 8
1.1.1. Гемолимфатические агглютинины насекомых и их участие в защитных реакциях 8
1.1.2. Фенолоксидазная система и ее место в иммунитете насекомых 12
1.1.3. Участие антиокислительных систем в защитных реакциях насекомых 17
1.2. Клеточные иммунные реакции: фагоцитоз, грануло- и капсулообразование 20
1.3. Онтогенетические особенности защитных систем насекомых 30
Глава 2. Объекты и методы исследований 37
2.1. Условия содержания объектов исследований 37
2.1.1. Колорадский жук (Coleoptera, Chrysomelidae: Leptinotarsa decemlineata Say) 37
2.1.2. Комнатная муха (Diptera, Muscidae: Musca domestica L.) 37
2.2. Постановка лабораторных экспериментов 38
2.2.1. Способы бактериального воздействия на/,, decemlineata Say. 38
2.2.2. Условия температурного стрессового воздействия на М. domestica L. 38
2.2.3. Постановка лабораторных экспериментов для установления онтогенетических особенностей биохимических и клеточных защитных реакций L. decemlineata Say. 39
2.2.4. Постановка лабораторных экспериментов для определения длительности защитных реакций на действие экзогенных факторов в онтогенезе M.domestica L. 40
2.2.4.1. Определение наиболее эффективного углевода 40
2.2.4.2. Эксперимент по определению длительности защитных реакций на действие И-ацетил-О-глюкозамина и высокой температуры в онтогенезе М.domestica L. 41
2.3. Методика биохимических экспериментов 42
2.3.1. Методика измерения активности каталазы 42
2.3.2. Методика измерения активности пероксидазы 42
2.3.3. Методика измерения фенолоксидазной активности 42
2.3.4. Методика электрофоретического изучения активности фенолоксидазы 43
2.3.5. Методика определения агглютинирующей активности гемолимфы 43
2.3.6. Методика определения углеводной специфичности гемагглютиниов 44
2.4. Методика приготовления препаратов гемолимфы 45
2.5. Математическая обработка результатов 46
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47
Глава 3. Онтогенетические особенности защитных биохимических реакций Leptinotarsa decemlineata Say. 47
3.1. Онтогенетические особенности агглютинирующей активности гемолимфы Leptinotarsa decemlineata Say. на начальном этапе развития инфекции 48
3.2. Динамика ДОФАоксидазной и тирозиназной активности гемолимфы при воздействии БТБ на разных стадиях онтогенеза Leptinotarsa decemlineata Say. 55
3.3. Динамика каталазной и пероксидазной активности гемолимфы при воздействии БТБ на разных стадиях онтогенеза Leptinotarsa decemlineata Say. 70
Глава 4. Клеточные иммунные реакции в ответ на бактериальное заражение в онтогенезе Leptinotarsa decemlineata Say. 84
4.1. Изменение соотношения различных типов гемоцитов Leptinotarsa decemlineata Say. в онтогенезе 84
4.2. Гемоцитарные реакции в онтогенезе Leptinotarsa decemlineata Say. при однократном действии БТБ 90
4.2.1. Гемограммы личинок Leptinotarsa decemlineata Say. при однократном действии БТБ 91
4.2.2. Гемограммы куколок Leptinotarsa decemlineata Say. при однократном действии БТБ 95
4.2.3. Гемограммы имаго Leptinotarsa decemlineata Say. при однократном действии БТБ 97
4.3. Гемоцитарные реакции в онтогенезе Leptinotarsa decemlineata Say. при двукратном действии БТБ 107
4.3.1. Гемограммы личинок Leptinotarsa decemlineata Say. при двукратном действии БТБ 108
4.3.2. Гемограммы куколок Leptinotarsa decemlineata Say. при двукратном действии БТБ 112
4.3.3. Гемограммы имаго Leptinotarsa decemlineata Say. при двукратном действии БТБ 116
Глава 5. Длительность защитных биохимических реакций Musca domestica L. при действии экзогенных факторов 123
5.1. Физиологические показатели в онтогенезе М. domestica L. при действии Сахаров 123
5.2. Влияние NAGA и высокой температуры на жизнеспособность и защитные ферментативные системы в онтогенезе Musca domestica L. 127
5.2.1. Показатели жизнеспособности Musca domestica L. при действии NAGA и высокой температуры 127
5.2.2. Активность каталазы, пероксидазы и ДОФАоксидазы в онтогенезе Musca domestica L. при действии NAGA и высокой температуры 128
5.2.3. Электрофоретические спектры фенолоксидазы Musca domestica L. при действии NAGA и высокой температуры 134
Заключение 145
Выводы 149
Список литературы 151
Введение к работе
Изучение механизмов устойчивости живых организмов является важным звеном в решении целого ряда фундаментальных и практических проблем современной биологии. Знание механизмов защитных реакций насекомых позволит понять закономерности эволюции иммунитета, а также целенаправленно подойти к проблеме управления популяциями насекомых.
Биохимические защитные механизмы и тесно связанные с их функционированием клеточные компоненты гемолимфы активно участвуют в процессах линьки и метаморфоза (Ball et al., 1987; Nardi and Miklasz, 1989, Hori et al., 1997; Nardi et al., 2001). Детали участия биохимических механизмов и клеток гемолимфы в гистолитических и формообразующих процессах насекомых пока не ясны. Однако очевидно, что общий принцип функционирования данных систем в морфогенетических явлениях аналогичен определенным защитным реакциям насекомых (Kilincer and Giirkan, 1987, Ramalingam et al.,1993). Таким образом, общее физиологическое состояние, образ жизни, гормональный статус, характерные для каждой стадии развития насекомых, предполагают существование онтогенетических различий в биохимических механизмах иммунного ответа насекомых.
Экспериментальное подтверждение индуцирования достаточно специфических и долговременных защитных реакций насекомых возможно лишь при условии использования естественных способов заражения, а также патогенов в дозировках и степени вирулентности, не вызывающих глубоких патологических изменений в организме насекомого (De Gregorio et al., 2001; Ekengren, Hultmark, 2001; Tzou et al., 2001). Проведенные ранее многочисленные исследования защитных механизмов насекомых, как правило, методически не соответствовали этим условиям, в силу чего сформировали представление о неспособности насекомыми приобретать иммунитет (Флоренсов, Пестова, 1990) и об исключительной роли отбора особей с наиболее успешной реализацией защитных систем в возникновении устойчивых популяций насекомых. Вместе с тем, на сегодняшний день имеются единичные свидетельства развития долговременных биохимических и клеточных реакций иммунной защиты отдельных видов насекомых (Booman et al., 1978; Купер, 1980; Dunn, 1990; Каф, 1990), не носящие системного характера.
Изучение данных вопросов может изменить общее представление о способах формирования устойчивости насекомых к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающих удивительную пластичность видов класса Insecta.
Цель работы заключалась в изучении онтогенетической реализации биохимических защитных реакций в иммунитете насекомых. Были поставлены следующие задачи:
1. Изучить онтогенетические особенности биохимических защитных реакций Leptinotarsa decemlineata Say. при развитии инфекционного процесса.
2. Изучить онтогенетические особенности гемоцитарных реакций Leptinotarsa decemlineata Say. при развитии инфекционного процесса.
3. Определить длительность биохимических защитных реакций Musca domestica L., вызванных действием экзогенных факторов.
Научная новизна. Впервые, на примере колорадского жука, показано, что онтогенетические особенности биохимических механизмов начального этапа иммунного ответа проявляются в преобладании на личиночной стадии неспецифических, а на имагинальной - специфических биохимических защитных реакций. Установлено, что онтогенетические особенности гемоцитарной реакции на начальном этапе развития инфекционного процесса заключаются в увеличении доли метаболических гемоцитов на стадии личинки и иммунокомпетентных клеток на стадии имаго. Впервые исследование иммунной реакции насекомых проводилось с использованием нелетальных доз патогена, что позволило явно показать эффект иммунизации у насекомых. Обнаруженный эффект иммунизации нелетальными дозахми битоксибациллина (БТБ), выражающийся в повышении активности биохимических систем защиты и увеличении доли иммунокомпетентных и метаболических гемоцитов при повторном заражении, сохраняется при смене возрастов личинок и онтогенетических стадий L.decemlineata Say. Показана возможность формирования долговременной, охватывающей весь онтогенез насекомого, реакции биохимических систем, участвующих в иммунном ответе M.domestica L., на примере действия N-anemn-D-глюкозамина (NAGA) и высокой температуры.
Практическая значимость. Полученные данные по онтогенетическим особенностям иммунного ответа и иммунизирующему действию нелетальных доз патогена рекомендованы для использования при установлении регламентов применения инсектицидов и других биологически активных для насекомых веществ. Данные об адаптивном действии NAGA будут использованы при разработке нового адаптогена для полезных насекомых.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001), «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), «Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2002), «Разнообразие беспозвоночных животных на севере» (Сыктывкар, 2003), на XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Всероссийского Общества Генетики и Селекции (Москва, 2004).
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, лаборатории биохимии адаптивности насекомых по теме «Генетико-биохимические механизмы адаптивности насекомых» (РАН, № гос. регистрации 01.200.2 05310).
