Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературных данных 8
1.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной 8
эктодермы.
111. Дифференцировка нервной пластинки. 10
1.1.2. Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы . 11
1.1.3 Дифференцировка области нервного гребня. 14
1.2. Гомеодоменный транскрипционный фактор Anf - регулятор 16
раннего развития переднего мозга позвоночных
1.3 Генетические мишени гомеодоменного транскрипционного 18
фактора Xanfl.
1.4 ГТФ-связывающие белки 19
1.5 Суперсемейство малых ГТФаз 20
1.5.1 Основные характеристики и свойства малых ГТФаз. 23
1.5 Л. 1 Цикл активации/инактивации малых ГТФаз 24
1.5.1.2 Строение и функция каталитического G-домена 25
1.5.1.2.1 Связывание ГТФ 26
1.5.1.2.2 Гидролиз ГТФ и вспомогательные GAP белки 27
1.5.1.3 Внутриклеточная локализация малых ГТФаз 28
1.5.2 Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе . 31
1.5.2.1 Ras семейство малых ГТФаз 31
1.5.2.2 Rho семейство малых ГТФаз 3 5
1.5.2.3 Rab семейство малых ГТФаз 39
1.5.2.4 Arf7 Sari семейство малых ГТФаз 40
1.5.2.5 Ran семейство малых ГТФаз 42
1.5.2.6 RGK семейство малых ГТФаз. 43
1.5.2.7 RJL семейство малых ГТФаз. 44
1.5.2.8 Gie семейство малых ГТФаз. 45
1.6 Заключение 46
2. Результаты и их обсуждение 47
2.1 Выяснение систематического положения новой малой ГТФазы 47 Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз
2.1.1. Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей .
2.L2. Филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз с 51
новыми белками Ras-dva
2.1.3. Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных 52
последовательностей G-домена белков Ras-dva и других малых
ГТФаз. 2.2. Изучение функциональной роли малой ГТФазы Ras-dva в 54 процессах раннего эмбрионального развития на модели зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.
2.2.1. Изучение внутриклеточной локализации белка Ras-dva. 54
2.2.2. Динамика экспрессии гена Ras-dva в эмбриогенезе 59
шпорцевой лягушки.
2.2.3. Регуляция начальных этапов экспрессии гена Ras-dva. 63
2.2.4. Морфологические аномалии развития, возникающие при нарушении функционирования гена Ras-dva на ранних этапах развития, и подтверждение их специфичности.
2.2.5. Влияние ингибирования работы гена или белка Ras-dva на экспрессию специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей шпорцевой лягушки.
2.2.6. Поиск специфического сигнального каскада, в котором 80
может принимать участие малая ГТФаза Ras-dva на ранних этапах развития зародышей шпорцевой лягушки.
3. Выводы 34
4. Материалы и методы 85
4.1. Материалы. 85
4.1.1. Реактивы. 85
4.1.2. Ферменты 86
4.1.3. Лабораторное оборудование. 86
4.1.4. Лабораторные животные. 86
4.1.5. Буферы и растворы. 87
4.1.6. Миробиологические среды. 88
4.1.7. Предоставленные плазмидные конструкции. 88
4.1.8. Предоставленные dig-зонды. 89
4.2. Методы исследования. 89
4.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР).
4.2.2. Изготовление ДНК конструкций. 89
4.2.2.1. Клонирование гена шпорцевой лягушки FgfSa. 89
4.2.2.2. ПЦР-мутагенез. Создание генов, кодирующих мутантные варианты белков Ras-dva и K-Ras.
4.2.3. Транскрипция in vitro. 92
4.2.4. Получение зародышей шпорцевой лягушки. Микроинъекции.
4.2.5. Блокирование эндогенной мРНК Ras-dva при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых морфолино олигонуклеотидов или олигонуклеотидов на основе гидроксипролина.
4.2.5.1. Морфолино олигонуклеотиды. 93
4.2.5.2 Аналоги пептид-нуклеиновых кислот (PNA): отрицательно заряженные PNA-подобные ДНК миметики.
4.2.6. Фиксация зародышей шпорцевой лягушки. 95
4.2.7. Гибридизация In situ 96
4.2.8. Синтез dig-меченой анти-смысловой РНК для приготовления гибридизационой пробы.
4.2.9. Парафиновые срезы фиксированных препаратов. 99
4.2.10 Экстракция тотальной РНК из эксплантатов анимальной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки. Обратная
транскрипция и полимерразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).
4.2.11. Трансфекция клеток линии мышиных фибробластов NIH-3T3 105
Благодарности. 107
Список сокращений. 108
Список литературы. 109
- Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы
- Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе
- Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей
- Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР).
Введение к работе
Изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме, в процессе онтогенеза является одной из фундаментальных проблем биологии. Важной задачей молекулярной биологии развития является поиск и исследование молекулярно-генетических механизмов и сигнальных каскадов, необходимых для нормального развития и регионализации головного отдела зародышей позвоночных животных. Особый интерес в этой области представляют исследования механизмов развития; головного мозга,-в частности, его переднего отдела, отвечающего за высшие формы нервной деятельности.
Известно, что важную роль в регионализации и клеточной дифференцировке в ходе развития головного мозга, играют гомеодоменные транскрипционные факторы и их геномные мишени [Ermakova et al., 1999; Boyl et al., 2001; Kiecker and Lumsden, 2005]. Так, одним из ключевых звеньев молекулярных механизмов, обеспечивающих развитие переднего мозга, у позвоночных является-гомеодоменный белок Anf. Ген Anf специфически экспрессируется* на ранних, стадиях развития зародышей позвоночных в зачатке переднего мозга; из которого в ходе развития формируются большие полушария мозга (т.н. конечный;; мозг); а^ также промежуточный отдел головного мозга, включая глаза; [Zaraisky,1992; Kazanskaya et. al., 1997]. В результате поиска геномных мишеней;Anfrtas модели : эмбрионов Xenopus laevis был идентифицирован ген, кодирующий ранее неизвестную Ras-подобную малую ГТФазу. Было установлено,, что в раннем эмбриогенезе найденный ген экспрессируется вдоль границы, отделяющей-зачаток; переднего мозга, расположенный! в передней части спинной стороны* зародыша, от брюшной его части [Novoselov et al., 2003]. На основании подобной;/пограничной, локализации экспрессии данного гена, а также принадлежности, кодируемой им малой ГТФазы к суперсемейству Ras ГТФаз,. он получил название - Ras-dva (последнее сокращенно - dorsal-ventral-anterior: спина-брюхо-перед).
Малые ГТФазы представляют собой суперсемейство регуляторных ГТФ-гидролаз, в котором выделяют 8 семейств: Ras, Rab, RJL, Ran, RGK, Rho/Rac/Cdc42, Arf/Sar и Gie. Белки этих семейств принимают участие в таких разнородных клеточных процессах, как трансдукция сигналов; и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация
микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), везикулярный (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматический транспорт (Ran) [Hall, 2000; Finlin et al., 2000; Takai et al, 2001; Nepomuceno-Silva et al, 2004; Okai et al, 2004].
Учитывая специфичную экспрессию Ras-dva вдоль границы зачатка переднего мозга, логично предположить, что малая ГТФаза Ras-dva может играть важную роль в сигнальных механизмах, регулирующих развитие мозга и прилежащих головных структур. В связи с этим, поиск гомологов Ras-dva и дальнейшее изучение их биологических функций представляется перспективным подходом для понимания механизмов раннего эмбрионального развития переднего мозга.
Кроме того, сравнительно низкая степень гомологии Ras-dva с представителями восьми других известных семейств малых ГТФаз делает изучение ГТФазы Ras-dva и ее гомологов важным как с классификационно-структурной точки зрения, так и с точки зрения выявления возможных новых типов внутриклеточных сигнальных каскадов
Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы
У зародыша шпорцевой лягушки из прилегающей к нервной пластинке зоны головной эктодермы развиваются плакоды, присоска и область «первичного» ротового отверстия.
Эктодермальные плакоды представляют собой парные локальные утолщения столбчатого эпителия, располагающиеся на границе нервной пластинки/нервного гребня и покровной эктодермы (презумптивного эпидермиса). Плакоды являются временными эмбриональными образованиями, из которых впоследствии формируются парные органы чувств и другие структуры. До недавнего времени плакодам уделялось сравнительно мало внимания, в связи с интенсивным изучением развития нервной пластинки, (презумптивной ЦНС). Однако появление стадиоспецифичных маркеров для разных плакод пробудило интерес исследователей к процессам детерминации и развития эктодермальных плакод.
Среди плакод выделяют чувствительные (хрусталиковая, слуховая, обонятельная, а также плакода боковой линии) и нейрогенные (гипофизарная; trigeminal, эпибранхиальная), которые формируют чувствительные нейроны черепных сенсорных ганглиев [Brugmann, Moody, 2005]. Хрусталиковая плакода формирует хрусталик при вторичной индукции эпителия плакоды глазным выростом среднего мозга [Zygar et ah, 1996]. Слуховая.плакода"дает начало всему внутреннему " уху, включая все поддерживающие (структурные) клетки; биоминерализованные отолиты и механосенсорные реснитчатые клетки, которые, собственно, и преобразуют колебания в аудиоинформацию. Обонятельная»плакода образует обонятельные нейроны и поддерживающие клетки обонятельного эпителия; а также глиальные клетки и нейроны, выделяющие гормон секреции гонадотропина (гонадотропин-релизинг гормон). Интересно, что это единственная железа, клетки которой могут дифференецироваться в глиальные клетки. Эти клетки мигрируют в мозг вдоль обонятельного и вомероназального нервов, обволакивая их. Предшественниками всех остальных периферических глиальных клеток являются клетки нервного гребня. Нейроны, секретирующие гонадотропин-релизинг гормон, мигрируют в конечный и промежуточный отделы» мозга вдоль терминального и вомероназального нервов, где и формируют систему, которая является главным регулятором высвобождения гонадотропина клетками аденогипофиза, а, соответственно, и процессов репродукции практически у всех позвоночных животных. Аденогипофиз формируется из гипофизарной плакоды, которая у шпорцевой лягушки (как и у всех анамниот) на стадии нервной пластинки занимает небольшую область клеток в самой передней части нервного валика на границе нервной пластинки и прилегающей эктодермы. В ходе развития (на ст.24-40) эта группа клеток инвагинирует и двигается между глоткой и дном головного мозга, достигнув infimdibulum, сливается с ним и образует функциональный аденогипофиз. Что касается сигнальных механизмов, регулирующих процесс спецификации гипофиза, то известно, что сигнал от Sonic Hedgehog из соседствующей нервной ткани необходим для индукции аденогипофиза. В ходе инвагинации окружающие ткани среднего отдела мозга, головной мезодермы и переднего конца нотохорда играют важную роль в позиционировании зачатка аденогипофиза. В частности сигналы от Fgf, Wnt и ВМР4 необходимы в этих процессах [Dickinson, Sive, 2007].
У шпорцевой лягушки X. laevis перечисленные плакоды формируются» из утолщенного внутреннего слоя эпителия, но кроме этого, есть ещё производные утолщенного внешнего слоя - присоска и железа вылупления, которые в основном нужны на эмбриональных стадиях развития. В индукции и позиционировании присоски важную роль играют сигналы BMP, исходящие из вентролатеральной эктодермы, а также транскрипционный фактор otx2, экспрессирующийсяг в антериорно-дорзальной эктодерме [Gammill, Sive, 2000].
В результате изучения процессов развития описанных структур на молекулярном уровне была получена информация о генах, специфично экспрессирующихся в этих зонах (т.н. маркерные гены). На данный-, момент известны следующие маркеры плакодной зоны на ранних стадиях развития-позвоночных животных. У зародышей шпорцевой лягушки генетическими-маркерами пан-плакодной области являются гены Sixl, Six4 и Eyal [Brugmannef al., 2004; Ahrens, Schlosser, 2005]. На эмбрионах мыши показано, что ген транскрипционного фактора BF-1 экспрессируется в покровной, головной эктодерме начиная со стадии 6-ти сомитов, в дальнейшем развитии его транскрипты обнаруживаются во всех плакодах и их клетках-потомках [Hatini et al., 1999]. мРНК гомеобоксного гена Otx-2 является маркером области презумптивной присоски, наряду с передним- и средним отделами мозга. Кроме того, Otx2 и транскрипционные факторы Рах-6, Sox2 и Sox3 экспрессируются в обонятельной и хрусталиковой плакодах и играют важную роль в формировании их производных. мРНК гомеобоксного гена Dlx5, наряду с Рах-6, является маркером обонятельной плакоды [Franco et al., 2001]. Маркерами присоски и/или железы вылупления являются гены Xcg, Xagl, Xag2 и Xagr2, кодирующие секреторные белки [Gammill and Sive., 1997; Wardle et al., 2002; Novoselov et al, 2003]. Маркерами ранних стадий развития слуховой плакоды служат Sox2, Sox3 , Рах8 и ТЪх2 транскрипционные факторы [Baker and Bronner-Fraser, 2001]. Гены семейства транскрипционных факторов Pitx экспрессируются в зародышах шпорцевой лягушки со стадии поздней гаструлы (ст. 12) в зачатках присоски (cement gland), ротового отверстия (primary mouth primordia) и гипофизарной плакоды (anterior pituitary) [Schweickert et al., 2001].
Исследование механизмов функционирования этих маркерных генов в процессах формирования и дифференцировки производных пан-плакодной области эктодермы является одним из перспективных подходов к пониманию сигнальных систем, задействованных в регуляции раннего развития эктодермы эмбрионов. Так, при исследовании сигнальных путей, способных индуцировать экспрессию гена Sixl в области пан-плакодной эктодермы, было выявлено, что наряду с ингибированием BMP сигналов необходим индукционный сигнал FGF8a [Ahrens, Schlosser, 2005]. Однако путь передачи этого сигнала пока не исследован и является задачей будущих экспериментов.
Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе
Ras белки участвуют в транедукции сигналов, регулирущих клеточную дифференцировку, пролиферацию и апоптоз. В частности, Ras белки необходимы, для передачи сигналов от рецепторных тирозинкиназ и вторичных мессенджеров Са и диацилглицерина (ДАТ).
Наиболее изучен путь транедукции сигнала от факторов роста в ядро клетки посредством соответствующих рецепторных тирозинкиназ и других белков. Этот процесс включает в себя несколько стадий: 1) связывание некоторых факторов роста (EGF (эпителиальный, фактор роста), PDGF (тромбоцитарный фактор роста), FGF (фактор роста фибробластов)) с рецепторной тирозин-киназой и ее активация; 2) аутофосфорилирование рецептора по остаткам тирозина; 3) взаимодействие с адапторным GRB2 белком (growth factor receptor-bound protein2), содержащим SH2 домен, узнающий фосфотирозин; 4) рекрутирование из цитоплазмы GEP белков (Sosl, Sos25 RasGRFl, RasGRF2, RasGRP), способных активировать Ras белки (Рис.7). В результате формируется комплекс рецептор-адаптор-GEP; 5) Белок GEP стимулирует ГДФ/ГТФ обмен белка Ras-ГДФ, находящегося на внутренней стороне плазматической мембраны. 6) После того, как Ras белок перешел в активную ГТФ-связанную форму, он может взаимодействовать с внутриклеточными эффекторами. 7) Прекращение активации внутриклеточных эффекторов происходит в результате взаимодействия комплекса Ras-GTP с GAP белками, например, pl20GAP и neurofibrominm [Hall, 2000].
При передаче сигнала от факторов роста основной функцией связанного с ГТФ Ras белка является активация MAP киназного каскада, который приводит к экспрессии генов, необходимых для деления/дифференцировки клетки. Главным эффектором Ras белков для выполнения этой функции служат Raf белки. Активный Ras белок связывается непосредственно с Raf Ser/Thr-киназой, первой-киназой МАР-киназного каскада (МАРККК, митоген активируемая киназа киназы киназы), которая связана с 14-3-3 белком, стабилизирующим каталитически, активную форму Raf киназы и способствущим ее заякориванию на плазматической мембране [Macaluso et al., 2002]. Raf киназа фосфорилирует МЕК (МАРКК), которая в свою очередь активирует ERK (МАРК) киназу. Последняя транспортируется в ядро, где фосфорилирует и активирует различные транскрипционные факторы, которые влияют на экспрессию определенных генов (c-fos, циклина D1 и др.), продукты которых вовлечены в систему контроля клеточной пролиферации и/или дифференцировки. Причем, эффект зависит от типа фактора роста. Так в PC 12 клетках EGF (Epidermal Growth F actor) индуцировал пролиферацию, a NGF (Neurite Growth Factor) - дифференцировку. В обоих случаях трансдукция сигнала проходила через Ras-опосредованный ERK MAP киназный каскад.
Помимо Raf киназ к эффекторам Ras белков относятся фосфатидилинозитол -3-киназа, RalGEFs и RalGDS (Guanine nucleotide Dissociation S timulator) и белок RTN1 (Ras Interaction/interference) (Рис.7).
В некоторых клетках в определенных условиях Ras может индуцировать апоптоз через тот же путь трансдукции сигнала. Мутации гена ras могут привести к неконтролируемому делению клеток и, в последствии, к раку, поэтому эти гены, являются протоонкогенами. В частности, было показано, что к запуску процесса опухолеобразования приводили мутации, делающие Ras белок постоянно активным для Raf, RalGEF и PI-3K эффекторов;
Взаимодействие Ras-ГТФ белка с каталитической субъединицей рМО фосфатидилинозитол-3-киназы приводит к запуску анти-апоптозного пути через-активацию РКВ/АКТ- белка, который инактивирует проапоптозный фактор BAD [Kauffmann-Zeh et al., 1997].
Ras-GTP так же способна стимулировтаь RalGEFs и RalGDS которые индуцируют нуклеотидный обмен в Ral белках. Ral белки относятся к Ras-подобным белкам и имеют наибольшую гомологию с Ras семейством- малых ГТФаз. Активный Ral-GTP белок связывается с RalBP, который является GAP для Cdc42, а следовательно, нейтрализует один из путей- негативной регуляции-активности Cdc42. Соответственно, Ral белки - посредники взаимодействия между Ras и Rho ГТФазами. Помимо этого, у Ral белков N-конец белка, несет фосфолипазную активность. Доминантно негативный вариант Ral белка ингибировал Src- и Ras-индуцированную фосфолипазную активность.
Ещё одним эффектором белка Ras-GTP является белок RIN1, который связывается с Ras-ГТФ и стимулирует нуклеотидный обмен Rab5 белка.
Сигнальные каскады, связанные с функционированием Ras белков, имеют важное значение для правильного протекания различных процессов в эмбриональном развитии. Огромную роль в эмбриогенезе играют сигнальные каскады при индукционных процессах, а также при дифференцировке клеток. Так, например, сигнал FGF (Fibroblast Growth Factor) индуцирует дифференцировку мезодермы в процессе гаструляции зародышей позвоночных, без которой невозможна нейральная индукция. Оказалось, что именно Ras белки играют, ключевую роль в трансдукции сигнала FGF [Whitman, Melton, 1992]. Tsai с соавторами выявили участие малой ГТФазы Rapl из семейства Ras, в передаче сигнала от Wnt по неканоническому пути (b-catenin независимому), необходимому в процессе гаструляции позвоночных. В ходе сигнального каскада происходит ингибирование Rap-специфичного белка GAP (SIPA1L1), вследствие чего уровень активированных малых ГТФаз Rapl увеличивается. Параллельно происходит активация Rho и Rac малых ГТФаз (см. п. 1.5.2.2) этим же Wnt сигналом, но посредством белков Dsh (Dishevelled) и Daaml. В итоге, действие активированных малых ГТФаз Rapl, Rho и Rac приводит к цитоскелетным перестройкам и модуляции клеточной адгезии, необходимым в процессе передвижения клеток при гаструляции [Tsai et al, 2007].
Кроме того, активация внутриклеточного каскада, происходящая при помощи белка Ras, необходима для правильной передне-задней разметки клеточных дифференцировок в нервной пластинке. Так, в модельной системе эксплантатов индуцированной эмбриональной эктодермы, обработанных bFGF, наблюдалось развитие как головных, так и туловищных нейральных структур. При этом в той же системе, но без обработки bFGF, - дифференцировались только головные структуры [Lamb et al., 1995]. В последствии было обнаружено, что для трансдукции сигнала от bFGF, приводящего к индукции туловищных нейральных структур, важен именно Ras белок и активируемый им МАРкиназный-каскад. Доминантно негативный белок RasS17N блокировал нейральную индукцию bFGF молекулами, т.е. bFGF был не способен индуцировать экспрессию ни hoxB9 -маркера спинного мозга, ни еп2- маркера среднего и заднего отделов мозга.
Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей
У тримерных ГТФаз остаток аргинина из этого switchl региона участвует в катализе реакции гидролиза ГТФ; в то время как вспомогательный белок RGS -regulator of G-protein signaling (аналог GAP) участвует только в поддержании правильной пространственной структуры белка, т.е. в стабилизации каталитических петель, в процессе его «самоинактивации». У малых же ГТФаз обе эти функции выполняет специальный белок-помощник, GAP, который привносит в составе т.н. «аргининового пальца» положительно заряженные а.о. для катализа реакции гидролиза ГТФ и одновременно поддерживает определенную структуру малой ГТФазы.
Еще одной особенностью каталитического домена ГТФаз Ras-dva является то, что у них в консенсусной последовательности G3 вместо сильно консервативного а.о. Gin, который как известно очень важен при гидролизе ГТФ, находится Ser.
Обнаруженные особенности аминокислотных последовательностей switchl и switch2 участков4 малых ГТФаз Ras-dva свидетельствуют о возможном специфическом для этих белков механизме гидролиза ГТФ, сходном с таковым у тримерных ГТФаз . В дальнейшем, было бы интересно проверить данное предположение экспериментально.
Наличие особенностей в первичной последовательности функциональных участков каталитического G-домена Ras-dva ГТФаз, наряду с данными по общейі гомологии их аминокислотных последовательностей, служат ещё одним подтверждением того, что белки Ras-dva формируют отдельную новую группу малых ГТФаз со специфической функцией. Изучению функциональной роли малых ГТФаз Ras-dva посвящен следующий раздел настоящей диссертационной работы.
Известно, что важную роль в определении функций малых ГТФаз разных семейств играет их внутриклеточная локализация. Так Ran белки, регулирующие ядерно-цитоплазматичкий транспорт, локализованы в цитоплазме или в ядре, причем их перенос проходит через ядерный поровый комплекс и зависит от связывания ГТФ. Arf и Rab малые ГТФазы, ассоциированные с мембранами ЭПР, АГ, везикул и эндосом, регулируют везикулярный транспорт в клетке. Ras белки, располагающиеся на внутренней поверхности плазматической мембраны, участвуют в передаче сигнала от клеточных рецепторов на МАР-киназный каскад [Takai et я/.,2001; Pechlivanis and Kuhlmann, 2006]. В связи с этим, изучение внутриклеточной локализации малой ГТФазы нового семейства Ras-dva представляет интерес как с точки зрения общей характеристики белков этого семейства, так и с точки зрения выяснения возможной фукциональной нагрузки малой ГТФазы Ras-dva в клетке.
Внутриклеточная локализация, как правило, детерминируется специфическими сигнальными мотивами в первичной последовательности этих белков. При анализе аминокислотных последовательностей малых ГТФаз Ras-dva нами был выявлен характерный сайт пренилирования на С-конце: СХАХ, где С-а.о. Cys, -SH группа которого подвергается пренилированию фарнезил- или геранил-гераниол-трансферазами, А - алифатический а.о., а X - любой ato. (Рис.9 выделен желтым, п.2.1.1). Из литературных данных известно, что такой сайт пренилирования отвечает за прикрепление к мембранам некоторых малых ГТФаз семейств Ras и Rho. У малой ГТФазы Ras-dva шпорцевой лягушки сайт пренилирования имеет следующую последовательность: - CTLS. Результаты многих работ, посвященных специфичности пренилтрансфераз показывают, что если последний а.о. в сайте Ser/Met/Ala/Gln/Cys - то этот сайт пренилирования является мишенью для фарнезилтрансферазы [Moores et al., 1991].
Кроме того, мы обнаружили, что белок Ras-dva имеет небольшой С-концевой полиосновный участок, состоящий из 2 а.о. Lys и 6 а.о. Arg. Похожий полиосновной участок также присутствует у некоторых связанных с мембранами малых ГТФаз семейств Ras и Rho. Сравнение С-концевых последовательностей малых ГТфаз Ras, Rho и Ras-dva семейств показало, что структура С-концевого участка малой ГТФазы Ras-dva наиболее сходна с таковой белка KiRas4B (он же KARas2B, сплайс-вариант белка Ki-Ras не содержащий экзона 4а, [Butz et al., 2004]) (Табл.5). Известно, что белок KiRas4B локализован в основном на плазматической мембране (ПМ), а также на мембранах аппарата Гольджи (АГ). Полученная в результате анализа первичной последовательности информация и её сравнение с литературными данными говорят в пользу нашего предположения о мембранной локализации белка Ras-dva.
Для экспериментальной проверки этого предположения мы сравнили внутриклеточное распределение белка Ras-dva шпорцевой лягушки и малой1 ГТФазы KiRas4B (в качестве положительного контроля примембранной локализации). Для визуализации этих белков мы использовали генетические конструкции, кодирующие белки Ras-dva и KiRas4B, меченные флуоресцентным белком EGFP по N-концам. Для создания этих конструкций гены Ras-dva и KiRas4B клонировали в вектор pEGFP-Cl (Clontech). Полученные конструкции (pEGFP-Ras-dva и pEGFP-KiRas4B) инъецировали в эмбрионы X laevis на стадиях 4-8 бластомеров и через 1-2 дня инкубации анализировали паттерн флуоресценции EGFP в поверхностных клетках.
В результате было установлено, что малая ГТФаза Ras-dva локализуется на ПМ и в области ядра (Рис.11,Б), а белок KiRas4B находится в основном на ПМ и АГ (Рис.11,А). Для более подробного анализа локализации малой ГТФазы Ras-dva в клетке была проведена трансфекция клеток линии NIH-3T3 конструкцией pEGFP-Ras-dva. С помощью конфокального микроскопа мы обнаружили, что гибридный) белок EGFP-Ras-dva был локализован на ПМ и в околоядерной области, вероятно, на мембранах ЭПР. Кроме того, флуоресцентный сигнал наблюдался в виде отдельных кластеров в цитоплазме (вероятно, АГ и везикулы). При этом сигнал отсутствовал в клеточном ядре (Рис.11,В)-
Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР).
В работе использовали следующие реактивы: этанол, изопропанол, бутанол, ксилол, хлороформ (Химмед), фенол, глицерин (Juro, Швейцария), ампициллин, NaCl (USB, США), КС1 (Helicon, Россия), MgCl2 (USB, США), MgS04 (Helicon, Россия), CaC12 (Fluka, Швейцария), NaOOCCH3 (Sigma, США), NaOH (Германия), Na2HP04x2H20 (Ferak Berlin, Германия), NaH2P04x2H20 (Ferak Berlin,- Германия), L-цистеин гидрохлорид (США), триэтаноламин хлорид (Aldrich, Германия), Tris Base (Helicon, Россия), EGTA (USB, США), EDTA (USB; США), MOPS (Juro, Швейцария), HEPES (Juro, Швейцария), CHAPS, цитрат натрия (MERCK, Германия), малеиновая кислота (MERCK, Германия); фиколл. (Amersham Pharmacia, Швеция), параформальдегид (Sigma, США), формамид (BRL, США), поливинилпиролидон (PVP) (Sigma, США), парапласт (Monoject scientific Inc., Ирландия), канадский бальзам (Michrome, Англия), Tween 20 (Sigma, США), хориогонический гонадотропин (Sigma; США), препарат TorulaRNA (Sigma, США), бычий сывороточный альбумин (BSA) (Sigma, США), фетальная телячья сыворотка (РАА Laboratories), трансфекционный реагент FuGENE 6 (Roche, Германия) агароза (USB, США), бромфеноловый синий, бромистый этидий (Plusone), FLD (Fluorescein lysinated dextran) (Molecular probes, США), маркер длины ДНК ЮООн.п. (Fermentas), морфолино олигонуклеотиды (Vector Labs, США), смесь дигоксигенин-меченных рибонуклеотидов [3,5шМ digoxigenin-UTP+6,5mM UTP+lOmM ATP+lOmM GTP+10mM- CTP] (Boehringer Mannheim, Enzo, Германия), BMP (Boehringer Mannheim Purple) - субстрат для щелочной фосфатазы (Roche, Германия); блокирующий реагент, БР, blocking reagent (Roche, Германия), левамизол (Sigma, США). Набор Wizard PCR Preps (Promega), набор Wizard Plus Minipreps (Promega), набор T7/SP6-mMessage mMachine (Ambion.), набор RNeasy mini kit(Qiagen).
В работе использовали SP6 полимеразу для транскрипции in vitro (Ambion.), SP6 и Т7 РНК-полимеразы (Promega, США) для синтеза дигоксигенин-меченных РНК-зондов, дигоксигенин-специфичные антитела, связанные с щелочной фосфатазой anti-dig-AP-Fab fragment (Enzo, Германия), эндонуклеазы рестрикции: Xbal, Kpnl, Mhd (Promega), ДНК-лигазу фага T4 (Promega), термостабильную Taq-ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus, термостабильную модифицированную ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus KTN (Ignatov, 1998), Pfu-полимер азу из Pirococcus furiosus, РНКазуН (Promega), протеиназу К (Sigma), РНАзин (Promega).
В работе использовали напольную центрифугу с охлаждением (Jouan GR412); настольную центрифугу с охлаждением (Eppendorf 5415R); настольную центрифугу (Eppendorf minispin Cyclo Temp 202); автоматический ПЦР-амплификатор1 (Eppendorf Mastercycler); водный»термостат с охлаждением (ТЕ-8Е RB-5A Techne); шейкер с термостатируемой камерой (С26 Incubator shaker Edison); термостатируемая качалка (Scello, США); качалка (Shaker S3; ELMI); С02-инкубатор Sanyo МС0175 (Япония), спекторфотометр (Biophotometer, Eppendorf); термостат (ТС-80М-2); источник постоянного тока (Hoefer PS250/2.5 AMP); рН-метр (Radelkis ОР-211/2); УФ-трансиллюминатор (Vilber-Lourmat); весы аналитические (Ohaus); автоматические микропипетки (Gilson), микроинъектор Femtojet (Eppendorf); флуоресцентный стереомикроскоп (Leica MZ FLIII) с цифровой камерой (Leica DC 300F); конфокальный микроскоп Leica TCS SPII (Германия), микроскоп Polyvar (Reichert-Jung, Австрия), нагревательный, столик (Россия), санный микротом (Россия), микроскоп стереоскопический МБС-10 (Россия), термостатируемая, камера (Россия), вортекс (Sybron Thermolyne maxi mix); системы очистки воды (Milli-Q Water Purification system).
Для получения зародышей в работе использовали самцов и самок шпорцевых лягушек X laevis Daudin. Зародыши шпорцевой лягушки X. laevis являются одним из наиболее удобных объектов для исследования процессов развития нервной системы и органов чувств на самых ранних стадиях развития. К достоинствам объекта можно отнести: 1. легкость получения зародышей; 2. большой размер зародышей - 1,2-1,4 мм (что облегчает наблюдения, манипуляции с ними - можно использовать микрохирургичекие методы, осуществлять микроинъекции); 3. развитие до поздних стадий без существенного изменения общего объема зародыша (следовательно, нет разбавления микроинъецированного материала); 4. развитие хорошо изучено, имеются таблицы нормального развития [Nieuwkoop and Faber, 1967]; 5. быстрый темп развития (при комнатной температуре развитие до завершения нейруляции проходит за два дня); 6. наличие большого количества генетических маркеров; 50хТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза в агарозном геле): 2 М трис-ацетат, рН 8.2 М Tris, 1,56 М уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА. Раствор бромистого этидия в воде для окрашивания ДНК в агарозных гелях - 2 мкг/мл. Буфер для ДНК-лигазы фага Т4 (Promega) Буферы для эндонуклеаз рестрикции (Promega) Модифицированный раствор Рингера для культивации зародышей амфибий O.lx MMR+HEPES: O.lMNaCl, 2.0 mM КС1, ImM MgCl2, 2mM CaC12, 5mM HEPES pH7.8,0.1mMEDTA. HEPES1M 2% водный раствор L-цистеина (рН 8.0) 4% раствор фиколла в O.lx MMR+HEPES Среда Лурия-Бертани LB для выращивания бактерий Escherichia coli: 1% бактотриптон, 0.5% дрожжевой эктракт, 1% хлорид натрия.
