Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы 7
1. Методы исследования состояния популяций водорослей в норме и при экстремальных воздействиях 7
1.1. Интегральные методы 8
1.1.1. Определение общей численность клеток и анализ полученных результатов 8
1.1.2. Интегральные методы оценки состояния культуры водоросли по люминесценции и флуоресценции хлорофилла 12
1.2. Методы изучения гетерогенности популяции 16
1.2.1. Основные подходы к объяснению гетерогенности популяции микроводорослей 17
1.2.2. Изучение морфологических характеристик отдельных клеток 21
1.2.3. Изучение размерной гетерогенности культур микроводорослей 23
1.2.4. Изучение флуоресцентных характеристик отдельных клеток 24
1.2.5. Изучение полярных характеристик клеток 26
1.2.6. Дифференциальное окрашивание и плазмолитическнй методы 26
1.2.7. Методы микро и макроколоний (методы подращивания) 27
1.2.8. Технические методы отбора отдельных клеток 29
2. Водоросли, как тест - объект при оценках качества водной среды 31
II. Материалы и методы исследования 38
1. Объект исследования 38
2. Техника культивирования 38
3. Исследуемые показатели 39
III. Результаты и обсуждение 42
1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Scenedesmus quadricauda 42
1.1 Развитие культур водоросли Scenedesmus quadricauda 42
1.2 Получение микрокультур водорослей 44
1.3 Сопоставление развития макро- и микрокультур 46
2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda по выживаемости и способности клеток к делению 49
2.1 Исследование методом микрокультур фракционного состава макрокультур в разные периоды роста 49
2.2 Оценка наследуемости структуры микрокультур 54
2.3 Исследование флуоресценции хлорофилла водорослей 55
2.4. Исследование линейных размеров клеток водорослей 58
3. Исследование влияния хлорида меди на выживаемость и размножение Scenedesmus quadricauda 61
3.1 Влияние внесения меди на лаг-фазе роста макрокультуры 61
3.2 Влияние внесения меди на экспоненциальной фазе роста макрокультуры 70
3.3 Влияние внесения меди на стационарной фазе роста макрокультуры 76
3.4 Влияние меди на флуоресценцию хлорофилла водорослей 80
3.5 Влияние меди на линейные размеры клеток водорослей 81
4. Определение времени лизиса отмирающих клеток Scenedesmus quadricauda и оценка влияния на скорость процесса присутствия токсиканта 85
Заключение 88
Выводы 91
Список литературы 93
Приложение 105
- Методы изучения гетерогенности популяции
- Водоросли, как тест - объект при оценках качества водной среды
- Исследование гетерогенности лабораторной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda по выживаемости и способности клеток к делению
- Исследование влияния хлорида меди на выживаемость и размножение Scenedesmus quadricauda
Введение к работе
Токсичные вещества оказывают влияние на самые разные компоненты водных биоценозов: бактерии, водоросли, простейшие, ракообразные, моллюски, рыбы и др. При этом их влияние сказывается как на уровне отдельного организма или клетки, так и на уровне всей популяции и экосистемы в целом.
Удобным объектом изучения влияния токсичных веществ на популяцконном уровне являются культуры микроводорослей. Главным образом, это связано с коротким жизненным циклом отдельных клеток, что позволяет в ходе одного опыта проследить влияние неблагоприятного фактора на нескольких поколений. Кроме того, высокая численность клеток в опыте позволяет получать массовый материал для статистических сравнений.
Особый интерес к процессам, происходящим в популяции культивируемых одноклеточных организмов, появился в 50-х годах прошлого века, когда были опубликованы работы, в которых популяцию (в первую очередь, микроорганизмов) стали рассматривать как единую систему со многими разнообразными связями; систему, которая нередко ведет себя как целостный организм. В частности, в работах Иерусалимского И.Д. (1952) отмечается, что популяции микроорганизмов даже в пределах лабораторных культур характеризуются:
1) фенотипической гетерогенностью составляющих ее клеток как основой для дифференциации клеток по социальным ролям; 2) наличием внутри популяции (например, колонии микроорганизмов) в той или иной мере обособленных микроколоний; 3) целостностью популяции в процессе развития, наличием у нее интегральных свойств, отсутствующих у индивидуальных клеток; 4) способностью популяции влиять на характеристики окружающей среды при достаточной плотности клеток в ней.
Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток (Олескин, 2001). Так в популяции микроорганизмов отмечают наличие активно делящихся, покоящихся и спонтанно
5 автол изирующихся клеток (Уголев, 1987). Особенно четким разделение клеток на эти группы становится в стационарной фазе роста (Ждан-Пушкнна, Хасанова, 1991). Гетерогенность (разнородность) клеток в популяции обеспечивает устойчивость культуры к меняющимся внешним условиям (Greenberg, 2003).
По сравнению с микроорганизмами культуры водорослей изучены слабее, но имеющиеся данные позволяют предположить наличие сложных связей и в их популяциях.
Так в культурах водорослей предполагается появление резерва покоящихся клеток, обеспечивающего выживание популяции в целом при неблагоприятном воздействии (Гапочка, 1981; Саакян, 1987). Кроме того, у водорослей была обнаружена программируемая клеточная смерть, ранее описываемая только у микроорганизмов (Segovia, 2003). Этот феномен является ярким примером социального контроля, когда в интересах популяции в целом происходит гибель отдельных клеток.
Другим примером сложности процессов, происходящих в популяции микроводорослей, является наличие у них сложной коммуникативной системы. Информация между клетками культуры может передаваться с помощью различных химических агентов, на уровне метаболитоввыделяемых клетками в среду (Кажлаева, Плеханов, Максимова, 1991); путем контактного ингибирования (Costas et al, 1993). Одним из средств передачи информации может являться кальций, входящий в состав оболочки клетки (Sanders, Brownlee, Harper, 1999). Установлена возможность передачи информации из поколения в поколение путем записи ее в клеточную мембрану (Costas, Rodas. Lopez, 1991).
Вместе с тем, малоизученными остаются вопросы о роли гетерогенности культуры в процессах ее роста и развития. Не известно, какая часть клеток в популяции участвует в процессах размножения.
Целью настоящей работы являлась исследование структурных перестроек модельной популяции водоросли Scencdesmvs quadricauda в норме и при токсическом воздействии.
Задачами работы служило следующее:
1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Scenedesmus quadricauda и наблюдения за микрокультурами;
Исследование гетерогенности лабораторной популяции водорослей по выживаемости и способности отдельных клеток к делению;
Изучение влияния токсического воздействия на выживаемость и размножение водорослей в лабораторных популяциях;
4. Определение временив лизиса отмирающих клеток водорослей и оценка влияния на скорость лизиса присутствия токсиканта.
Методы изучения гетерогенности популяции
Гетерогенность является одним из основных свойств природных и культивируемых популяций (Шварц и др., 1976). Индивидуумы, образующие популяцию, не тождественны, они отличаются по возрасту, размерам, скоростям роста и, что особенно важно, по реакциям на изменение условий обитания. Подробная неоднородность качественного состава необходима для обеспечения устойчивости популяции и се адаптации к внешним условиям (Гапочка, 1994).
Кроме того, быстро меняющиеся условия среды, как правило, способствуют увеличению степени гетерогенности популяции (Веселовский, 1990). Так в работе Позмоговой (1983) показано, что при быстром изменении условий культивирования микроорганизмов происходит расширение спектра различающихся по ряду признаков клеток. В другой работе (Веселова и др., 1990) приведены данные о том, что переход клеток тетрахимены и дуналиеллы из состояния гомеостаза в стресс, вызванное добавлением меди, характеризуется увеличением размаха варьирования функциональных показателей клеток, Таким образом, изучение гетерогенности популяции водоросли позволяет, кроме прочего, по размаху колебаний показателей определять, находится ли культура в состоянии стресса.
Исследования Michalski et la (2002) показали, что гетерогенность популяции имеет важное значение для проявления эффекта гормезиса. Так было продемонстрировано, что гомерзис более выражен в низко гетерогенных популяциях, при увеличении гетерогенности проявление этого эффекта ослабляется.
Таким образом, характеристика состояния популяции, помимо интегральных показателей, таких, как общая численность клеток и фотосинтетическая активность культуры в целом должна включать в себя параметры гетерогенности исследуемой культуры,1.2.1. Основные подходы к объяснению гетерогенности популяции микроводорослей
Одним из распространенных подходов к объяснению наблюдаемой гетерогенности культур водорослей, является возрастной подход. По мнению сторонников этого подхода, все различия между отдельными клетками могут быть объяснены с точки зрения нахождения их в разных фазах жизненного цикла. В этом случае полностью синхронизированная культура будет однородной и характеристики всей культуры будут распространяются на каждую клетку в отдельности. Синхронизация достигается разными способами: чередованием периодов света и темноты ; центрифугированием;отстаиванием культуры в темноте с последующим отбором верхнего столба жидкости, содержащего молодые клетки (Pirson, Lorenzen, 1966; Андреева, 1975).
При этом динамика показателен роста синхронной культуры будет по существу отражать жизненный цикл данного вида водоросли
Впервые исследования жизненного цикла водорослей рода Sccnedcsmus были проведены в начале 20-го века (Smith, 1914). Ряд исследований жизненного цикла Scenedcsmus был проведен в 60-х годах (Nakamura, 1963). Согласно этим данным жизненный цикл этой водоросли, так же, как и других хлороккоковых, можно представить как чередование светонезависимой и светозависимой фаз. На световой стадии происходит развитие фотосинтетического аппарата и хлоропласта, интенсивное накопление биомассы. На светонезависимой стадии в клетке протекают процессы, не требующие энергии света: репликация ДНК, деление ядра, хлоропласта, самой клетки и образование автоспор. Подобные данные приводят и другие авторы (Trainor et al., 1976).
Детальный анализ клеточного цикла Scenedcsmus qitadricauda был осуществлен в лаборатории Шетлика (Setlic et al., 1972) . Основу цикла составляет последовательность воспроизведения единичного генома. Завершение синтеза ДНК исходного генома дает возможность подготовки и осуществления следующих циклов синтеза ДНК, что приводит к образованию 2-х, 4-х, 8-ми клеточного ценобня, содержащего по одному или два ядра в каждой клетке. Сигналом для начала синтеза ДНК и последующего деления клетки служит увеличение ее объема до некоторой критической (пороговой) величины. Как и для хлореллы, основным экзогенным регулятором клеточного цикла является свет, поскольку достшкение критического объема клетки требует протекания процессов фотосинтеза. Авторы полагают, что контроль клеточных делений осуществляется также с помощью эндогенных регуляторов белковой природы ігуклеиновьгх кислот.
Проблема клеточного деления и формирования ценобиев в роде Scenedesmus рассматривается в монографии Pickett-Heaps (1975). В ней отмечено, что размножение Scenedesmus quadricauda характеризуется некоторыми особенностями в отношении формирования автоспор. Согласно автору, оно осуществляется, как и у множества других хлорококковых водорослей, посредством нескольких циклов деления ядра перед окончательным разделением материнской клетки, в результате которого образуются дочерние клетки, число которых кратно 2", где (п) означает число циклов деления. Клеточное деление задерживается до образования хотя бы 4-х ядер, исключая случаи, когда ценобий является двухклеточным. Вслед за ядерным делением не следует непосредственного формирования автоспор.
В ходе жизненного цикла микро водорослей заметные изменения происходят в работе фотосинтетического аппарата. На первых этапах развития клетки хлорококковых водорослей происходит быстрый рост хлоропласта на фоне очень незначительного увеличения объема клетки (Цоглин, Клячко-Гурвич, 1980). В дальнейшем биомасса клетки и ее фотосинтетическая активности за период стадии активного роста увеличиваются экспоненциально. Особенно важен в жизненном цикле клетки интервал от конца стадии активного роста до начала деления клеток, когда происходит резкое снижение фото синтетической активности (Цоглин, 1973; Чемерис, 1979). Исследование синхронных культур разных видов рода Scenedesmus позволило установить, что
Водоросли, как тест - объект при оценках качества водной среды
Все описанные выше методики оценки состояния популяций микроводорослей были разработаны, в частности, для определения влияния на водоросли различных токсичных веществ. Это связано с тем, что культуры водорослей являются удобным и давно используемым в водной токсикологии тест-объектом (Хоботьев, Капков, 1971). В первую очередь это связано с тем, что они являются важным компонентом в функционировании экосистем водоема, участвуя в процессах самоочищения и производства первичного органического вещества (Вассер и др., 1989). Кроме того, короткий жизненный цикл одноклеточных водорослей позволяет проследить последствия неблагоприятных для популяции воздействий за сравнительно небольшой промежуток времени.
Все тесты, проводимые на культурах водорослей по длительности экспозиции можно подразделить на краткосрочные (острые) — до 96 часов, и хроннчесюїе (продолжительностью более 14 суток). Острые тесты позволяют проследить влияние высокотоксичных веществ в значительных дозах, вызывающих гибель части популяции микроводорослей. Хронические эксперименты проводятся для определения возможных отдаленных последствий неблагоприятного воздействия. Они в свою очередь подразделяются на те, которые охватывают период развития культуры до достижения ею фазы стационарного роста при непроточном культивировании (30-40 суток), и более продолжительные, часто связанные с периодическим пересевом в новую среду (Хоботьев, Капков, 1971),
Токсичные вещества оказывают влияние на самые различные стороны функционирования культур водорослей. Под влиянием токсикантов могут изменяться общая численность клеток в культуре, морфологические характеристики отдельных клеток и их размеры, активность их жизнедеятельности (фотосинтез и размножение).
Влияние токсичных веществ на популяцию микроводорослей, в первую очередь, оценивается по изменению динамики общей численности клеток в культуре по сравнению с контролем, Негативное влияние па культуру может выражаться в снижении общей численности клеток в ходе всего эксперимента, в изменении продолжительности протекания фаз развития, в более низком уровне численности клеток в стационарной фазе.
Снижение общей численности клеток в культуре наблюдается при добавлении самых различных токсичных веществ: нефтепродуктов, тяжелых металлов, пестицидов, ПАВ, различных красителей и др. (Shehata, Bards, 1980; Boyle, 1984; Мур, Рамамурти, 1987; Брагинский, Величко, Щербань, 1987; Багоцкий, Санин, Эйнор,1992; Fragasova, Bumbalova, Havranek, 1999). В некоторых случаях в ответ на воздействие в культуре отмечается альгостатический эффект, когда в течение продолжительного периода времени численность клеток остается относительно постоянной (Шавырина, 1993).
Влияние токсичных веществ на продолжительность протекания фаз в развитии культуры выражается, чаще всего, в удлинении лаг-фазы (Хоботьев, 1975). Это связано с тем, что в период этой фазы происходит адаптация культуры к новым условиям, а неблагоприятные воздействия способны существенно увеличить продолжительность этого процесса.
Учет фазы развития культуры в токсикологических исследованиях важен в связи с тем, что клетки водорослей в разные моменты развития культуры отличаются по своей чувствительности к токсичным веществам. Так по одним данным чувствительность культуры максимальна в фазе экспоненциального роста и минимальна в лаг-фазе и фазе стационарного роста, когда в культуре невысок процент чувствительных делящихся клеток (Рогатых, 1970; Hornung et al, 1980). По другим данным (Аль-Сальман, 1988; Гапочка и др., 1988; Божков, 1997) культуры водорослей, напротив, наиболее чувствительны в фазе стационарного роста, поскольку старые клетки не способны к активному выделению в среду антиоксидаптов и уровень функционирования антиокислительных механизмов в этот момент низок. Кроме того, у клеток в стационарной фазе замедлен процесс выведения токсичных веществ.
Токсичные вещества в больших концентрациях способны заметно повысить процент мертвых клеток, определяемый с помощью люминесцентной микроскопии. Так, например, при добавлении бихромата калия в концентрациях свыше 1 мг/л мертвые клетки к концу эксперимента могут составлять от 40 до 97%, а при добавлении сульфата имазалила от 12 до 97% (Прохоцкая, 2000). Сходным действием обладали и высокие концентрации меди (Лысенко, 1983). Этот показатель отражает накопление мертвых клеток, по не дает ответа на вопрос о том, происходит ли это за счет повышения смертности или за счет замедления процессов их лизиса.
Некоторые токсичные вещества способны оказывать влияние на морфологические характеристики клеток микроводорослей. Так в нормально развивающихся ценобиях S. quadricauda все клетки имеют примерно одинаковые размеры, однако при добавлении комплексных соединения меди возможно появление четырех-клеточных ценобиев водоросли с увеличенными крайними клетками. Повышение концентрации вызывало увеличение и искривление средних клеток в ценобиях, еще большее повышение концентрации приводило к появлению бесформенных колоний (Хоботьев и др., 1975).
При воздействии различных токсикантов также возможен переход ценобиальиых форм водорослей в одноклеточные, что позволяет использовать этот показатель и в токсикологических исследованиях. Например, добавление тяжелых металлов в высоких концентрациях приводит к образованию одноклеточных форм у S. incrassatulus . При высоких концентрациях кадмия до 79% популяции этой водоросли было представлено одноклеточными формами, а при воздействии меди - до 64%. Хром индуцировал появление как одно-, так и двух-клеточиых ценобиев и уменьшение размеров клеток. (Репа-Castro et la, 2004). Сходные результаты были получены при воздействии хрома на S. quadricauda (Прохоцкая, 2000). В отдельных случаях возможен и обратный процесс, когда внешнее воздействие увеличивает количество клеток в ценобиях. Так добавление некоторых веществ из мембранных фильтров способно в течение 2-х дней изменять одноклеточную форму S. obliquus на колониальную (Lurling, 2002). Некоторые вещества, содержащиеся в природных водах, способны влиять па количество восьми-клеточных ценобиев в культуре S. quadricauda (Ботяжо в а, Стогова, 1997).
Некоторые токсичные вещества, такие как шестивалентный хром, способны оказывать влияние на протекание жизненного цикла у хлорококковых
Исследование гетерогенности лабораторной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda по выживаемости и способности клеток к делению
Фракционный состав клеток, отобранных на разных этапах развития макрокультуры, существенно различался (рис. 7). Так в лаг-фазе, когда происходила адаптация к новым условиям роста, основную массу (60-70%) составляли покоящиеся клетки, доля размножающихся была всего 17 %. Доля отмирающих клеток была максимальной в самом начале наблюдения (25%) и уже на 3 - 4-е сутки понижалась до 12,5%. Значительная доля клеток, не приступивших к размножению, послужила причиной низкой удельной рождаемости клеток в микрокультуре (0,10 кл/сут) и, соответственно, низкого удельного прироста численности (0,06 кл/сут) на этом этапе развития культуры (рис. 8).
Уже в самом начале фазы роста (на 7-10 сутки) ситуация начала изменяться. Доля покоящихся клеток снизилась до 40 - 50%, соответственно увеличилась доля размножающихся клеток (37-55%), а доля отмирающих клеток не превышала 8 - 12% (Рис 7). Возрастание доли клеток, способных давать потомство, существенно повлияло на значения удельной рождаемости (до 0,35 кл/сут) (рис.8). Активность размножения была наибольшей на 11 — 14е сутки, но, поскольку общая численность в культуре в этот период была относительно невысокой, заметное увеличение общей численности клеток в макрокультуре произошло только на 17-20е сутки.
Наступление стационарной фазы (25 - 28 сутки) было связано со значительным возрастанием доли покоящихсяхся клеток (до 70%) и снижением доли размножающихся (до 12 - 17%). Удельная рождаемость в микрокультурах упала до 0,12 - 0,13 кл/сут (рис. 8), а удельный прирост уменьшился до 0,07 кл/сут. Стабилизация общей численности клеток в макро культуре произошла за счет увеличения доли покоящихся, а не погибающих клеток. Здесь, также как и в фазе экспоненциального роста, изменения в структуре популяции произошли несколько раньше, чем это сказалось на общей численности клеток в макрокультуре.
Сравнение фракционного состава популяции водоросли в лаг-фазе и фазе стационарного роста показало их высокое сходство. Как в начале, так и в конце развития культуры в ней преобладали покоящиеся клетки при невысокой доле размножающихся.
В целом в микрокультурах, отобранных на разные сроки, удельная рождаемость заметно превышала удельную смертность, достигая максимума на 11 сутки. Удельная смертность клеток, напротив, мало изменялась в ходе роста культуры (0,05-0,07 кл/сут). В результате изменение прироста общей численности клеток происходило главным образом за счет изменения рождаемости. Результативность процессов размножения клеток в культуре может определяться с одной стороны числом клеток, дающих потомство, с другой -числом «дочерних» клеток, даваемых размножающейся клеткой при каждом выбросе автоспор. Изменение среднего значения этого показателя в зависимости от возраста макрокультуры, рассчитываемого как среднее количество клеток, выбрасываемых размножающейся клеткой в микрокультуре, приведено на рис. 9.
Этот показатель мало изменялся в ходе всего опыта (2,3 - 3) и лишь в самом конце резко повысился (до 4). Это свіщетельствует о том, что хотя число размножающихся клеток в стационарной фазе и сократилось, каждая из них могла давать большее число новых клеток.N, - численность клеток, отмерших в культуре за сутки (произведение доли отмерших в микрокультуре за сутки на общее число клеток в макрокультуре),N„OKOB14 - численность клеток, которые в течение суток не погибли, но не дали потомства (произведение доли покоящихся на общее число клеток в макрокультуре).Динамика численности каждой из фракций клеток в макро культуре, рассчитанная для одного из опытов по данным метода микрокультур, приведена на рис.10.
Полученные кривые могут быть описаны, в частности, уравнениями полиномов третьего порядка:
Полученные графики позволили представить общий ход событий в растущей культуре. Прирост культуры происходил за счет относительно небольшой разности между числом размножающихся и отмирающих клеток. Эта разность увеличивалась в первые две недели и оставалась наибольшей в период с 10 по 23 сутки. Начиная с 12-ти суток, существенно возрастала численность покоящихся клеток. Практически весь новый прирост в культуре переходил в покоящееся состояние.
Таким образом, динамика численности клеток в культуре формироваласьза счет относительно небольшой доли клеток, способных к размножению вконкретных условиях культивирования. Факторами, регулирующими
Исследование влияния хлорида меди на выживаемость и размножение Scenedesmus quadricauda
Метод микрокультур был использован для исследования структуры культур при воздействии хлорида меди.
Так как в разные моменты времени фракционный состав культуры различен, то внесение даже одинаковых концентраций токсиканта на разных этапах развития культуры может по- разному сказываться на се дальнейшей судьбе, В связи с этим мы исследовали динамику фракционного состава макрокультур при внесении меди на разных фазах их роста.
Влияние внесения меди на лаг-фазе роста макрокультурыДобавление меди в самом начале эксперимента приводило к значительным изменениям в динамике общей численности клеток в культуре (рис.14).
Особенно сильно это проявлялось при относительно больших концентрациях меди (1,0; ОД; 0,01 мгСи/л), где к концу эксперимента общая численность клеток не превышала 20% от значения в контроле. Столь сильное угнетение культуры токсикантом было связано с тем, что культура в момент добавления меди была представлена, главным образом, молодыми клетками и плотность ее была относительно невысокой (70-120 тыс.кл./мл). В целом, наблюдалась прямая концентрационная зависимость, при которой с увеличением концентрации токсиканта угнетение усиливалось. Доля мертвых клеток по данным люминесцентной микроскопии также увеличивалась с возрастанием концентрации меди (табл. 7).
На рис. 15 представлена динамика изменения фракционного состава макрокультуры при внесении меди на лаг-фазе, полученная методом микрокультур. При относительно небольших концентрациях меди (0,0001 и 0,001 мгСи/л) общая динамика фракций клеток сохранялась такой же, как в контроле. Относительная доля размножающихся клеток увеличивалась вплоть до 15 суток, а затем начинала медленно снижаться за счет перехода клеток в покоящееся состояние, Однако по сравнению с контролем здесь была отмечена более низкая удельная рождаемость клеток. Максимальные значения этого показателя составили 0,17 кл/сут при 0,0001 мгСн/л и 0,11 кл/сут при 0,001 мгСи/л (табл. 8), тогда как в контроле этот показатель достигал 0,36 кл/сут. Смертность клеток при этом была близкой к контролю. При 0,001 мгСи/л доля покоящихся клеток увеличилась до 67 - 83% (рис. 15).
При 0,0001 мгСи/л снижение удельной рождаемости происходило не за счет сокращения доли размножающихся клеток, а за счет небольшого уменьшения количества «дочерних» клеток (среднее значение этого параметра здесь бьшо равно 2,3) (табл. 9). В одном из опытов был отмечен всплеск удельной рождаемости клеток в период фазы роста при 0,0001 мгСи/л, в значительной мере превышающий коїпрольньте значения (до 0,61 кл/сут). Это может свидетельствовать о неоднозначности реакции культуры на низкие концентрации токсиканта, когда в зависимости от условий может отмечаться как гиперстимуляция, так и угнетение процессов размножения. При концентрации 0,001 мг Си/л бьшо отмечено некоторое увеличение этого показателя на экспоненциальной фазе (14-17 сутки). Более высокое количество «дочерних» клеток было зафиксировано при концентрации 1 мг Си/л. Вероятно, это повышение являлось одной из адаптивных реакциях водоросли на относительно высокие концеїгграции токсиканта.
Более высокие концентрации (0,01; 0,1 и 1,0 мгСи/л) вызывали значительное изменение динамики фракционного состава клеток по сравнению с контролем (рис.15). Основной особенностью эффекта этих концентраций были более высокие значения смертности в лаг-фазе сразу после внесения меди (0,14 кл/сут при 0,01 и 0,1 мгСи/л, 0,19кл/сут при 1,0 мгСи/л). В контроле в этот момент удельная смертность составляла 0,11 кл/сут, В дальнейшем, по мере адаптации культуры к новым условиям, смертность клеток снижалась до уровня близкого к контролю. При концентрациях 0,01 и 1,0 мгСи/л удельная рождаемость клеток, как и в контроле, была заметно выше в фазе экспоненциального роста на 14-17 сутки (до 0,14 кл/сут), превышая значения этого показателя при концентрации 0,001 мгСи/л.
При концентрации 0,1 мгСи/л удельная рождаемость в микрокультурах в ходе всего опыта оставалась на уровне 0,06 кл/сут. Доля покоящихся клеток при действии средних и больших концентраций меди, также как и в контроле, увеличивалась к стационарной фазе, однако, если при 0,1 мгСи/л этот показатель был в целом близок к контрольным значениям, то при 0,01 он был ниже, а при 1,0 мгСи/л в конце эксперимента даже несколько превышал значения в контроле.
Для описания динамики фракционного состава макрокультур при добавлении токсиканта был использованы расчеты, аналогичные примененным в контроле. Полученные в результате графики представлены на рис. 16, а уравнения их описывающие - в табл. 10.
Рост культуры в присутствии меди, также как в контроле, происходил за счет накопления покоящихся клеток, не участвующих в процессах размножения. При концентрации меди 0,0001 мгСи/л численность отмирающих и размножающихся клеток была примерно в 2 раза выше, чем в остальных опытах и достигала контрольных значений. В целом процессы, идущие при этой концентрации, были близки тем, что наблюдались в контроле. С увеличением концентрации токсиканта возрастание количества покоящихся клеток замедлялось. Если в контроле и при 0,0001 мгСи/л нарастание их числа происходило до конца эксперимента, то начиная с концентрации 0,001 мгСц/л, количество таких клеток достигало стационарного уровня на 15 сутки. При концентрациях 0,01; 0,1 и 1,0 мгСи/л количество покоящихся клеток даже несколько снижалась к концу эксперимента. Начиная с концентрации 0,001 мгСи/л, медь угнетала размножение клеток. При всех концентрациях, кроме 0,0001 мгСи/л, численность размножающихся клеток увеличивалась вплоть до 15 суток, а затем следовало снижение этого показателя.
