Содержание к диссертации
Введение
1. Структура рибосом 13
1.1. Структура рибосомных белков и РНК 13
1.2. Четвертичная структура рибосом 18
1.3. Функциональные центры рибосом 24
1.4. Резюме 2.5
2. Структурная лабильность рибосом 26
2.1. Ассоциация - диссоциация рибосом 26
2.2. Структурная лабильность рибосомных субчастиц 32
2.3. Резюме 35
3. Функционирование рибосом 36
3.1. Основные компоненты системы трансляции 39
3.2. Связывание аминоацил-тРНК 43
3.3. Образование пептидной связи (транспептидация) 46
3.4. Транслокация 48
3.5. Резюме 51
4. динамика транслирующих рибосом .53
4.1. Динамические модели транслирующих рибосом и их экспериментальная проверка 53
4.2. Роль факторов элонгации и (И?Р в процессе трансляции 58
4.3. Резюме 63
5. Постановка задачи и выбор методов исследования 64
5.1. Постановка задачи 64
5.2. Выбор методов исследования 65
5.2.1. Твердофазная система трансляции 65
5.2.2. Электронная микроскопия 65
5.2.3. Сравнительный седиментационный анализ 66
5.2.4. Методы диффузного рентгеновского и нейтронного рассеяния 67
5.3. Резюме 74
2 Эксжрименталніая часть 75
2 Материалы и методы 76
1. Выращивание бактериальной массы 76
2. Выделение и хранение рибосом 76
3. Выделение тотальной ферментной фракции 77
4. Выделение препарата суммарной тРНК 78
5. Аминоацилирование суммарной тРНК фенилаланином 79
6. Получение фрагментированной поли(У) длиной ІІ0-І40 нуклеотидов с окисленным периодатом 3-концом 80
7. Получение поли(У), ковалентно связанной с твердым носителем (сефарозой) за 3-конец через расщепляемый s-S-мостик.(Сефароза-Б-Б-поли(У)) 81
8. Подбор оптимальных соотношений компонентов трансляции на свободной поли(У) 82
9. Получение пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний транслирутацих рибосом с помощью колонок, содержащих иммобилизованную полиуридиловую кислоту 85
10. Тестирование функциональных состояний претранслокационных и пост-транслокационных рибосом 88
11. Электронная микроскопия транслирующих рибосом 89
12. Сравнительный седиментационный анализ 90
13. Малоугловое диффузное рассеяние нейтронов (метод вариации контраста в нейтронном рассеянии) 91
14. Малоугловое диффузное рентгеновское рассеяние 95
15. Материалы 96
3 Результаты 97
1. Получение пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний транслирующих рибосом с помощью колонок, содержащих иммобилизованную полиуридиловую кислоту 98
2. Сравнение пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний рибосом методом электронной микроскопии 106
3. Сравнительный седиментационный анализ пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний рибосом 110
4. Сравнение компактности пре-транслокационных и посттранслокационных состояний рибосом методом диффузного рентгеновского рассеяния и вариации контраста в нейтронном рассеянии 119
4 Обсуждение результатов 129
1. Сравнительный седиментационный анализ пре-транслока-ционного и пост-транслокационного состояний рибосом 130
2. Сравнение компактности пре-транслокационного и пост-транслокационного состояний рибосом методами рассеяния нейтронов, рентгеновских лучей и электронной микроскопии 134
3. Перспективы дальнейших исследований, вытекающих из полученных результатов 139
Выводы 142
- Четвертичная структура рибосом
- Функционирование рибосом
- Аминоацилирование суммарной тРНК фенилаланином
- Сравнительный седиментационный анализ пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний рибосом
Введение к работе
Трансляция информации, закодированной последовательностью нуклеотидов матричной РНК, в последовательность аминокислот полипептидной цепи осуществляется в клетке рибонуклеопротеидными частицами - рибосомами. Совокупность процессов, осуществляемых рибосомой в ходе трансляции, может быть разбита на три последовательных этапа : I) начальная ассоциация рибосомы с матричным по-линуклеотидом и аминоацил-тРНК - инициация трансляции; 2) собственно полимеризация аминокислотных остатков, или элонгация ; 3) освобождение полипептидной цепи белка из рибосомы - терминация трансляции.
Согласно современным представлениям рибосома не размещает на себе весь матричный полинуклеотид, а последовательно перемещает его в направлении от 5^-конца к 3-концу. Одновременно с перемещением полинуклеотида на рибосоме синтезируется полипептидная цепь белка последовательно от N-конца к с-концу. Удлинение поли-лептидной цепи на один аминокислотный остаток происходит как результат цикла, состоящего из трех последовательных стадий: I) связывания аминоацил-тРНК с рибосомой; 2) транспептидации; 3) транслокации. Стадия транслокации включает в себя значительные внутри-рибосомные перемещения матрицы и продуктов реакции транспептидации: освобождение деапилированной тРНК, переход пептидил-тРНК из одного участка в другой и сдвиг матричного полинуклеотида на один кодон. Перед транслокацией рибосома находится в таком состоянии, когда два ее участка связывания тРНК заняты продуктами реакции транспептидации: в А-участке находится пептидил-тРНК, а в Р-учас-тке - деацилированная тРНК (пре-транслокационное состояние). В результате процесса транслокации рибосома оказывается в таком состоянии, когда ее Р-участок занят субстратом для реакции транспептидации - пептидил-тРНК, а А-участок свободен и готов к принятию следующей аминоацил-тРНК (пост-транслокационное состояние).
Возникает вопрос, какова роль самой рибосомы в процессе трансляции? Не сопровождается ли та или иная стадия элонгационно-го цикла, и особенно стадия транслокации, структурными изменениями самой рибосомной частицы, или же рибосома является лишь жесткой ориентирующей подложкой для происходящих процессов?
Впервые возможность "пульсирующего рибосомного сокращения" в элонгационном цикле была отмечена Липманном с сотрудниками /100, 231/. В наиболее четкой форме этот вопрос был поставлен в 1968 году, когда была выдвинута гипотеза о некотором раздвижении (размыкании) двух ассоциированных рибосомных субчастиц как возможном приводном механизме транслокации /32,292/.
Однако, несмотря на неоднократные попытки экспериментальной проверки выдвинутых предположений, вопрос о структурной подвижности рибосом в процессе элонгации оставался открытым. Экспериментаторы столкнулись с целым рядом серьезных трудностей. Во-первых, необходимым требованием, в первую очередь, для физических методов исследования функционирующих рибосом является высокое (близкое к 100$) содержание гомогенных, функционально активных рибосом в препарате. В обычных препаратах рибосомная популяция гетерогенна, и только часть ее проявляет полную активность. Дополнительную сложность представляет собой получение транслирующих рибосом, находящихся на требуемой стадии элонгационного цикла. Во-вторых, бактериальная рибосома представляет собой большую рибонуклеопро-
теидную частицу с молекулярным весом около 2,7е10 и размерами
о 200-250 А, состоящую из набора различных белков (более 50) и трех
высокомолекулярных РНК. Эти свойства рибосомы накладывают существенные ограничения на выбор метода, способного зарегистрировать различия между двумя функциональными состояниями рибосомы. Вместе с тем, любые небольшие различия между двумя такими состояниями, как пре-транслокационное и пост-транслокационное, если таковые
обнаружились бы, не могут быть однозначно интерпретированы в большинстве физических методов, так как эти изменения могут быть обусловлены разным количеством (две или одна тЭДК, соответственно) и разным положением тШК-лигандов на рибосоме, но вовсе не различиями в конформации самой рибосомы как таковой.
Дня решения первой проблемы нами была развита разработанная в Институте белка техника выделения трансляционно активных рибосом путем использования колонок с поли(У), ковалентно связанной с целлюлозой или еефарозой за 3-конец через расщепляемый дисульфид-ный мостик (твердофазная система трансляции). Эта техника позволила получать препаративные количества полностью активных рибосом, находящихся либо в пре-транслокационном, либо в пост-транслокационном состоянии и способных продолжать элонгацию в любой момент, как только будут даны субстраты и соответствующая температура.
Для решения второй проблемы был использован ряд физических методов, включающий: I) метод электронной микроскопии; 2) метод седиментации; 3) метод диффузного рентгеновского рассеяния; 4) метод вариации контраста в нейтронном рассеянии.
Использование этих методов позволило решить задачу, поставленную в данной работе: сравнение компактности транслирующих рибосом, находящихся в пре-транслокационном и пост-транслокационном состояниях.
Результатом работы явился экспериментальный факт, что транслирующие рибосомы меняют свою компактность в процессе транслокации: рибосомы в пре-транслокационном состоянии более компактны, чем рибосомы в пост-транслокационшш состоянии.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РИБОСОМ.
Четвертичная структура рибосом
Первые представления о размерах и форме рибосомных субчастиц были получены при изучении морфологии рибосом методом электронной микроскопии. В 1974 году В.Д.Васильевым была предложена модель 30S субчастицы на основе данных электронной микроскопии, полученных методами негативного контрастирования и оттенения /332/. Согласно модели, 30S субчастицы рибосом представляют собой асим- о метричные вытянутые частицы длиной 220-240 А, подразделяющиеся на "головку" и асимметричное "тело" (рис.3). Полученные результаты получили свое подтверждение в работах других групп /70,71, 194/. В 1976 году Дж.А.Лэйк предложил модель 50S субчастицы рибосом на основе данных электронной микроскопии, полученных методом негативного контрастирования /195/. Так же, как и в случае 3QS субчастицы, форма 50S субчастицы оказалась асимметричной. 50S субчастица содержит центральный "протуберанец" ("головками два неодинаковых боковых отростка, один из которых (вытянутый "палец") образован комплексом белков L7/L12. Предложенная модель была подтверждена в последующих работах /29, 70,71/ и представлена на рис.4. Следует отметить, что одной из групп были предложены симметричные модели 30S и 50S субчастиц рибосом /305/. Однако эти модели оказались ошибочными, в чем сами авторы были вынуждены признаться в своих последующих работах /173/.Общепризнанными . являются модели, где форма 30S и 50S субчастиц является асимметричной. Некоторые разногласия между различными группами возникли при определении взаимной ориентации 30S и 50S субчастиц в составе 70S рибосом/70,173,195,199,322,337/. Тем не менее две группы независимо пришли к сходной ориентации 30S и 50S субчастиц /199,337/. По их данным "тело" 30S субчастицы примыкает к "телу" 50S субчастицы, "головка" 30S субчастицы - к центральному протуберанцу ("головке") 50S субчастицы и боковой выступ ("платформа") 30S субчастицы - к боковому выступу 50S субчастицы, противоположному выступу, образованному белками L7/L12 (рис.5). Несмотря на большой прогресс в области электронной микроскопии в исследовании морфологии рибосом, полученные данные не могли дать ответа на вопрос о взаимном распределении РНК и белка в составе рибосом. Ответ на этот вопрос был получен из данных диф- фузного рентгеновского и нейтронного рассеяния. В 1970 году было обнаружено, что электронный радиус инерции (Rg) 50s субчастицы рибосом,определенный малоугловым диффузным рентгеновским рассеянием, существенно меньше, чем радиус инерции, определенный из их гидродинамических свойств /272/. Анализ полученных данных позволил авторам предположить, что РНК и белок в составе 50S субчастицы распределены неравномерно: РНК расположена ближе к центру частицы, чем белковый компонент. Выдвинутое предположение было подтверждено в работах по совместному использованию трех типов излучения (рентгеновского, нейтронного и светового) /274/. Дальнейшее изучение структуры 30S и 50S субчастиц методом вариации контраста в нейтронном рассеянии /50,275,277,278,311,312/ позволило прийти к заключению, что в обеих субчастицах Rg РНК значительно меньше Rg белка.
При этом смещение центров тяжести РНК и о белка друг относительно друга невелико и не превышает 30 А. В 1979 году, используя многочисленные данные по топографии белков в рибосомных 30S субчастицах, полученные методом химических сшивок соседних белков, измерением расстояний между дейтери-рованными или флуоресцентно меченными белками, а также методом иммунной электронной микроскопии, А.С.Спирин с сотрудниками впервые предложил модель четвертичной структуры рибосомной 30S суб-частицы /34,300/. Теоретически рассчитанные для модели кривые нейтронного рассеяния при разных контрастах, а также кривые рентгеновского рассеяния хорошо совпали с экспериментальными кривыми рассеяния от ЗОВ субчастиц рибосом. Предложенная модель находится в хорошем соответствии с картой топографии 12 рибосомных белков в 35QS субчастице, построенной недавно группой Мура на основе нейтронных данных /256/. К сожалению, данных по топографии белков в рибосомных 5QS субчастицах (см., например,/173,197,198,328/) пока далеко не до- статочно для построения модели четвертичной структуры 50S субчастицы. Развитие методов иммунной электронной микроскопии и химических сшивок соседних белков позволило также провести локализацию на рибосоме 3-концов I6s РНК /280/, 5S РНК /281/ и 23S РНК /282/, 5-конца 16S РНК /218/, а также локализовать факторы инициации IP-1, ГР-2, IF-3 /197,252,308/, фактор элонгации EF-G /126/ и мРНК /107,308/. Четких экспериментальных данных о локализации тРНК на рибосоме пока нет. Предложены две модели: в первой, предложенной - Дж.Лэйком, тРНК-связывающие А- и Р-участки расположены в районе бокового выступа ("платформы) ЗОВ субчастицы /196,197/, во второй модели, предложенной А.С.Спириным, тРНК-связывагощие А- и Р-участки расположены с противоположной стороны 30S субчас-тицы, в районе, примыкающем к "пальцу" Ь7/Ы2 50S субчастицы /301/. Несмотря на то, что вторая модель наилучшим образом согласуется с существующими экспериментальными данными, для окончательного разрешения существующего противоречия необходимы прямые эксперименты.
Вместе с тем, весь объем данных по локализации компонентов трансляции на рибосоме позволяет сделать один общий вывод: все компоненты трансляции находятся в зоне контакта 30S и 50S субчастиц, в межсубъединичной полости. В итоге, результаты исследований структуры рибосом и их компонентов различными методами можно сформулировать следующим образом: I) Все, или, по крайней мере, большая часть белков в составе рибосом являются глобулярными. 2)Рибосомная РНК имеет доменную организацию (3 и 6 доменов в 16S и 23S РНК, соответственно, с ярко выраженной вторичной структурой). 3) РНК в составе рибосом компактна и имеет специфическую (v-об-разную в случае 16S РНК) конформацию. 4) Субчастицы рибосом представляют собой, по-видимому, структуру, образованную РНП-доменами (блоками), где рРНК играет каркасную роль, 5) Субчастицы рибосом имеют асимметричную трехмерную; структуру с ярко.:выраженными морфологическими особенностями. 6) РНК в субчастицах расположена ближе к центру, чем белковый компонент. Расстояние между центрами масс РНК и белка не превы- о шает 30 А. 7) Рибосомные субчастицы в составе 70S рибосомы ассоциированы таким образом, что "головка" 30S субчастицы примыкает к "головке" (центральному выступу) 5S субчастицы и "боковой выступ" ("платформа") 30S субчастицы примыкает к "боковому выступу" (Ы протуберанцу) 50S субчастицы. 8) Во всех изученных случаях компоненты трансляции взаимодейст вуют с 70S рибосомой в зоне контакта 30S и 50S субчастиц, в меж- субъединичной полости. Самой яркой структурной особенностью рибосомы является то, что она всегда построена из двух лабильно ассоциированных субчастиц. Для бактериальных 70S рибосом этот универсальный принцип их структурной организации был открыт Тиссьером и Уотсоном /323/. В своих классических работах /323,324/ авторы показали, что для поддержания ассоциированного состояния 70S рибосом требуется концентрация Mg++ в растворе около 10 мМ; понижение концентрации Mg++ до 1-0,1 мМ вызывает их диссоциацию на JOS и 50S субчастицы. Вскоре было обнаружено, что кроме Mg++ ионы Са++» Мл++ї Со++ также эффективны в поддержании ассоциированного состояния рибосом, в то время как другие двухвалентные ионы, такие, как Sr+% Ва++, Cd++, Hg++, Ni++, Zn++ неэффективны в ассоциации или обладают сильным диссоциирующим воздействием /3,92,264/. Органические двух-валентные и поливалентные катионы (спермин, спермидин) также являются сильными стабилизаторами ассоциированного состояния рибосом /3,23,99,115,147,237,263,286,362/. Повышение в растворе концентрации одновалентных катионов (% НН4+, Cs+, Rb+, Na+, Ьі+) способствует диссоциации 70S рибосом /3,28,92,296,324,364/, причем Na+ и Li+ даже при относительно низких концентрациях обладают сильной диссоциирующей активностью. /3,39,313/.
Функционирование рибосом
Рибосома является молекулярной машиной, в которой осуществляется трансляция информации, закодированной последовательностью нуклеотидов матричной РНК,в последовательность аминокислот полипептидной цепи. Для осуществления трансляции рибосомы должны быть снабжены: I) матричным полинуклеотидом, в качестве которого в клетках выступают естественные информационные РНК (мРНК), а в бесклеточных системах их роль могут выполнять также различные синтетические полирибонуклеотиды; 2) аминокислотами, поступающими в рибосому в виде,аминоадил-тРНК(аа-тРНК); 3) факторами элонгации; 4) GTP; 5) надлежащими неорганическими двухвалентными (Mg++ или Са++) и одновалентными (к+ или НН +) катионами в определенном соотношении; 6) соответствующими условиями среды (рН, температура)/ 6,34/ Только полная рибосома, состоящая из двух субчастиц, может осуществлять весь процесс трансляции в белок-синтезирующей системе /34/. Согласно современным представлениям, рибосома не размещает на себе весь матричный полинуклеотид, а последовательно перемещает его в направлении от 5-конца к 3-концу /290,321/. При этом на рибосоме синтезируется полипептидная цепь белка последовательно от N-конца к Ст-концу.їїри удлинении полипептидной цепи на один аминокислотный остаток матричная РНК смещается относительно рибосомы на три нуклеотида /142/. Общая схема функционирования рибосомы в наиболее четкой форме была сформулирована Дж.Уотсоном /341,342/ и Ф. Липманном /205/. Согласно этой схеме, элонгация полипептида на рибосоме осуществляется путем повторения циклов, каждый из. которых состоит их трех последовательных стадий: связывания аминоацил-тРНК, транспептидации и транслокации. В процессе элонгации рибосома может удерживать только одну молекулу мРНК и вести синтез только одной полипептидной цепи. Было постулировано два участка связывания тРНК на рибосоме - А-участок (акцепторный) и Р (или Д)-участок (донорный). На первой стадии элонгационного цикла аминоацил-тРНК взаимодействует с А-участком и расположенным там свободным кодоном матрицы. Связывание катализируется фактором элонгации a?u(EFu) с GTP. В Р-участке в этот момент находится другая молекула тРНК, несущая растущий пептид (пептидил-тРНК). На стадии транспепти-дации аминоацил-тРНК реагирует с пептидил-тРНК так, что осуществляется переброс1 С-концевой карбоксильной группы пептида на аминогруппу аминоацил-тРНК. В результате пептидил-тРНК, удлиненная на один аминокислотный остаток, занимает А-участок, а в Р-участке находится деацилированная тРНК. Такое состояние рибосомы называется пре-транслокационным состоянием. Реакция транспептидации катализируется пептидил-трансферазным центром самой рибосомы. На стадии транслокации пептидил-тРНК вместе с кодоном матрицы перемещается из А-участка в Р-участок, а деацилированная тРНК освобождается из Р-участка в раствор.
Стадия транслокации катализируется фактором элонгации G (EP-G).B результате транслокации пептидил-тРНК вновь находится в Р-участке, а А-участок свободен для связывания следующей аминоацил-тРЖ. Такое состояние рибосомы называется пост-транслокационным состоянием. Схема модели элонгационного цикла представлена на рис.6. Экспериментальные факты, полученные за последующие годы существенно расширили и дополнили представление о механизме функционирования рибосом, но не внесли при этом каких-либо принципиальных изменений в предложенную схему элонгационного цикла. Факторы элонгации. Факторы элонгации являются важными компонентами белок-синтезирующей системы. В бактериальных системах фактор элонгации TU(EFU) осуществляет ускорение процесса связывания аминоацил-тРНК с рибосомой, фактор элонгации G(EF-G) ускоряет процесс транслокации. Оба фактора при своем функционировании осуществляют гидролиз GTP до GDP и ортофосфата. Фактор элонгации TgCEFg) ускоряет обмен GDP, находящегося в комплексе с ЕР-ТЦ на GTP. Основные физико-химические свойства факторов элонгации можно найти в обзоре /176/. При детальном изучении роли факторов элонгации в рибосомном синтезе полипептида различные группы авторов обнаружили, что факторы элонгации не являются необходимым компонентом белок-синтезирующей системы: рибосомы способны, хотя и с меньшей эффективностью, синтезировать полипептид и в отсутствие факторов трансляции (неэнзиматическая система трансляции) /4,10,11,12,13,27,42, 118,119,120,121,122,131,144,244,245,246/. Было показано, что удаление белка S12 или обработка рибосом парахлормеркурибензоатом, приводящая к подавлению энзиматической трансляции, стимулирует фактор-независимую систему трансляции /11,12,42,118,119,120,121/. мРНК. 70S рибосома имеет один участок связывания мРНК /174,226/. Этот участок расположен на 3QS субчастице рибосом, 50S субчастица вносит, по-видимому, несущественный вклад в константу ассоциации мРНК (поли(У)) с 70S рибосомой /174/. Количественные данные по константам ассоциации (К&) мРНК с рибосомами немногочисленны и сильно различаются у разных групп авторов /153,154, 155,156,174,266/. Присутствие на 70S рибосоме соответствующих кодону тРНК увеличивает константу ассоциации мРНК с рибосомой на 2-3 порядка /153,154,155,156/. Ни целостность мРНК, ни даже ее присутствие на рибосоме не являются необходимым условием синтеза полипептида.
Показано, что рибосома способна синтезировать полипептид при последовательном поступлении в нее отдельных тринуклеотидов /326/, а также, хотя и с существенно меньшей эффективностью, синтезировать полипептиды в отсутствие матрицы /35,58,59/. тРНК. Большая часть экспериментальных данных, полученных за последние 15 лет, хорошо согласуется с постулированными Уотсоном двумя центрами связывания тРНК на рибосоме. На естественных матрицах было показано, что с инициаторным комплексом мРНК 70Б фор-милметионил-тРНК дополнительно связывается только одна аминоацил-тРНК, соответствующая следующему за инициаторным кодону /265/. Показано также, что 70S рибосома может связать: лишь одну молекулу инициаторной формилметионил-тРНК как в присутствии матрицы, так и в отсутствие ее /156,267/; две молекулы пептидил-тРНК /135, 154,155,186,238,248,267/; две молекулы аминоацил-тРНК /155,184, 257,267/; две молекулы деацилированной тРНК /110,154,155,156,266, 267/. Связанные с рибосомой тРНК имеют кодон-антикодоновое взаимодействие с матричным полинуклеотидом как в А-участке, так и в Р-участке/ 110,111,153,184,209,238,240,248,358/. Данные по количественному изучению констант ассоциации тРНК и их производных с А и Р-участками рибосомы имеют сильное несовпадение между различными группами авторов /110,154,155,156,179,184,185,186,187,238, 248,257,266,267,346,348/. Однако во всех исследованиях однозначно показано, что сродство (константа ассоциации) тРНК к Р-участку рибосомы всегда выше, чем сродство соответствующей тРНК к А-учас-тку (на 1-3 порядка) как в присутствии, так и в отсутствие матричного полинуклеотида /ПО,154,155,186,187,238,248,257.,,267, 346,348/ В таблице 2 для примера представлены данные по константам ассоциации тРНК к А-участку и Р-участку рибосом, собранные из работ одной группы авторов /179,184,185,186,187/. Константа ассоциации тРНК с 70S рибосомой снижается при понижении концентрации Mg++/I79,184,185,186,187/ или при повышении температуры /179,185/. Следует отметить, что за последние годы появились работы, указывающие на наличие трех неперекрывающихся центров связывания деацилированной тРНК на 70S рибосоме /135,187, 257/. Эти данные находятся в противоречии с результатами других групп, в которых, как уже говорилось, было обнаружено два участка связывания деацилированной тРНК с 70S рибосомой. Ответ на вопрос, с чем связаны эти различия в экспериментальных данных, а также на вопрос, имеет ли третий участок связывания тРНК функциональное значение или представляет собой участок нефункциональной сорбции тРНК на 70S рибосоме, смогут дать лишь дальнейшие тщательные эксперименты.
Аминоацилирование суммарной тРНК фенилаланином
Аминоацилирование тРНК/10/ проводили в течение 15-20 мин при 37 в буфере 50 мМ трис-HCl рН 7,5, содержащем 10 мМ MgCl2 и 100 мМ КС1. I мл инкубационной смеси содержал: I мг тРНК, 0,1-0,2 мг белка ферментной фракции, 3 мкмоля АТР и 5 нмолей фенилала-нина (IrHjPhe или _I4CJPhe ). Реакцию останавливали добавлением 0,3 объема 0,5$ раствора цетилтриметиламмонийбромида в 0,5 М К-фосфатном буфере рН 6,0. . При выдерживании в течение нескольких минут во льду выпадал осадок тРНК и части белков ферментной фракции. Осадок отделяли центрфугированием при 6 000 об/ мин при +4, растворяли в 2 М NaCl (до концентрации тРНК - 5-Ю мг/мл) и добавляли 2,5 объема холодного этанола. Осадок вновь растворяли в 2 М NaCl и переосаждали этанолом. Затем осадок растворяли в воде и тРНК осаждали, добавляя неї до 0,1 М. Осадок быстро отделяли центрифугированием, растворяли в 2 М NaCl и осаждали 2,5 объемами холодного этанола; переосаждение этанолом из раствора в 2 М NaCl повторяли. Окончательно осадок растворяли в 0,2 М CH CooifepH 5,5 и осветляли от остатка денатурированных белков центрифугированием. тРНК осаждали этанолом, осадки трижды промывали этанолом и лиофильно высушивали. Сухие препараты аминоацил-тРНК хранили на холоду в присутствии силикагеля. Удельное содержание РЬе-тРНК в препарате составляло 0,8-1,0 нмолей на I мг тотальной тРНК. Фрагментация поли(У). Для получения поли(У) со степенью полимеризации Z=II0-I40 нуклеотидов высокомолекулярную поли(У) я=500 подвергали кислотному гидролизу. Для этого высокомолекулярную поли(У) растворяли в Н20 до концентрации 20 мг/мл. Раствор нагревали до 25С и добавляли к нему равный объем 0,1 н ноі при 25С /55/.Гидролиз вели при 25С в течение 12-16 мин. Время гидролиза определяли из аналитических экспериментов так, чтобы средняя длина фрагментированной поли(У) составляла II0-I40 нуклеотидов. Реакцию гидролиза останавливали добавлением 0,05 н . NaOH до нейтрального рН. К раствору добавляли 2 М CH,COONa, рН 5,2 до конечной концентрации 0,1 М и 2,5 объема этанола. Смесь охлаждали до 0С. Поли(У) осаждали центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 20 мин. Среднюю длину фрагментированной поли(У) определяли при помощи аналитического ультрацентрифугирования в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,1, содержащем 2 М NaCl и 0,1 М ЕДТА /162/. Обработка щелочной фосфатазой.Для отщепления 3 -концевого фосфата фрагментированную поли(У) растворяли в буфере 10 мМ трис-HClt рНз7с 8 0» содержащем I мМ MgCl2 и I мМ меркаптоэтанола.
Концентрация поли(У) составляла 10 мг/мл. К раствору добавляли щелочную фосфатазу из расчета 100 мкг фермента на 100 мг поли(У). Обработку поли(У) щелочной фосфатазой вели в течение 2,5 часов при 37. Затем к раствору добавляли равный объем водонасыщенного фенола (рН 7,0) и проводили фенольную депротеинизацию при интенсивном механическом встряхивании в течение I часа. Смесь центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Водную фазу собирали, к фенольной фракции добавляли равный объем 1 0 и повторяли встряхивание в течение I часа. Смесь вновь центрифугировали и собирали водную фазу. Водные фазы объединяли. К раствору добавляли 2 М CH3C00Na, рН 5,2 до конечной концентрации 0,1 М и 2,5 объема этанола. После охлаждения до 0С поли(У) осаждали центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру переосаждения поли(У) из водного раствора повторяли трижды. Периодатное окисление поли(У). Обработанную щелочной фос-фатазой поли(У) растворяли в Н20 до конечной концентрации 20 мг/ мл, добавляли равный объем раствора периодата натрия в Н20 (16 мг/мл) и проводили периодатное окисление поли(У).при 25С в течение I часа в темноте.После инкубации поли(У) трижды переосаждали 2,5 объемами этанола из раствора 0,1 М OH COONa pH 5,2. Пе-риодатно-окисленную поли(У) растворяли в Н20 и лиофилизовали. 7. Получение поли(У). ковалентно связанной с твердым носителем (сефарозой) за 3 -конец через расщепляемый S-S-мостик (Сефароза--8-поли(У)). Получение Сефарозы-Б-б-поли(У) проводили в основном согласно методике, описанной ранее/7,48,53/ . 5 г CNBr-активированной се-фарозы (из расчета на 100 мг поли(У)) суспендировали в 50 мл 0,01 н НС1, инкубировали 30 мин при 25С. Промывали сефарозу на стеклянном фильтре 100 мл 0,01 н неї, 200 мл Н20, а затем 50 мл буфера 0,2 М к2НР0 рН 8,2."Суспендировали сефарозу: в 50 мл того -же буфера, содержащего I г дигидразида дитиодигликолевой.кислоты. (H2NNHC00H2-S-S-0H2C0imNH2 ). Инкубацию вели в течение 5 часов при 4С с постоянным перемешиванием. По окончании инкубации се-фарозу промывали на стеклянном фильтре 50: ш буфера 0,2 М iyffcy рН 8,2, I л Н20, 100 мл буфера I М CH,COONa, рН 5,3. Суспендировали сефарозу в 50 мл буфера I М CH OOONa, рН 5,3, содержащего 100 мг фрагментированной периодатно-окисленной поли(У). Инкубацию вели в течение 15-20 часов при+4С с постоянным перемешиванием. По окончании инкубации сефарозу промывали на стеклянном фильтре 100 мл I MCIUCOONa, рН 5,3, 2 М КС1 до полного отсутствия поглощения при 260 нм в промывных водах (около 100 мл 2 МКС1), а затем 0,5 л 0. Суспендировали сефарозу в Н2О до конечной концентрации 100 мг сефарозы на I мл суспензии. Сефарозу-Б-б-полиСУ) хранили в HgO под толуолом при.4С в течение 1-2 месяцев. Количество поли(У), связанной с сефарозой, определяли путем гидролиза связанной поли(У) панкреатической рибонуклеазой. Для этого 5-Ю мг Сефарозы-8-8-поли(У) суспендировали в 2 мл Е О, добавляли панкреатическую рибонуклеазу до конечной концентрации 0,01 мг/мл и инкубировали в течение 20 мин при 37С. Сефарозу осаждали центрифугированием, количество гидролизованной поли(У) определяли спектрофотометрически при 260 нм. Средняя емкость смолы составляла 10-15 мг поли(У) на I г сефарозы. 8. Подбор оптимальных соотношений компонентов трансляции на свободной поли(У). Выбор оптимальных условий трансляции (соотношений концентраций компонентов трансляции) проводили для каждой новой партии компонентов трансляции.
Для этого использовали простой принцип, применимый для многокомпонентной системы без ингибиторов: многокомпонентная система, состоящая из ферментов Е и субстратов А.,, считается оптимизированной по компонентам трансляции, если концентрации всех ферментов [Е.] соответствуют точке перегиба кривой дозовой зависимости по каждому из ферментов в т.е. ни один из ферментов не является лимитирующим, а субстраты А. находятся в избытке в изучаемом интервале времени /I/ . Решение задачи сводится к следующему: при выбранных технически удобных концентрациях компонентов [ EjJ и Г А Л снимают кинетику образования продукта. На возрастающем участке кинетической кривой снимают дозовую зависимость по любому из ферментов, скажемГЕ ]и выбирают концентрацию j0 на возрастающем участке дозовой зависимости. При таком выборе стадия, обслуживаемая ферментомEj, является лимитирующей и, следовательно, все ферменты J и субстраты А., оказываются в избытке. Затем снимают дозовые зависимости по остальным ферментамEi,1 при концентрации фермента Ej, равной ] Ej]0, и выбирают концентрации p L в точках перегиба дозовой зависимости. В результате такой процедуры концентрации ферментов Ei будут соответствовать точке перегиба кривой дозовой зависимости по каждому из ферментов, включая фермент Е -. Концентрации (количества) субстратов А определяют в соответствии с временем процесса или с требуемым количеством продукта. Экспериментальные данные по оптимизации системы трансляции, состоящей из 70S рибосом, свободной поли(У), ферментной фракции 8100, тотальной тРНК и субстратов ATP,GTP и 4cjphe, представлены на рис. 7. Инкубацию вели при 25С в буфере 20 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ%С12, 100 мМНН СІ (стандартный буфер). В результате, оптимизированная по компонентам система трансляции состояла из 50 мкг 70S рибосом, 65 мкг ферментной фракции S100, 30 мкг тотальной тРНК., 70 мкг свободной поли(У), в 100 мкл стандартного буфера, содержащего 3 мМАТР, 0,4 мМ GTP, 5 мкМ [I4CjPhe. Отклонение соотношений компонентов от партии к партии не превышало 20$ указанных значений.Количество насинтезированного поли( Phe) определяли путем горячего Ш-осаждения . Для этого в пробы заливали 5 мл Ъ% ТХУ, добавляли 50 мкг альбумина в качестве носителя и гидролизовали образцы при 90 С в течение 15 мин.
Сравнительный седиментационный анализ пре-транслокационных и пост-транслокационных состояний рибосом
Смесь пре-транслокационных рибосом, несущих (1 CJ поли Phe и пост-транслокационных рибосом, несущих [ 1 поли РЬе, была приготовлена для седиментации как описано в п.12 раздела "Материалы и методы". На рис. 15 (а) представлен полный профиль седиментационного распределения I CJ пре-транслокационных и [ J пост-транслокационных рибосом при скорости седиментации 20 000 об/мин. На рис. 15 (б) представлена зона 70S рибосом того же профиля в увеличенном масштабе. Для удобства анализа профили седиментационного распределения транслирующих рибосом представлены на рисунках в нормированном виде: значение радиоактивности в каждой фракции разделено на значение максимальной радиоактивности во фракции, соответствующей пику зоны 70S рибосом. Анализ показал, что коэффициент седиментации рибосом, находящихся в пре-транслокационном состоянии, превышает коэффициент седиментации рибосом, находящихся в пост-транслокационном состоянии, на величину около 1S. Аналогичные результаты были получены при центрифугировании транслирующих рибосом на скорости 30 000 об/мин и 40 000 об/мин (рис.15 (в,г) ). Изменение скорости центрифугирования не приводило к изменению различий в скорости седиментации пре-транслокационных и лост-транслокационных рибосом. Таким образом, можно сделать вывод, что транслирующие рибосомы, находящиеся в пре-транслокационном состоянии, имеют коэффициент седиментации Ha1S больше, чем рибосомы, находящиеся в пост-транслокационном состоянии. Наблюдаемое различие не зависит от скорости центрифугирования (гидростатического давления) в диапазоне скоростей 20 000-40 000 об/мин. Возникает вопрос: не связаны ли наблюдаемые различия в коэффициентах седиментации рибосом, находящихся в пре-транслокаци-онном и пост-транслокационном состояниях, с различием в составе их компонентов? Согласно существующим представлениям, рибосомы в пост-транслокационном состоянии несут пептидил-тРНК в рибосомном Р-участке, а А-участок рибосом при этом вакантен. Рибосомы, находящиеся в пре-транслокационном состоянии, несут пелтидил-тРНК в А-участке и деацилированную тРНК в Р-участке. Наличие дополнительной тРНК в рибосомах, находящихся в пре-транслокационном состоя-нии, соответствует увеличению молекулярного веса частиц на величину около 1% по сравнению с молекулярным весом пост-транслокаци онных рибосом.
Это различие в молекулярном весе может приводить к различию коэффициентов седиментации частиц на величину, соответствующую наблюдаемым различиям в 1S. В попытках ответить на этот вопрос мы обнаружили, что при повышении концентрации NH Cl в растворе до 500 мМ различия в коэффициентах седиментации пре-транслокапионных и пост-транслокационных рибосом полностью исчезали (рис.16). Анализ компетентности рибосом к пуромицину показал, что функциональные состояния пре-транслокапионных и пост-транслокационных рибосом при седиментации в буфере с такой концентрацией зга сі полностью сохраняются. В контрольном эксперименте смесь рибосом в пре-транслокационном и пост-транслокационном состояниях диализовали на холоду (+4С) в течение 15 часов против буфера, содержащего 500 мМ нн.сі, а затем диализовали обратно в буфер, содержащий 100 мМ нн сі. Параллельно, в течение того же времени, вели диализ двух аликвот смеси против буфера, содержащего 100 мМ NH40l и буфера, содержащего 500 мМ NH Ol. Седиментационный анализ показал, что при диализе рибосом из буфера с высокой ионной силой (500 мМ HH Ol ) в стандартный оуфер (100 мМ NH Cl) различия в коэффициент тах седиментации пре-транслокационных и пост-транслокационных рибосом восстанавливаются (рис.17). Из полученных данных можно заключить, что исчезновение различий в коэффициентах седиментации пре-транслокационных и пост-транслокационных рибосом в высокой ионной силе не связано ни с какими-либо необратимыми изменениями в структуре рибосом, ни с изменением их функционального состояния. Тем не менее, оставалась еще возможность, что в высокой ионной силе пре-транслокационные рибосомы могут терять деацилиро- ванную тРНК из Р-участка без изменения функционального состояния, т.е. без транслокации пептидил-тРНК. Для проверки последнего предположения был проведен специальный седиментационный анализ. С этой целью при помощи твердофазной системы трансляции были получены транслирующие_рибосомы в пре-транслокационном состоянии, несущие в А-участке [ %] полифенилаланил-тРНК, а в Р-участке де-ацилированную [ CJ тРНК. Для этого на колонках с поли(У), ковалентно связанной с твердым носителем (сефарозой), были получены рибосомы, несущие [чй поли Phe, находящиеся в пост-транслокаци-онном состоянии и отмытые от компонентов трансляции и примесей нетранслирующих рибосом, согласно описанной процедуре (п.9 раздела "Материалы и методы"), единственным ; отличием являлось то, что в системе трансляции была использован тотальная тРНК, меченная L CJ . В результате, пост-транслокационные рибосомы в колонке несли в Р-участке 1] поли РЬе[14С] -тРНК. Затем рибосомы были переведены в пре-транслокационное состояние пропусканием через колонку немеченой Phe-тРНК в течение 30 минут при +4С в бу- фере 20 мМ трис-нсі, рН 7,5, 20 мМ MgCl2, 100 мМ HH Cl. Колонку отмывали тем же стандартным буфером от избытка РЬе-тРНК, и транслирующие рибосомы элюировали с колонки буфером, содержащим 20 мМ дитиотреит (см. п.9 раздела "Материалы и методы"). Получен- ные пре-транслокационные рибосомы несли участке и [14с]тРИК в Р-участке. Компетентность к пуромицину полученных рибосом составляла 14%, что и соответствует 83$ частиц, находящихся в пре-транслокационном состоянии. Адиквоты рибосом диализовали в буфер, содержащий 100 мМ HH Ol и 500 мМ нн оі и проводили седиментацию рибосом в сахарозном градиенте, приготовленном на соответствующем буфере (рис.18).
Седиментацион-ный анализ показал, что количество 4СтРНК в зоне рибосом не отличается при седиментации в 100 мМ NH401 и 500 мМ їШ СІ Следовательно, деацилированная тРНК в Р-участке рибосом, находящихся в пре-транслокационном состоянии,, сохраняется при седимен тации рибосом в высокой ионной силе (500 мМ ш4Сі). Таким образом, исчезновение различий в коэффициентах седиментации рибосом, находящихся в пре-транслокационном и пост-транслокационном состояниях, при седиментации их в высокой ионной силе (500 мМ т4сі) не связано ни с изменением функционального состояния рибосом, ни с изменением их состава (две тРНК и одна тРНК, соответственно). Резюме. Из анализа полученных экспериментальных данных сделаны следующие заключения: I) рибосомы в пре-транслокационном состоянии имеют коэффициент седиментации на 1S больше, чем рибосомы в пост-транслокационном состоянии; 2) это различие в коэффициентах седиментации не зависит от гидростатического давления (в пределах центробежных полей при скоростях от 20 000 до 40 000 об/мин) и не является прямым вкладом дополнительной тРНК в пре-транслокационных рибосомах ; 3) различия в коэффициентах Работа выполнена совместно с лабораторией физики нуклеопро-теидов института белка АН СССР (руководитель И.Н.Сердюк) и с Институтом Лауэ-Ланжевена, Гренобль, Франция (руководитель Б.Жакро). Процедуры подготовки препаратов транслирующих рибосом для исследований описаны в пунктах 13 и 14 раздела "Материалы и методы". Там же приведены основные характеристики исследуемых образцов. На рис. 19 представлена зависимость интенсивности рассеяния нейтронов (I) от вектора рассеяния (J\) в координатах Гинье (in I против JA ) для пре-транслокациошшх (А) и пост-транслокационных (Б) состояний рибосом при разных контрастах: HgO; 97$ тЕ О и 83$ о о 0. Ни в Н2О, ни в 0 не наблюдалось резкого подъема интен сивности рассеяния при самых малых исследованных углах (А 0,006 о-1 А ), что свидетельствует об отсутствии агрегатов в препаратах рибосом в процессе измерений. Кривые в координатах Гинье аппроксимировали прямыми в интервале векторов рассеяния 0,006 // 0,027 А и по наклону прямых определяли радиус инерции Rg частиц. Результаты вычислений нейтронных радиусов инерции транслирующих рибосом представлены в таблице 4 . Зависимость нейтронного радиуса инерции Rg транслирующих рибосом от контраста др в коор-динатах Штурмана (Hg2 протав І/Др) представлена на рио.20. Ука-занная величина ошибки соответствует І,5(Ґ.
