Введение к работе
Актуальность и обоснование темы. Существенную роль в регуляции обмена веществ играют изоферменты, участвующие в различных биохимических процессах. В этом отношении большой интерес представляет выдвинутая Давтяном концепция о существовании в природе уреотелических и неу-реотелических изоэизимов аргиназы с различными метаболическими функциями (Давтян, 1968, 1970; Давтян и др., 1970). Не вызывает сомнения то, что в течение онтогенетического развития организмов в процессе клеточной и тканевой дифференцировки с одной стороны постепенно реализуется генетическая информация в виде индукции биосинтеза различных белков, в том числе изоэнзимов, а с другой - непрерывно репрессируется биосинтез других.
Предыдущие исследования нашей лаборатории установили, что в ходе онтогенетического развития амфибий в период метаморфоза в печени индуцируется уреотелическая аргиназа, которая, функционируя совместно с четырьмя известными ферментами биосинтеза аргинина обуславливает формирование орнитинового цикла мочевинообразования. Таким образом, переход амфибий при метаморфозе от аммонотелизма к уреотелизму происходит, главным образом, за счет индукции нового изоэнзима аргиназы - уреотелического. Примечательно, что до метаморфоза в печени амфибий содержатся все 5 ферментов орнитинового цикла, но они не функционируют как единое целое, так как аргиназа является неуреотелической. Следовательно, является ошибочным мнение ряда авторов относительно решающей роли модификации существующей до метаморфоза аргиназы, а не de novo биосинтеза уреотелической аргиназы, в формировании уреотелиз-ма у амфибий (Mora е. а., 1965, 1966; Palacios е. а., 1969; Исаченков, Нестайко, 1971).
С целью подтверждения решающей роли индукции уреотелической аргиназы в механизме становления уреотелизма необходимы дополнительные углубленные исследования аргиназ до и после метаморфоза амфибий.
Существенным является выяснение структурных особенностей аргиназ до и после метаморфоза. В этом плане ценную информацию дает изучение процесса инактивирования аргиназы под влиянием кислой среды или хела-тирующих агентов (ЭДТА), когда фермент распадается на субъединицы, а также процесс реактивирования фермента при рН 9,5 в присутствии высоких концентраций Мп2+, когда субъединицы реассоциируются в олигомер-ную структуру. Изучение механизмов указанных процессов инактивации и реактивации аргиназы включают вопросы участия ионов Мп2+ и функциональных групп (SH- и др.) в формировании олигомерной структуры и обеспечении активности фермента. Перед нами была поставлена задача выяснить особенности инактивирования и реактивирования аргиназы печени лягушек, а также провести сравнительное исследование этих процессов до и после метаморфоза лягушек. Мы преследовали цель новыми аргументами подтвердить наличие существенных различий между аргиназами печени до
и после метаморфоза лягушек, указывающие на различную их генетическую детерминированность и следовательно решающую роль индукции пру метаморфозе новой аргиназы.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является сравнительное изучение следующих вопросов изоэнзимов аргиназы печени лягушек Rana ridibunda до и после метаморфоза:
-
процесс инактивации под действием ЭДТА.
-
процесс инактивации под действием рН 3,6.
-
процессы реактивации предварительно инактивированных изоэнзимов.
-
диссоциация изоэнзимов на субъединицы при инактивации и реассоциа-ция последних в олигомерную структуру при реактивации.
-
роль ионов Mn2+, SH- и других групп в процессах инактивации и реактивации изоэнзимов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые аргиназе печени амфибий подвергнута углубленному изучению, в частности, выявлены особенности процесса инактивирования фермента при кислом рН и воздействии ЭДТА, а также реактивирования фермента при рН 9,5 в присутствии ионов марганца.
Впервые доказано, что механизмы инактивирования фермента различными способами различны и образующиеся при этом субъединицы значи тельно отличаются, особенно по роли SH-групп в проявлении их каталити ческой активности. Механизмы реактивации предварительно инактивиро ванной различными способами аргиназы также существенно различны и і результате образуются принципиально новые олигомерные структуры, от личающиеся от нативного олигомера.
Полученные результаты представляют определенный, на наш взгляд энзимологический интерес. До сих пор судили о процессах инактивации і реактивации лишь по показателям активности фермента. Между тем, иссле дуя роли рН, температуры, ионов Мп2+, влияния тиоловых реагентов, моле кулярные веса субъединиц и олигомеров при инактивации различными спо собами и последующей реактивации аргиназы можно получить более углуб ленную информацию о структуре фермента.
Очевидно, примененные нами указанные подходы при изучении арги назы могут быть полезными при исследовании других ферментов.
Изучая процессы инактивации и реактивации аргиназы, а также значе ние ионов Мп2+ и SH-групп в этих процессах, удалось раскрыть существую щие различия между изоэнзимами аргиназы печени лягушек до и после ме таморфоза, которые неоспоримо доказывают их различную генетическук детерминированность. Очевидно, количественное соотношение изознзимої меняется в течение онтогенеза механизмами индукции и репресии, в част ности, при метаморфозе индуцируется качественно новая аргиназа - урео телическая, играющая решающую роль в формировании уреотелизма.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на отчетных заседаниях кафедры биохимии.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, и списка использованной литературы, включающей 293 наименования. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 15 таблиц и 9 рисунков.
