Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общие сведения о молекулярной биологии ретровирусов .
1. Геномная организация ретровирусов на примере ВИЧ-1 7
2. Организация вириона 8
3. Жизненный цикл ВИЧ-1.
3.1. Проникновение в клетку 12
3.2 Репликация 14
Синтез вирусной ДНК 14
Интеграция провируса 15
Регуляция транскрипции 16
4. Морфогенез и рилизинг 17
5. Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ 17
Глава 2. Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции .
1. Методы твердофазного иммуноферментного анализа в диагностике инфекции ВИЧ 18
2. Тесты второго уровня (подтверждающие) в диагностике ВИЧ инфекции 23
2.1. Иммуноблотинг 23
2.2. Микровариант ИФА (DOT-ELISA) 26
2.3. Радиоиммунопреципитация в диагностике инфекции ВИЧ 29
2.4. Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии 31
Глава 3. Диагностика и мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне
3.1 Диагностические и количественные варианты ПЦР и ее аналогов 34
3.2. Диагностика ВИЧ-инфекции на генетическом уровне: методы детекции ДНК и РНК 38
3.3. Подготовка пробы для анализа и использование внутреннего контроля при детекции ВИЧ-генома 40
3.4. Гибридизационная детекция размноженного фрагмента на твердой фазе 43
3.5. Метод анализа с помощью разветвленных ДНК (BRANCHED DNA SIGNAL AMPLIFICATION ASSAY) 44
3.6. Мониторинг инфекции на генетическом уровне, определение типа циркулирующего ВИЧ 46
3.7. Анализ развития инфекции по данным количественных определений генетического материала 48
Глава 4. Диагностика инфекции ВИЧ-2 51
Часть II. Материалы и методы.
1. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигена ВИЧ и антител к нему 53
1.1 Получение фракции анти—ВИЧ гамма—глобулинов 53
1.2. Определение белка в препаратах антител 54
1.3. Получение иммуноферментных конъюгатов 54
1.4. Получение вирусного антигена
1.4.1. Культуры вирус-продуцирующих клеток 56
1.4.2. Получение ВИЧ-1 АГ для постановки ИФА 56
1.4.3. Получение лизатов клеток, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 56
1.4.4. Получение высокоочищенного антигена ВИЧ-1 57
1.5. Иммобилизация антител к ВИЧ-1 на планшетах для проведения ИФА 58
1.6. Приготовление контрольных образцов положительной (К + ) и отрицательной (К -) сывороток 58
1.7. Приготовление субстрата для реакции ИФА 59
1.8. Проведение реакции конкурентного ИФА
1.8.1. Детекция антигенов ВИЧ-1 59
1.8.2. Детекция антител к ВИЧ-1 59
2. Разработка метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 61
2.1. Получение иммуносорбента (ИС) с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ-1 для реакции ИБ 61
2.2. Получение ИС с иммобилизованными белками ВИЧ—1 для реакции ДИБ 62
2.3. Получение ИС с иммобилизованными индивидуальными белками ВИЧ—2 и проведение реакции ИБ 62
2.4. Рекомбинантные белки ВИЧ-1 63
2.4.1. gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в рекомбинантном штамме вируса осповакцины (рекВОВ) 63
2.4.2. gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в рек-ВОВ VC5.64
2.4.3. gag-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в E.Coli, содержащей рекомбинантную плазмиду pRCp24 64
2.4.4. env-специфические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в E.Coli 64
2.4.5. gag и env-спеиифические антигены ВИЧ-1, экспрессируемые в E.Coli. 65
2.5. Проведение иммуноферментной части ИБ и ДИБ 65
3. Проведение реакции непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии (НИФ) 66
4. Разработка радиоиммунопреципитационного анализа для определения антител к ВИЧ (РИПА) 67
4.1. Получение 1251-меченого АГ ВИЧ-1 и ВИЧ-2 для проведения реакции радиоиммунопреципитации 67
4.2. Получение АГ ВИЧ, меченого 358-метионином 68
4.3. Проведение реакции радиоиммунопреципитации 69
4.4. Сыворотки для определения чувствительности и специфичности разработанного метода радиоиммунопреципитации 70
5. Сыворотки для определения специфичности и чувствительности тест-систем 70
6. Коммерческие тест-системы для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 71
7. Твердофазный и конкурентный ИФА на основе синтетических пептидов
7.1. Синтетические пептиды 72
7.2. Проведение твердофазного и конкурентного ИФА на основе синтетических пептидов 72
7.3. Обработка спектров иммунореактивности (СПИР) 73
7.4. Определение УЗ-серотипа 74
7.5. Синтетические пептиды, применявшиеся для идентификации иммунореактивных эпитопов в белках Т-лимфотропного вируса человека типа 1 (HYLV-1) 74
8. Детекция и анализ вирус-специфических ДНК при ВИЧ-инфекции 75
8.1. Получение препаратов ДНК 75
8.2. Праймеры и зонды 75
8.3. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 75
Часть III. Собственные исследования 78
Глава 1. Разработка методов определения антигенов ВИЧ-1 и антител к нему и оценка их репрезентативности 78
1.1. Разработка конкурентного иммуноферментного анализа и оценка его репрезентативности 78
1.2. Иммуноферментная система для обнаружения антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-1 92
1.3. Разработка метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 107
1.4. Изучение возможности использования рекомбинантных белков для диагностики инфекции ВИЧ-1 1
1.4.1. Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов ВИЧ-1, экспрессируемых в рекомбинантном штамме вируса осповакцины (рек ВОВ) методом КИФА и ИБ 107
1.4.2. Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов ВИЧ-1, экспрессируемых врекВОВ методом иммуноблотинга 112
1.4.3. Изучение иммунологических свойств gag-специфических антигенов, экспрессируемых в E.Coli, содержащей рекомбинантную плазмиду pRCp24, методом DOT-иммуноблотинга 118
1.4.4. Изучение иммунологических свойств env-специфических антигенов ВИЧ-1, экспрессируемых в E.Coli методом КИФА 119
1.4.5. Изучение иммунологических свойств рекомбинантных белков gag и env ВИЧ-1, экспрессируемых в Е. Coli методом иммуноблотинга 120
1.5. Разработка модифицированного метода иммуноблотинга для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-2 123
1.6. Разработка метода радиоиммунопреципитации для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и оценка его репрезентативности 127
1.6.1. Сравнение методов радиоиммунопреципитации и иммуноблотинга в серодиагностике инфекции ВИЧ 130
1.6.2. Использование метода радиоиммунопреципитации в серо эпидемиологических обследованиях групп риска для тестирования сывороток, имеющих сомнительные результаты иммуноблотинга 134
1.6.3. Определение антител к ВИЧ-2 методом радиоиммунопреципитации 137
17. Идентификация иммунореактивности эпитопов в белках, кодируемых генами gag, env и рої Т-лимфотропного вируса человека типа 1 (HTLV-I) с использованием синтетических пептидов 138
18. Изучение иммунореактивности ВИЧ-позитивных сывороток методом ИФА на основе синтетических пептидов 150
1.8.1. Иммунореактивность ВИЧ-позитивных сывороток к V3-имитирующим пептидам в процессе развития инфекции 150
1.8.2. Динамика уровня иммунореактивности ВИЧ-позитивных сывороток к V3 имитирующим пептидам в процессе развития инфекции 160
1.9. Метод непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии 168
Глава 2. Детекция и анализ вирус-специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции
2.1. Детекция провируса в ДНК лимфоцитов. Мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне 170
2.2. Препараты ДНК, праймеры и зонды 171
2.3. Детекция провируса ВИЧ с анализом гибрида гель-электрофорезом 172
2.4. Гибридизация со связыванием на ГАП 173
2.5. Комбинация ПЦР-транскрипция 175
2.6. Анализы проб из крови пациентов 176
2.7. Разработка метода количественной оценки вирус-специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции 176
2.8. Конструирование внутренних стандартов для количественной ДНК, РНК ПЦР и изучение их свойств в модельной системе 178
Глава 3. Альтернативные лабораторные методы детекции ВИЧ 183
3.1. Разработка метода диагностики ВИЧ-инфекций, основанного на принципах лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА), с использованием импортной аппаратуры и реактивов. Разработка отечественного аппаратурного и реактивного обеспечения для конструирования тест-систем на основе ЛИФА 183
3.1.1. Разработка методов диагностики ВИЧ-инфекций с помощью ЛИФА. Определение уровня антител к ВИЧ в сыворотках крови людей с помощью белка А, меченного ионами европия 183
3.1.2. Разработка конкурентной тест-системы ЛИФА для выявления антител к белку р24 в сыворотках крови человека 185
3.1.3. Разработка отечественного и реактивного обеспечения для конструирования ЛИФА-систем 189
3.2. Разработка экспресс метода диагностики ВИЧ-инфекции с помощью мишень-чувствительных липосом 189
3.3. Метод ЭПР для детекции ВИЧ 208
3.4. Методы электронной микроскопии для детекции ВИЧ 215
Выводы 220
Список работ, опубликованных по теме диссертации 221
Библиографический список 228
- Организация вириона
- Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Иммунореактивность ВИЧ-позитивных сывороток к V3-имитирующим пептидам в процессе развития инфекции
- Методы электронной микроскопии для детекции ВИЧ
Организация вириона
Вирион имеет сферическую форму от 100 доІІО нм в диаметре [86]. Двухслойная липидная мембрана пронизана 72 «шипами» («грибками», «головками») gpl20-gp41 комплекса.
Гликопротеины: gpl20-noBepxHocTHbra, a gp41 трансмембранный, компоненты рецепторного комплекса ВИЧ-1. gpl20 связывается с СБ4-рецептором и отвечает вместе с gp41 за процесс фузии вирусной и клеточной мембран. В отличие от всех цитоплазматических белков ВИЧ-1 gpl20-gp41 комплекс доставляется на клеточную поверхность через секреторные пути клетки.
N-конец gag котрансляционно миристилируется. При взаимодействии миристата с липидами клеточной мембраны gag-молекулы самоассоциируются, при этом образуются сферические мембранные структуры и происходит процесс созревания вирионов, их почкование и отщепление. Матриксный белок лежит на N-конце gag и находится в тесном контакте с мембраной вириона за счет миристиловой кислоты. МА взаимодействует с цитоплазматической частью gp41.
Мутации в МА приводят к синтезу "голых" вирионов, не содержащих gpl20-gp41 комплекс. Введение компенсирующей мутации, приводящей к укорочению gp41, восстанавливает включение gpl20-gp41 комплекса в почкующиеся вирионы.
Самый большой продукт gag - капсидный белок (СА), по мере расщепления предшественника укладывается в конусообразный капсид, узкая часть которого контактирует с мембраной вириона. Капсид взаимодействует с клеточным белком циклофилином А (Цф А), который включается в состав вириона. Циклофилины - высоко консервативные белки эукариотических клеток, составляющие по массе от 1 до 2% всех белков клетки. Циклофилины катализируют фолдинг белков-субстратов, перенос белков через разные компартменты, т.е. выполняют функции шаперонов [133].
Цф А с молекулярной массой - 18Ш является ферментом цис-транс изомеразой пептидил-пролиновых связей белковых субстратов и может инициировать транскрипцию гена IL-2a счет дефосфорилирования i-kB и высвобождения NF-kB.
Внутри капсида находятся две молекулы геномной РНК, связанные 5 - концами между собой и с NC. Нуклеокапсид отвечает за упаковку вирионной РНК и участвует в процессе обратной транскрипции. Все ферменты, обнаруживаемые в вирионе, являются продуктами расщепления рої-домена полипротеина Gag-Pol. На 3 -конце гена gag его рамка считывания перекрывается с рамкой считывания рої-гена.. При трансляции gag-гена. в области рб происходит рибосомный сдвиг рамки считывания. В результате начинается синтез полипротеина Gag-Pol. Рибосомный сдвиг происходит не чаще, чем в 5-10% случаев, этого достаточно для синтеза вирусспецифических ферментов, кодируемых ро/-геном.
Любопытно, что порядок расположения генных последовательностей, кодирующих вирусные ферменты в рої-гене, коррелирует с очередностью их функций в жизненном цикле вируса, начиная с момента рилизинга вирионов. Сначала протеаза активизируется за счет димеризации молекулы Gag-Pol и расщепляет полипротеины Gag и Gag-Pol, участвующие в созревании вирионов. Затем RT синтезирует в цитоплазме провирусную ДНК, а интеграза включает ее в геном клетки.
Кроме белков Gag, Pol и Env, являющихся структурными компонентами всех ретровирусов, лентивирусы, к которым относятся вирусы иммунодефицита, имеют дополнительные регуляторные белки. ВИЧ 1- самый сложный из всех ретровирусов кодирует шесть регуляторных белков, два из которых абсолютно необходимы для репродукции. Tat отвечает за инициацию транскрипции вирусной РНК, а в его отсутствие образуются только укороченные транскрипты [96, 202]. Rev отвечает за контроль сплайсинга вирусной мРНК и ее транспорт из ядра в цитоплазму [135]. При блокировке Rev синтезируется только ранние белки Tat, Rev и Nef. Не очень удачно называют неструктурными, несущественными или регуляторными белки Nef, Vif, Vpr, Vpu. Более расплывчатый термин - аксессорные белки, быть может, более точен.
В работах последних лет Nef белок обнаруживают в составе вирионов. Это мультифункциональный белок с мол. массой 27 KD. Он миристилирован (хотя известны и немодифицированные варианты Nef), преимущественно аккумулируется в цитоплазме, но через миристиловый остаток глицина (второй остаток консервативен для всех изолятов ВИЧ) контактирует с плазматической мембраной [158, 57]. Nef находят и в ядре и в цитоскелете клетки. Nef- один из ранних белков, он высокоиммуногенен. Nef - несущественен для репродукции ВРЇЧ в Т-клеточных культурах in vitro, но способствует усилению инфицирующей способности вирионов, их активному распространению и высокому титру in vivo, а также прогрессии болезни в СПИД. Дефектные по nef, аттенуированные штампы ВИЧ-1 обнаружены у многих ВРЇЧ- инфицированных долгожителей, т.н. "непрогрессоров". Nef уменьшает количество CD-4 рецептора на поверхности инфицированных клеток и приводит к эндоцитозу молекул МНС 1 класса, что позволяет зараженным клеткам избегать атаки цитотоксических Т-лимфоцитов. Nef взаимодействует с системой передачи клеточных сигналов и клатрин-зависимыми белками. Nef содержит РххР мотив, отвечающий за связывание с SH 3 доменом Src-киназ, и усиливает репликацию ВРЇЧ. По мере созревания вирионов nef расщепляется на Рг.
Кг/белок с молекулярной массой 23 kD, с высоким содержанием основных аминокислот, т.н. фактор вирусной инфекционности. В его отсутствие образуются дефектные вирусные частицы, хотя трансмиссия вируса от клетки к клетке меняется несущественно. Vif участвует в ассамблировании и созревании вирионов, взаимодействуя с Рг [93, 112].
Vpr - белок с молекулярной массой 14 Ш, включающийся в состав вириона, взаимодействует с рб частью Рг 55 gag-предшественника. Находясь в ядре, отвечает за ядерный импорт преинтеграционного комплекса. Vpr блокирует клеточный цикл в фазе G2, трансактивирует клеточные гены и индуцирует клеточную дифференцировку. Vpr - активатор ранней транскрипции. На первых этапах жизненного цикла ВИЧ, когда еще нет белка Tat, Vpr трансактивирует транскрипцию во вновь инфицированных клетках. Vpr синтезируется на поздних этапах репликации ВИЧ и включается в состав новых вирионов [64]. Vpr гомологичен гену vpx ВИЧ-2 [94]. Vpu-белок с молекулярной массой 16 Ш, уникален для ВИЧ-1 и SIVcpz. ВИЧ-2 и другие вирусы обезьян не имеют vpu. Он отвечает за деградацию CD4 в эндоплазматическом ретикулуме, независимо от Nef удаляет CD4 с мембран инфицированных клеток и ингибирует биосинтез МНС-1. Vpu влияет на почкование вирионов, усиливая рилизинг с плазматической мембраны инфицированной клетки. Vpu влияет на созревание Env, но не включается в вирион. Vpu участвует в апоптозе, повышая чувствительность ВИЧ-инфицированных клеток к Fas-киллингу [187, 93].
Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Использовали препараты ДНК из лимфобластных клеточных линий МТ4 или СЕМ, хронически инфицированных ВИЧ. А также ДНК лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц. Для выделения ДНК фракционированные и собранные клетки суспендировали в лизисном буфере (20 мМ трис-HCl рН 8,8; 50 тМ КС1; 2,5 мМ MgCI; 1% твин-20; 1 % тритон Х-100) объемом 50 мкл, если клеток было менее 5 млн. т. е. 10 мкл на 1 млн. клеток. К смеси добавляли раствор протеиназы К (10 мг/мл) из расчета 1 мкл на 1 млн. клеток и инкубировали 2 ч при 55—60 С, а затем 20 мин при 95С для инактивации протеиназы К.
d(TAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAG AACTCAAGA) (АРЗ),
d(AACCCTGCGGGATGTGGTATTCC TAATTGAACTTC) (АР4),
d(GAAAAATATGCATCACCCACAT CCAGTAC) (АР5),
d(CTCCATTTAGTACTGTCTTTTTTCTTT ATGGCAAAT) (AP8),
d(TAATACGACTCACTATAGGATGGC
CCAAAAGTTAAACAATGGCC) (TP7). а также GH26 и GH27 [162] были синтезированы фосфоамидитным методом В.К.Потаповым (Институт биоорганической химии РАН) и Т.С.Орецкой (Химический факультет МГУ).
Использовали ДНК-полимеразу Taq МП «Биомастер» и «Бион» (Москва) и РНК-полимеразу фага Т7, любезно предоставленную С.Н.Кочетковым (Институт молекулярной биологии РАН).
При проведении ПЦР готовили общий раствор всех компонентов в ПЦР-буфере (20 мМ трис.НСІ рН 8.8; 50 мМ КС1; 2.5 мМ MgCb; 170 мкг/мл желатин), содержащем по 0,1 мМ daTP, d TTP. dGTP и dCTP, no 0,2 пмоль каждого, праймера и TAq-полимеразу (5 ед. активности на 100 мкл смеси), 20 мкл этого раствора смешивали с 2—40 мкл лизата лимфоцитов и проводили 30 циклов ПЦР на амплификаторе фирмы «Techne» (Англия) или НПО «Вектор» (Россия). При необходимости проводили контроль приготовления проС ДНК путем амплификации 242-звеиного фрагмента маркерного гена HLA-DQa [162]. При этом в анализируемую смесь вводили дополнительную пару праймеров — GH26 и GH27 и анализировали продукты ПЦР электрофорезом с прокрашиванием геля бромидом этидия.
Для транскрипции амплификата к 1 мкл смеси после ПЦР добавляли 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl рН 8,1; 10 мМ MgCl2; 5 мМ дитиотреитола, 1 мМ спермидина, по 0,5 мМ АТР, GTP, СТР и UTP; 50 мкг/мл РНК-полимеразы Т7. Смесь инкубировали 1 ч при 37С и вводили в гибридизацию.
При анализе гибрида гельэлектрофорезом 10 пмоль зонда метили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы и [у Р]АТР в 10 мкл киназного буфера по известной методике [49] после чего к смеси добавляли 140 мкл 60 мМ NaCl; 40 мкл 40 мМ ЭДТА и 50 мкл 50 % глицерина, содержащего по 0,01 % ксиленцианола и бромфенолового синего. 6 мкл полученного раствора добавляли к 10 мкл смеси после ПЦР или транскрипции, смесь инкубировали 5 мин при 95 С и 15 мин при 55 С. Затем раствор сразу же наносили на 10% полиакриламидный гель, проводили электрофорез и авторадиографию.
При гибридизации со связыванием на ГАП зонд после мечения очищали гельэлектрофорезом с последующей элюацией из геля. 0,2 пмоль меченого зонда добавляли к 100 мкл РВ (0,12 М Na-фосфат рН 6,8; 0,1 % SDS), затем в смесь добавляли 10 мкл раствора после ПЦР или транскрипции. Инкубировали 5 мин при 95С и 15 мин при 55С, затем добавляли 10 мл суспензии ГАП в РВ (1:1 по объему) и перемешивали. Далее отбирали супернатант и отмывали ГАП 3 раза по 200 мкл РВ, затем просчитывали по Черенкову объединенную жидкую фазу и осадок ГАП. Процент связывания зонда рассчитывали как отношение радиоактивности на ГАП к общей радиоактивности.
Иммунореактивность ВИЧ-позитивных сывороток к V3-имитирующим пептидам в процессе развития инфекции
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). В настоящее время, распространение ВИЧ приобрело характер пандемии и охватило все страны мира.
ВИЧ демонстрирует чрезвычайно высокую генетическую изменчивость. Основным источником изменчивости ВИЧ являются ошибки обратной транскриптазы, не обладающей 3 — 5 -экзонуклеазной активностью, что приводит к появлению точечных мутаций с частотой около 10"3-ь10 на нуклеотид в Iм цикле репликации (в то время, как вероятность соматических мутаций на 5 151 6 порядков ниже). Поскольку геном ВИЧ состоит из 10 нуклеотидных пар, то каждый потомок отличается от родительского варианта, в среднем, 1ич-10ю нуклеотидными заменами. С учетом высокой интенсивности генерации новых вирусных поколений даже в латентной стадии инфекции понятно, что в организме инфицированного пациента циркулирует чрезвычайно обширное множество вариантов ВИЧ.
Квазивид ВИЧ существенно изменяется с течением времени даже в организме одного пациента [16]. В связи с этим, особое значение приобретает проблема выбора наиболее значимых критериев для прогнозирования возможных направлений патогенеза инфекции, - главным образом, длительности латентной стадии и прогрессирования в СПИД. Так как изменения уровня иммунореактивности сыворотки к различным антигенным детерминантам ВИЧ может отражать функциональное состояние иммунной системы и процесс селекции вирусных вариантов в организме-хозяине, то изучение динамики уровня иммунореактивности к функционально-важным эпитопам ВИЧ может помочь решению поставленной задачи.
Широкое распространение для изучения иммунологических свойств различных вариантов ВИЧ получили синтетические пептиды, имитирующие функционально-важные эпитопы поверхностных гликопротеинов [29, 168], так как они являются основными мишенями действия иммунной системы. При этом наибольшее внимание привлекает один из гипервариабельных участков gpl20 -так называемая V3-петля, фланкированная цистеинами в позициях 303-337, образующими дисульфидную связь. Это объясняется тем, что даже единичные аминокислотные замены в пределах V3-петли влияют на антигенные свойства gpl20, инфекционность вируса, его тропизм, синцитиеобразующую активность, скорость репродукции и нейтрализуемость антителами [152].
В данной работе исследована динамика уровня иммунореактивности по отношению к панели V3-имитирующих пептидов сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов, длительное время наблюдавшихся в Институте иммунологии МЗ РФ. Полученные данные сопоставлены с особенностями клинического статуса пациентов. Предложены прогностические критерии, позволяющие предсказать направление развития ВИЧ-инфекции.
В силу чрезвычайно высокой генетической изменчивости ВИЧ, иммунная система инфицированного пациента постоянно сталкивается с новыми вариантами вирусных антигенов. В этих условиях, СПИР к любому фиксированному набору антигенов не является постоянным a priori и его стабильность в ходе развития инфекции нуждается в экспериментальной верификации. Сказанное относится, в том числе, и к СПИР по отношению к V3-имитирующим синтетическим пептидам.
Результаты исследования СПИР сывороток от длительно мониторируемых ВИЧ-1-позитивных пациентов по отношению к использованным V3 -имитирующим пептидам представлены на рисунке 9. Для тех образцов, у которых известны аутологичные генетические последовательности V3-петли, имеет место соответствие между генотипом и серотипом. Тем не менее, это соответствие не полностью однозначно: генотипу может соответствовать несколько «родственных» серотипов. Например, генотипу С соответствуют серотипы А/С (К2-1, КЗ-2) и А/С+В (К6-6); генотипу В - серотипы В (К1-2, К10-1), В+А/С (К5-4, К13-3, К17-1), B+A/C+D (К14-2, К14-7) и А/С+В (К7-4).
Обширная пептидная панель не всегда является более адекватной для серотипирования ВИЧ. Например, сыворотки почти всех пациентов (за исключением К4 (серотип D+A/C), К7 (серотип А/С+В), К12 (серотип В+А/С), К16 (В+А/С)), демонстрируют высокую ИР по отношению пептидом MV-643 ВИЧ-IMN- В принципе, можно было бы объединить сыворотки, реагирующие с MV-643, в отдельный серотип, но такой серотип соответствовал бы одновременно нескольким генотипам.
При этом интересно отметить, что с пептидом MV-643, содержащем тетрамер GPGR, взаимодействуют не только сыворотки серотипов В и В+А/С, но и сыворотки пациентов К2 и КЗ, имеющих серотип А/С. Последовательность V3-петли gpl20, аутологичной К7-4, содержит верхушечный тетрамер GPGR, в то время как все сыворотки К7 хорошо реагируют с NM-120, содержащим GPGQ на вершине УЗ-петли. Это иллюстрирует тот факт, что выявленный нами ранее [24] «аргинин-глутаминовый триггер» в четвертой позиции центрального тетрамера GPG — модулируется физико-химическими свойствами аминокислотных остатков, фланкирующих центральный тетрапептид [25]. Нехарактерные для сывороток, аутологичных GPGR-содержащим вариантам V3, СПИР сывороток К7 серотипа А/С+В, вероятно, объясняются наличием необычного верхушечного V3-мотива K314GPGR318. Кроме того, GPG —-триггер имеет статистическую природу, и его не следует понимать в том смысле, что сыворотки, реактивные по отношению к GPGR-содержащим пептидам должны обязательно не реагировать с GPGQ-содержащими пептидами (в этом случае, отсутствовали бы серотипы В+А/С и А/С+В) - см. сыворотки КЗ, реактивные и с MV-643, и с NM-120.
Методы электронной микроскопии для детекции ВИЧ
Осуществлено маркирование антигенов вируса иммунодефицита человека первого и второго типов на ультратонких срезах инфицированных клеток после заключения их в низкотемпературную среду с помощью антител, меченных коллоидным золотом, показана локализация вирусных белкой внутри клеток в процессе инфекции с помощью биотилированных ДНК зондов, содержащих последовательности генов рибосом, осуществлена их гибридизация in situ с клеточной рРНК на ультратонких срезах в клетках животных Представленный метод позволяет определять топографию белков и нуклеиновых кислот, внутри метки на ультраструктурном уровне. Для сохранения структуры и антигенных свойств биологических объектов в последние несколько лет были предложены среды на основе акрилового и метакрилового эфиров. Коммерческое название их Ловикрил К4М, КИМ, НМ20, НМ23. Эти среды полимеризуются при отрицательных температурах (до -80 С) [54] при непрямом облучении ультрафиолетовой лампой и наличии фотоинициатора. Важной особенностью Ловикрила является то, что он в отличие от сред типа Эпон и Аралдит не образует ковалентных связей с заключенным в него материалом [116]. Вследствие этого в процессе получения ультратонких срезов происходит отрыв полимера от материала, находящегося в нем. При этом антигенные сайты обнажаются, становясь доступными для взаимодействия с антителами.
Задачей нашего исследования являлась индикация антигенов вируса иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1 и ВИЧ 2) на ультратонких срезах.
Для этой цели были взяты хронически инфицированные культуры лимфоцитов человека EVK-2 и СЕМ. Клетки были заключены в Ловикрил К4М по методике, приведенной в работе Григорьева и соавторов. В качестве антител были использованы: сыворотка от пациента, содержащая антитела практически ко всем белкам ВИЧ-1, поликлональная сыворотка к рекомбинантному белку-предшественнику, продукту гена «gag», моноклональные сыворотки к белкам gp20, gp41, р24. В качестве вторичных антител были использованы IgG, меченные коллоидным золотом (диаметр частиц 10 нм; Jenssen).
В результате экспериментов с поликлональными сыворотками была получена интенсивная специфическая метка, в основном на вирионах, находящихся в межклеточном пространстве (рис. 15) В случае моноклональных антител интенсивность метки падала, что объясняется небольшим количеством эпитопов, экспонированных на поверхности среза (рис. 16) Удалось также показать на ультраструктурном уровне наличие общих антигенных детерминант у белков сердцевины ВИЧ 1 и ВИЧ 2, что подтверждает данные, полученные иммунологическими методами.
Преимущественная локализация метки на вирионах указывает на отсутствие аккумуляции вирусоспецифических белков в цитоплазме. Этот факт, в свою очередь, позволяет сделать предположение о том, что время между синтезом этих белков и процессом почкования вируса очень мало.
В нашем эксперименте среднее количество гранул на вирион составляло 5 ± 1, что практически совпадало с плотностью метки на криосрезах [85]. Таким образом, чувствительность иммуноцитохимических реакций с применением Ловикрила не уступает чувствительности реакций на криосрезах.
Представленные результаты убедительно продемонстрировали, что низкотемпературная среда может быть с успехом применена для установления антигенных различий вирусов одного семейства.
