Введение к работе
Актуальность проблемы
Знание структуры вирусов и особенностей их формирования необходимо для разработки новых эффективных подходов в борьбе с вирусными инфекциями. Вирусы также являются удобной экспериментальной модельной системой для изучения механизмов ассоциации белковых субъединиц, которая может помочь в понимании процессов формирования сложных биологических структур клетки, таких как ядерные поры, центриоли, жгутики, компоненты мышечных филаментов и др
Бактериофаг Т4, инфицирующий Escherichia col:, является одним из основных модельных объектов молекулярной и структурной биологии [7] Частица фага Т4 (Рис I) состоит из двух основных частей — капсида ("головки"), содержащего геномную ДНК размером около 172 тысяч пар оснований, и "хвоста", который присоединен к капсиду через специальный портал на одной из вершин с симметрией 5-го порядка. Капсид является икосаэдром, удлинённым вдоль оси 5 порядка [5], имеет размеры 860 А в поперечнике и 1200 А длиной, и построен из 930 копий белка продукта гена (пг) 23, 55 копий пг24, 155 копий белка hoc ("highly antigenic outer capsid protein") и 810 копий белка soc ("small outer capsid protein") Портал содержит 12 копий белка пг20 Сократимый хвост состоит из трех частей "шейки", хвостового стержня, на котором собран сократимый хвостовой чехол, и базальной пластинки К шейке, построенной из гексамеров пг15, пг13 и/или пг14, присоединены "воротничок" и "бакенбарды", состоящие из тримеров белка фибритина (nrwac), воротничок, возможно, содержит также один из белков пг13 или пг14 Основную часть хвоста занимает сократимый хвостовой чехол и расположенный внутри него хвостовой стержень Чехол построен из 138 копий пг18, стержень состоит из пг!9, которого, видимо, 138 копий Завершает хвост базальная пластинка — многокомпо-
Heati
rife ^4^ Baseplate
Рис. 1: Бактериофаг Т4 .
а) криоэлектронная микрофотография; б) схематическая модель Рисунок взят из [19].
р„С 1-\Ч"ОК\ЛЫ1АЯ >.07Е\А < і1т\ орг /
:-ч4пкт!
нентная молекулярная структура диаметром около 520 А и высотой в 270 А, состоящая из 16 различных белков, почти каждый из которых является олигомером. В состав базальной пластинки входятпг5, пгб, пг7, пг8, пг9, nrlO, nrl 1, пг12, пг25, пг26, пг27, пг28, пг29, пг48, пг53, и пг54. К базальной пластинке присоединены длинные фибриллы, построенные из пг34, пг35, пгЗб и пг37. Таким образом, в сборке частицы фага участвуют более тридцати различных белков, и это не не считая белков, связанных с ДНК внутри капсида, вспомогательных скаффолд-белков и белков-шаперонов.
С помощью электронной микроскопии с применением негативного контрастирования ранее удалось представить общее строение вируса. Хвостовой чехол бактериофага Т4 в растянутом (нативном) состоянии явился первой биологической структурой, для которой была проведена трёхмерная реконструкция [20]. Также была выполнена трёхмерная реконструкция сокращённого [1] хвоста и предложена двумерная модель базальной пластинки [4]. Разрешение этих моделей было довольно низким, около 40 А. Получить с высоким разрешением пространственную реконструкцию вирусной частицы целиком удавалось, в основном, лишь для сравнительно простых в устройстве икосаэдрических вирусов, поскольку отсутствовали необходимые вычислительные мощности и не были до конца разработаны методы реконструкции. В настоящее время, с совершенствованием методов электронной криомикроскопии и развитием компьютерных технологий, цель реконструировать частицу бактериофага Т4 с околоатомным разрешением представляется осуществимой.
Цель работы
Пространственная реконструкция такого сложного и большого вируса, каким является бактериофаг Т4 (размеры вируса примерно 2500 х 1000 х 1000 А, молекулярная масса частицы около 300 МДа) требует особого подхода, поскольку даже при использовании современной вычислительной техники необходимый объём данных и вычислений выходит за рамки осуществимого с помощью стандартных методов и программ. Поэтому, в данной работе были поставлены следующие задачи:
Разработать компьютерную программу для пространственной реконструкции больших объектов с различной симметрией по изображениям электронной криомикроскопии;
Провести пространственную реконструкцию комплекса базальной пластинки и хвостового стержня бактериофага Т4 (масса комплекса 8,8 МДа) и определить расположение и взаимодействие в нём белковых субъединиц, атомная структура которых ранее определена в нашей лаборатории: пг5, пг9, nrl 1, пг12 (фрагмент), пг27, атак же определить вероятную форму и расположение остальных белковых составляющих базальной пластинки;
На основании полученных результатов предложить механизм действия аппарата инфицирования бактериофага Т4, включающего хвостовой чехол и базалъную пластинку.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, четырёх глав, выводов, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 105 страниц, включая 27 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы содержит ПО наименований.
Научная новизна и практическая значимость
Впервые получена детальная пространственная картина важного функционального компонента сложного вируса — базальной пластинки бактериофага Т4, и предложено механистическое объяснение процесса заражения вирусом хозяйской клетки. Разработана компьютерная программа для получения реконструкций асимметричных, или имеющих низкую степень симметрии объектов, что позволит в будущем получить модели строения других вирусов и надмолекулярных биологических структур, представляющих научный и практический интерес. Полученные результаты и сведения структурного характера можно использовать, например, при конструировании молекулярных механизмов в нанотехнологии.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на Гордоновской конференции по дифракционным методам в биологии в США (Diffraction Methods in Molecular Biology Gordon Conference; Proctor Academy, Andovcr, New Hampshire, USA, 1998); на конференциях Медицинского института Говарда Хыоза в 2000, 2001, 2002 и 2004 гг (Howard Hughes Medial Institute Meeting of International Research Scholars, USA, 2000; Canada, 2001; Australia, 2002; Estonia, 2004); на конференции по сборке вирусов (XVIII Biennial Conference on Phage/Virus Assembly, USA, 2003).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 6 статей и 6 тезисов докладов.
Депонированные структурные данные
Депонированы в банк данных белковых структур PDB следующие структуры: пг5/пг27 - коды 1К28, 1PDJ, 1PDL; пг8 - коды 1N7Z, 1N80, 1N8B, 1PDM; пт9 - коды 1QEX, 1S2E, 1PDP; пгП - коды 1ЕГ6, IPDF; ПГІ2 - код 1PDI;
Реконструкция комплекса базальной пластинки и хвостового стержня депонирована в банк электронномикроскопических реконструкций (EMDB), код 1048.
