Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4 Альперн Даниил Валерьевич

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 11

Гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a 11

Структура и функции HNF4a 11

Структура белка 12

Структура гена и изоформы 12

Модуляция транс-активационных функций изоформ 14

Функции HNF4a 15

Метаболизм 16

Клеточная адгезия иморфогенная активность 16

Регуляция клеточного цикла 17

Дифференцировочный фактор 17

Диабет 18

Гепатоканцерогенез 18

Специфичность экспрессии и роль HNF4a на отдельных этапах онтогенеза 19

Ранний эмбриогенез 19

Поздний эмбриогенез и взрослый организм 21

Регуляция экспрессии гена HNF4a 23

Регуляция активности промотора Р1 24

Регуляция активности промотора Р2 26

Факторы, участвующие в регуляции экспрессии HNF4a 27

Печеньспецифические факторы транскрипции 27

HNF1 28

С/ЕВР 29

FoxA(HNF3) 30

HNF6(Onecut) 31

FTF 31

COUP-TF 32

GATA 32

Нетканеспецифические аспекты регуляции активности HNF4a 32

Опухолевый супрессор р53 33

Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки 35

Последствия инактивации р53 у мышей 35

Негативная регуляция АФП белком р53 36

Негативная регуляция экспрессии HNF4aPl белком р53 37

Трансформирующий фактор роста (TGFP) 37

TGFP лиганд 38

Рецепторы TGFP 39

Белки Smad 42

TGFp сигнальный путь 43

Альтернативные сигнальные пути 45

TGFp-зависимая регуляция экспрессии HNF4a 46

Кооперация р53 и TGFP сигнальных путей 48

Материалы и методы

Список использованных растворов и сред 51

Животные 52

Клеточные линии 52

Плазмидные конструкции 53

Трансформация клеток Е. Coli 53

Трансфекция и инфекция клеток линии HepG2 53

Анализ активности репортерного гена люциферазы 54

Выделение РНК 54

Выделение высокомолекулярной геномной ДНК 55

Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 55

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ) 55

Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a мыши 57

Клонирование промоторного участка Р2 гена HNF4a человека и направленный мутагенез 58

Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 60

Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов 60

Вестерн-Блот гибридизация 61

Результаты и обсуждение 63

В печени взрослых р53 мышей происходит активация экспрессии эмбриональной изоформы HNF4a7 64

Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4aP2 67

Снижение уровня р53 вызывает активацию промотора Р2 в культуре клеток HepG2 70

Биоинформатический анализ нуклеотидной последовательности промоторного элемента Р2 гена HNF4a мыши и человека 76

Действие цитокинов TGFpi и TGFP2 проводит к изменению баланса экспрессируемых изоформ HNF4a в культуре клеток HepG2 78

Компоненты TGFp сигнального пути активируют промотор Р2 напрямую, в то время как репрессия промотора Р1 происходит опосредованно дополнительными факторами 82

Факторы TGFpi и TGFp2 способны активировать экспрессию репортерного гена под контролем Р2 промотора HNF4a мыши 86

Ингибирование передачи сигнала от рецептора TGFP препятствует подавлению синтеза HNF4aPl и активации HNF4aP2 88

Направленный мутагенез предполагаемого сайта связывания Smad в промоторе Р2 гена HNF4a человека не приводит к изменению активности этого промотора под действием TGFP2 90

Ингибирование МЕК сигнального пути блокирует TGFp-зависимое подавление экспрессии изоформ HNF4aPl, но не влияет на активацию HNF4aP2 95

Возможная кооперация р53 и TGFp-сигнальных путей в регуляции транскрипции HNF4a 100

Заключение 102

Выводы 105

Приложение 106

Благодарности 107

Список литературы

• Модуляция транс-активационных функций изоформ
• Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки
• Трансформация клеток Е. Coli
• Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4aP2

Введение к работе

Формирование органов и тканей многоклеточного организма происходит в результате процессов деления и последующей специализации определенных групп клеток. Эти процессы регулируются в пространстве и времени. Переход клеток из менее специализированных типов в более специализированные называется клеточной дифференцировкой. Он сопровождается различными изменениями, которые можно оценивать физическими или биохимическими параметрами. Меняется размер клеток, их форма, полярность, степень подвижности и уровень метаболической активности. Процесс дифференцировки клеток может приводить к значительному изменению их морфологических или биохимических показателей, однако, за редким исключением, он не затрагивает изменений в последовательности ДНК. Таким образом, все указанные изменения происходят в результате модификации генетической программы клетки. Она характеризуется активностью определенной группы генов, которые позволяют клетке выполнять свои специализированные функции, в то же время гены, активность которых не востребована в данный момент в конкретном типе клеток, оказываются заблокированными. Изменение генетической программы или спектра экспрессирующихся в клетке генов может приводить к ее переходу в другой тип или утрате дифференцировки.

В процессе развития организма дифференцировка клеток происходит в результате действия на клетку внешних сигналов в виде ростовых факторов, которые активируют внутриклеточные сигнальные каскады реакций. В свою очередь эти каскады приводят к модуляции транскрипции определенной группы генов, которые формируют так называемые регуляторные сети. Сложная система иерархических взаимодействий в этих сетях может выражаться в том, что изменение уровня транскрипции одного или нескольких генов приводит к модификации всей генетической программы клетки.

По мере повышения специализации в клетке начинается экспрессия так называемых тканеспецифических генов, которая являются одним из основных критериев уровня дифференцировки. Эти гены отвечают за синтез белков, обеспечивающих функционирование данного типа клеток в структуре ткани и органа. Регуляцию их экспрессии осуществляют тканеспецифические факторы транскрипции, которые в свою очередь контролируются общими транскрипционными сигналами.

Дифференцировка клетки обычно сопровождается постепенным снижением числа активных генов. В то же время происходит увеличение активности отдельных генов, выполняющих специализированные функции. Этот процесс контролируется

внутриклеточной системой регуляторов экспрессии генов, которые осуществляют тонкую настройку транскрипционной программы клетки при помощи сети тканеспецифических факторов транскрипции.

Регуляторная сеть гепатоспецифических ядерных факторов (ГЯФ, HNF -Hepatocyte nuclear factors) является одной из наиболее изученных моделей тканеспецифической регуляции экспрессии генов. Гепатоцитарные ядерные факторы играют центральную роль в установке и поддержании дифференцировки гепатоцитов. Они не только контролируют экспрессию гепатоспефических генов, но и регулируют процессы пролиферации и морфогенеза. Группа ГЯФ включает в себя пять семейств транскрипционных факторов HNF1, Fox A, HNF4, HNF6 и С/ЕВР, экспрессия которых выявляется не только в клетках печени, однако именно в них достигается максимальный уровень синтеза представителей всех семейств. Вероятно, тканевая специфичность экспрессии генов печени достигается в результате одновременного действия нескольких факторов [Лазаревич, 2000].

Одним из важных аспектов канцерогенеза наряду с нарушением механизмов регуляции клеточной смерти (апоптоза) и размножения (пролиферации), является утрата опухолевыми клетками дифференцировочного статуса. Так же, как и дифференцировка, обратно направленный процесс происходит в результате изменения спектра экспрессирующихся в клетке генов, которое обусловлено нарушением скоординированной работы факторов транскрипции.

Дедифференцировка опухолевых клеток, наблюдаемая в процессе гепатоканцерогенеза, ассоциирована с подавлением экспрессии целого ряда генов, кодирующих функциональные белки печени, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, опухолевые супрессоры, а также тканеспецифические транскрипционные факторы.

Множество исследований демонстрирует, что гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a играет одну из ключевых ролей в регуляции дифференцировки клеток печени. Сайты связывания этого транскрипционного фактора выявлены приблизительно в половине активно транскрибирующихся генов печени и поджелудочной железы человека [Odom et ah, 2004]. Он регулирует экспрессию большинства остальных ГЯФ и играет решающую роль в развитии и нормальном функционировании печени и поджелудочной железы [Parviz et ah, 2003 ; Kyrmizi et al, 2006]. Кроме того, эксперименты, проведенные в нашей лаборатории, показывают, что нарушение экспрессии HNF4a является важным этапом прогрессии гепатоцеллголярных карцином, а восстановление его экспрессии в

культуре клеток дедифференцированной гепатокарциномы (ГК) мыши приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al, 2004].

Регуляция экспрессии гена HNF4a другими гепатоцитарными ядерными факторами на разных этапах развития активно изучается. Однако до сих пор остается неясным, чем определяется нарушение экспрессии HNF4a, а также других тканеспецифических транскрипционных факторов в опухолях, и участвуют ли в этом процессе нетканеспецифические сигнальные каскады, особенно те из них, изменение активности которых происходит на разных стадиях канцерогенеза.

Экспрессия гена HNF4a осуществляется с двух независимых промоторов, в результате чего образуются две группы изоформ HNF4aP2 и HNF4aPl. Изоформы HNF4aP2 экспрессируются в эмбриональной печени и в норме не обнаруживаются после рождения, их замещают изоформы HNF4aPl. В то же время, экспрессия HNF4aP2 может происходить на ранних этапах гепатоканцерогенеза и свидетельствует о начальных этапах процесса дедифференцировки [Lazarevich et al, 2004 ; Флейшман и др., 2008].

Существуют немногочисленные указания на то, что в регуляции экспрессии HNF4a могут участвовать различные нетканеспецифические факторы. К их числу относится онкосупрессор р53, белок, мутации которого часто встречаются в различных типах опухолей. Являясь транскрипционным фактором, р53 играет важнейшую роль в регуляции клеточного цикла и индукции апоптоза при повреждении ДНК [Bargonetti and Manfredi, 2002]. Есть данные о том, что инактивация гена р53 может приводить к блоку дифференцировки гепатоцитов [Dumble et al, 2001].

Цитокины семейства трансформирующих факторов роста р (TGFP) являются вероятными кандидатами на роль связующего звена между печеньспецифическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза. Факторы этого семейства участвуют в поддержании морфологических и дифференцировочных свойств, а также в контроле пролиферации и апоптоза как в печени, так и в других эпителиальных тканях [Thiery, 2002].

Роль TGFP в канцерогенезе двойственна. TGFpi был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что на некоторые виды опухолей он может оказывать супрессирующее действие [Massague, 1998]. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что действие цитокинов TGFp на опухолевые клетки зависит от стадии канцерогенеза и особенностей исходной ткани, из которой произошла опухоль [Rossmanith and Schulte-Hermann, 2001 ; Breuhahn et al, 2006 ; Fransvea et al, 2008].

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось исследование механизмов регуляции транскрипции центрального фактора гепатоцитарной дифференцировки HNF4a при гепатоканцерогенезе и проверка предположения об участии факторов р53 и TGFp в этом процессе. В ходе работы планировалось выяснить возможное место компонентов общих сигнальных путей р53 и TGFp в регуляции системы тканеспецифической экспрессии генов печени.

Указанная цель подразумевала решение следующих задач:

1. Анализ спектра экспрессии гепатоспецифических транскрипционных факторов в печени мышей, нокаутных по гену р53.

2. Создание линии клеток HepG2 с инактивированным р53 и анализ ассоциированного с этим изменения спектра экспрессии гепатоспецифических генов, определяющих уровень дифференцировки клеток.

3. Исследование механизмов дифференциальной регуляции альтернативных промоторов гена HNF4a при подавлении экспрессии гена р53 и индукции TGFp-зависимого сигнального пути в клетках гепатомы человека HepG2.

4. Изучение механизмов TGFp-зависимого переключения экспрессии изоформ гена HNF4a на этой модели.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе представлено исследование влияния факторов

нетканеспецифических сигнальных путей на экспрессию центрального регулятора дифференцировки гепатоцитов HNF4a.

Многочисленные исследования показывают, что прогрессия гепатокарцином может быть связана с нарушением функций гепатоцитарных транскрипционных факторов. Одним из важнейших ГЯФ является HNF4a, который рассматривается как ключевой регулятор гепатоцитарной дифференцировки. В нашей лаборатории было показано, что подавление экспрессии HNF4a является частым событием при прогрессии гепатокарцином, а его экзогенная экспрессия в клетках дедифференцированной гепатокарциномы мыши вызывает реверсию злокачественного фенотипа. Кроме того, активация экспрессии эмбриональных изоформ HNF4aP2 в печени может свидетельствовать о ранних этапах опухолевой трансформации. В последние годы появились данные о нарушении экспрессии HNF4a в карциномах почки и кишечника, что

позволяет рассматривать этот фактор как потенциальный опухолевый супрессор для некоторых типов эпителиальных тканей.

За последнее десятилетие накоплено большое количество данных о механизмах взаимной регуляции между гепатоцитарными ядерными факторами. Однако до сих пор остается актуальным вопрос о взаимодействии сети ГЯФ с общими сигнальными каскадами. Существуют указания на то, что именно HNF4a может выступать в качестве связующего звена между сетью тканеспецифических регуляторов транскрипции и общими клеточными сигнальными путями. Частным случаем этой проблемы является вопрос о механизмах подавления активности HNF4a в канцерогенезе, которое происходит в результате нарушения внутриклеточных каскадов сигнальных реакций.

Таким образом, исследование возможных механизмов регуляции экспрессии HNF4a представляет не только теоретическое, но практическое значение.

В нашей работе мы показали, что экспрессия гена HNF4a может изменяться при инактивации опухолевого супрессора р53. Ранее были опубликованы данные о том, что в печени нокаутных по гену р53 мышей может происходить накопление недодифференцированных клеток-предшественников гепатоцитов. В ходе нашего исследования мы выяснили, что инактивация р53 повышает уровень экспрессии эмбриональных изоформ HNF4a в печени взрослой мыши и в культуре клеток гепатомы человека. Мы продемонстрировали, что подавление функции р53 в клетках гепатомы человека приводит к активации альтернативного промотора Р2 гена HNF4a.

Мы показали, что при активации TGFp-сигнального пути в культуре гепатомы человека происходит переключение экспрессии изоформ HNF4a со взрослых на эмбриональные, свидетельствующее о снижении уровня дифференцировки. Кроме этого мы выяснили, что этот процесс связан с индукцией одного из важнейших клеточных сигнальных путей - МАР киназного каскада.

Выявление механизмов регуляции экспрессии гена HNF4a представляется важным для разработки новых подходов для терапии опухолей печени, а также для понимания фундаментальных основ процесса дифференцировки в ходе эмбрионального развития животных и человека.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гепатоцитарный ядерный фактор HNF4a

Структура и функции HNF4a

HNF4a был открыт как активатор промоторов специфических для печени генов

транстиретина и аполипопротеина (Аро) СШ [Sladek et ai, 1990]. Семейство белков HNF4 (NR2A1) включено в суперсемейство так называемых «сиротских» ядерных рецепторов, лиганды которых неизвестны. По своей структуре они сходны с белками-рецепторами стероидных, тиреоидных, ретиноидных гормонов и витамина D, т.е. лиганд-зависимых транскрипционных факторов, играющих важную роль в регуляции метаболизма и дифференцировки различных типов клеток. Ген HNF4y локализован на 8 хромосоме человека и экспрессируется в почках, поджелудочной железе, яичниках и кишечнике. HNF4P не выявлен у млекопитающих [Drewes et al, 1996; Holewa et ai, 1997].

Белки семейства HNF4 содержат ДНК-связывающие домены типа «цинковых пальцев» и структурно близки к ретиноидному рецептору X. Единственный представитель семейства, который экспрессируется в печени - фактор HNF4a. Он связывается с ДНК в виде гомодимера, а не гетеродимера, как ретиноидный рецептор. Сайт связывания HNF4a для большинства генов-мишеней представляет собой прямые повторы AGGTCA, разделенные одним (реже двумя) нуклеотидами. Похожую консенсусную последовательность связывания с ДНК имеют многие белки из семейства ядерных рецепторов [Sladek et al, 1990; Hatzis and Talianidis, 2001]. Часто в промоторе или энхансере одного гена находится сразу несколько сайтов, с которыми связывается HNF4a.

Лиганд, способный достоверно модифицировать активационные свойства HNF4a in vivo, пока не обнаружен, однако имеются данные о том, что жирные кислоты могут напрямую модулировать активность HNF4a, связываясь с ним посредством ацетил-СоА-фрагментов [Hertz et al., 1998]. Активационный эффект жирных кислот зависит от степени насыщения и длины их углеводородного скелета, в зависимости от чего они могут как усиливать, так и ослаблять транскрипцию определенных генов [Magenheim et al., 2005]. Активность HNF4a модулируется пост-транскрипционно через ацетилирование и фосфорилирование полипептидной цепи [Hatzis et al, 2006]. Важную роль в поддержании активности HNF4a могут играть коактиваторы транскрипции, в частности SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator-1) и PGC-la (Peroxisome Proliferator-activatcd Receptor Gamma (PPARy) Coactivator-1 а), понижение уровня синтеза которых приводит к значительному

снижению уровней экспрессии генов-мишеней HNF4a и уровня дифференцировки гепатоцитарных клеток [Martinez-Jimenez et al, 2006].

Структура белка

HNF4a представляет собой полипептид длиной около 460 аминокислотных

остатков. Его молекулярный вес составляет примерно 52 кДа. HNF4a был обнаружен у

млекопитающих, земноводных и насекомых; его последовательность чрезвычайно

консервативна. Структура белка HNF4a типична для всех ядерных рецепторов {Рисунок

1). В полипептиде выделяют шесть участков (A-F), содержащих отдельные

функциональные домены. К ним относятся N-концевой трсшс-активационный домен (AF-

1) (участок А/В), ДНК-связывающий домен (участок С), второй трднс-активационный

домен AF-2 (участок D/E), а также функциональный комплекс С-концевого домена

(участок Е) в котором находятся лиганд-связывающий домен и участок, отвечающий за

димеризацшо [Ihara et al, 2003].

В большинстве клеток действие активационных доменов синергично. AF-1,

расположенный в N-концевой части HNF4a, действует в как конститутивный автономный

активатор транскрипции. Второй ятранс-активационный домен устроен несколько

сложнее; он расположен между 128 и 366 аминокислотными остатками (а. о.).

Последовательность между 360 и 366 а. о. высоко консервативна для ядерных рецепторов,

обладающих транскрипционной активностью, и функционально важна для AF-2. Она

называется AF-2 A/D и представляет собой a-спиральный участок. Делеция или мутация

эгого участка приводит к полной потере транскрипционной активности HNF4a. F-домен,

характерный исключительно для HNF4a, снижает активность AF-2 [Dell and Hadzopoulou-

Cladaras, 1999].

Структура гена и изоформы

Ген HNF4a человека расположен на 20-й хромосоме, его длина составляет около 30

т. п. о. Он содержит 10 экзонов и его транскрипция может осуществляться с двух

независимых промоторов, расстояние между которыми составляет около 45 т. п. о.

[Taraviras et al, 1994].

У человека, мыши и крысы обнаружено девять изоформ HNF4a (HNF4al-a9),

образующихся в результате альтернативного сплайсинга и транскрипции с двух

независимых промоторов. Изоформы разделяют на две группы - HNF4al-a6 и HNF4a7-

a9, которые транскрибируются с промоторов Р1 и Р2 соответственно. Первый промотор

инициирует транскрипцию экзона 1 А, кодирующего первый /и>анс-активационный домен

HNF4aP1

AF-1 AF-2

Г* 45 т.п.o. r~*

ш—і к^зюнінінїнінінін^іч^

AF-2

E⁴⁵²

HNF4aP2

HNF4a7 HNF4a8 HNF4a9

Рисунок 1. Схема строении гена HNF4a и изоформ соответствующего белка, образующихся в результате транскрипции гена с двух промоторов (Р1 н 1*2), а также в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Слева указаны названия изоформ, справа - число аминокислотных остатков (а. о.). Буквами А, В, С, D, Е и F обозначены домены белка HNF4a. Под изоформами указан номер остатка, где начинается отдельный домен или происходит вставка последовательности, над изоформами - размер соответствующей вставки. AF-1 и AF-2 — места расположения от/ганс-активационных доменов HNF4a. Сверху указаны изоформы (HNF4al-6, экспрессию генов которых контролирует промотор Р1, снизу - изоформы HNF4a7-9) - промотор Р2. Посередине дана схема расположения промоторов и экзонов в гене HNF4a. Цифрами обозначены номера экзонов, среди которых первый (вариабельный) имеет дополнительное буквенное обозначение 1A-ID.

HNF4a. Второй промотор, Р2, инициирует транскрипцию экзона ID, кодирующего участок домена А/В изоформ а7-9, который лишен /иранс-активационных функций. Таким образом, основное функциональное отличие двух групп изоформ заключено в их транс-активационном потенциале. Изоформы а2 и <х8 отличаются от al и a7 более длинным девятым экзоном и вставкой 10 а. о. в домене F. Изоформы a4-a6 содержат по два дополнительных экзона (1В и 1С) в N-концевой области и также отличаются от остальных по строению F-домена {Рисунок 1) [Nakhei et al, 1998].

Существуют данные о том, что изоформы HNF4a могут димеризоваться между собой, образуя, таким образом, более десятка комбинаций белков с различной транс-активациошюй силой [Sladek et al, 1999 ; Torres-Padilla et al, 2001].

Модуляция транс-активационных функций изоформ

Группы изоформ HNF4a, образующиеся в результате транскрипции с

альтернативных промоторов Р1 и Р2 (далее называемые HNF4aPl и HNF4aP2

соответственно), различаются по N-концевому участку. Изоформы HNF4aPl содержат шранс-активационный домен AF-1, а у изоформы HNF4aP2 он отсутствует. При взаимодействии FINF4aPl с кофакторами транскрипции GRIP-1 (Glucocorticoid Receptor-Interacting Protein 1) и СВР/рЗОО (cAMP-response element-Binding Protein) активность AF-1 может значительно увеличиваться, в то время как трянс-активационные функции HNF4aP2 не изменяются. Несмотря на то, что обе группы изоформ HNF4aPl и HNF4aP2 способны взаимодействовать с GRIP-1, СВР/рЗОО и SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors) через AF-2, синергический эффект от взаимодействия с коактиваторами GRIP-1 и СВР/рЗОО достигается только в случае HNF4aPl. Следует отметить, что и репрессорное действие HNF4aPl при взаимодействии с SMRT сильнее, чем HNF4aP2. Последнее, вероятнее всего, объясняется лучшей способностью HNF4aPl изоформ привлекать деацетилазы к промотору гена-мишени. Существуют указания на то, что домен AF-2 может взаимодействовать как с коактиваторами, так и с корепрессорами, в то время как домен AF-1 связывается исключительно с коактиваторами транскрипции. Таким образом, только HNF4aPl могут реализовать синергичное или антагонистическое действие различных коактиваторов и корепрессоров транскрипции [Torres-Padilla et al, 2002]. Также было показано, что внутри группы HNF4aPl изоформа HNF4a2 сильнее, чем HNF4al, активируется кофакторами СВР, GRIP-1 и SRC-1 [Sladek et al, 1999].

Коактиваторы транскрипции могут играть важную роль в поддержании функциональной активности HNF4a. Существуют данные о том, что в линии гепатомы человека HepG2 ген HNF4a экспрессируется на высоком уровне, однако его транс-

активационные функции в аспекте активации генов-мишеней и, как следствие в поддержании дифференцированного статуса клетки, оказываются супрессированы. Экзогенная экспрессия кофакторов транскрипции SRC-1 и PGC-la усиливает активность респонсивных к HNF4a генов и значительно восстанавливает нормальный гепатоцитарный фенотип клеток [Martinez-Jimenez et al, 2006].

HNF4a может непосредственно взаимодействовать с различными транскрипционными факторами, такими как белки семейства SMAD (Sma-MAD, Mothers Against Decapentaplegic) [Chou et al, 2003] и p53 [Maeda et al, 2006]. Взаимодействие белков SMAD4 и SMAD3 (но не SMAD2) с HNF4a посредством домена AF-1 способствует усилению транс-активирующей способности HNF4a [Chou et al, 2003]. Обратная ситуация наблюдается в случае взаимодействия FfNF4a с р53, который способен репрессировать отрянс-активационные функции HNF4aPl, связываясь с его активационным доменом, а также привлекая деацетилазную активность на промоторы его генов-мишеней [Maeda et al, 2006].

Было показано, что комплекс Smad4-Smad3 способен связываться с HNF4a на промоторе АроСШ и активировать его экспрессию именно за счет усиления трапс-активационной силы HNF4a [Kardassis et al, 2000].

Группы изоформ FINF4a имеют разный спектр генов-мишеней. Так HNF4aP2 эффективнее активирует ранние гепатоцитарные гены, такие как альфа-фетопротеин (АФП), а HNF4aPl - гены дифференцировочных маркеров печени [Лазаревич, 2004]. Таким образом, наличие изоформ с различными активационными свойствами обеспечивает тонкую регуляцию различных групп генов-мишеней на разных стадиях развития организма [Duncan et al, 1997; Hayhurst et al, 2001].

Функции HNF4a

Недавние исследования показали, что в гепатоцитах взрослого человека HNF4a

связывается с промоторными областями 12% проанализированных генов, в то время как вторая РНК-полимераза связывается с 23%, и ни один другой транскрипционный фактор не демонстрировал связывание с более чем 2.5% промоторов [Odom et al, 2004]. Анализ генов-мишеней HNF4a, а также исследования по инактивации HNF4a во взрослом организме указывают на то, что этот фактор регулирует экспрессию генов, отвечающих за синтез сывороточных белков крови и метаболических ферментов, участвующих в обмене углеводов, жиров, стероидов, ксенобиотиков и аминокислот [Hayhurst et al, 2001; Odom et al, 2004]. Кроме этого, под его контролем находятся гены, кодирующие компоненты системы коагуляции крови и протеолиза. HNF4a играет ключевую роль в

функционировании печени и поджелудочной железы, и нарушение его синтеза приводит к серьезным нарушениям метаболизма [Parviz et al, 2003].

Метаболизм

В печени и поджелудочной железе HNF4a регулирует экспрессию многих генов,

участвующих в метаболизме углеводов, жиров, стероидов и ксенобиотиков. Помимо

активации экспрессии генов в результате прямого действия на свои сайты связывания в

промоторных элементах, HNF4a способен взаимодействовать, в частности, с PGC-la —

транскрипционным коактиватором, регулирующим многие процессы энергообмена

клетки, в том числе адаптивный термогенез, митохондриальный биогенез и

глюконеогенез, вызванный голоданием. При образовании такого комплекса HNF4a

индуцирует транскрипцию генов глюкоза-6-фосфатазы и фосфоенолпируват

карбоксилазы — основных ферментов глюконеогенеза [Rhee et al, 2003]. Кроме того,

HNF4a активирует CYP7A1 - катализатор первой ступени синтеза желчных кислот и Ntcp

(Na /Taurocholate cotransporting polypeptide) транспортерный белок органических анионов

- основные медиаторы базолатерального движения желчных кислот по гепатоциту

[Hayhurst et al, 2001]. HNF4a необходим также для экспрессии аполипопротеинов ароАП,

ароСП, ароСШ, а также других переносчиков жирных кислот L-FABP (Fatty acid binding

protein) и МТР (Microsomal triglyceride transfer protein) — важнейших регуляторов обмена

липидов. HNF4a активирует экспрессию транскрипционного фактора PXR, который, в

свою очередь, участвует в регуляции экспрессии гена CYP3A4, кодирующего цитохром Р-

450 ЗА4 [Tirana et al, 2003]. Таким образом, HNF4a косвенно участвует в процессах

гидроксилирования стероидных гормонов и ксенобиотиков [Li et al, 2000]. В Р-клетках

поджелудочной железы HNF4a активирует экспрессию гена инсулина [Bartoov-Shifinan et

al, 2002] и необходим для индуцированной глюкозой секреции этого гормона [Wang et al,

2000].

Клеточная адгезия и морфогенная активность

HNF4a регулирует экспрессию значительного числа генов, отвечающих за

клеточные контакты и адгезию [Battle et al, 2006]. Кроме того, группой авторов было

установлено, что именно присутствие функционально-активного HNF4a способствует

правильной сборке этих белков, что приводит к формированию плотных контактов в

клетках эмбриональной карциномы мыши F9 [Satohisa et al, 2005]. В клетках почек

HNF4a активирует промоторы генов плакофилина, десмоколлина, участвующих в

образовании плотных контактов, и COL21A1 (коллагена XXI типа), компонента

внеклеточного матрикса кровеносных сосудов [Lucas et al, 2005].

Экзогенная экспрессия HNF4a в клетках дедифференцированной гепатомы крысы Н5 приводила к реэкспрессии белка адгезионных контактов Е-кадхерина [Spath and Weiss, 1998]. Было установлено, что в гепатоцитах печени мыши с подавленной активностью HNF4a происходит утрата мембранной локализации Е-кадхерина, Z01 и СЕАСАМ1, а также снижается содержание мРНК коннексинов 26 и 32 - белков щелевых контактов [Parviz е/я/., 2003].

При трансформации фибробластов культуры NIH ЗТЗ ретровирусом, экспрессирующим HNF4a, образовывались колонии клеток с эпителиальной морфологией, в мембранах клеток появлялись Е-кадхерин и белок щелевых контактов ZO-1 [Parviz et al, 2003]. Было выдвинуто предположение, что HNF4a является морфогеном и способен индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход [Spath and Weiss, 1997; Spath and Weiss, 1998; Parviz et al, 2003].

Регуляция клеточного цикла

Существует множество указаний на то, что HNF4a проявляет

антипролиферативные функции. На клетках эмбриональной карциномы мыши F9,

эндотелиоцитах легких крысы и линии гепатомы человека НиН-7 было показано, что

HNF4a индуцирует экспрессию ингибитора циклин-зависимых киназ р21 (но не р15, р16,

р18, р19 или р27), который, в свою очередь, останавливает CDK-2-зависимый переход из

клеточной фазы G1 в S-фазу по р53-независимому пути. В промоторе гена р21 были

найдены сайты связывания HNF4a. [Hwang-Verslues and Sladek, 2008 2008]. Помимо

активации р21, остановка клеточного цикла может происходить за счет индукции еще

одной транскрипционной мишени HNF4a - белка щелевых контактов ZO-1 [Chiba et al,

2005]. Кроме того, вероятной причиной подавления пролиферации опухолевых клеток под

действием HNF4a является активация его генов-мишеней RSK4 (Ribosomal S6 kinase 4) и

РАК5 (р21-activated kinase 5). Белок RSK4 ингибирует сигнальные каскады, поступающие

от ростовых факторов через рецепторные тирозинкиназы. РАК-киназы регулируют

клеточную подвижность посредством стабилизации микротрубочек и дестабилизации

актиновых стресс-фибрилл и фокальных контактов, а также передают сигналы МАР-

киназного каскада [Niehof and Borlak, 2005].

Дифференцировочлый фактор

Помимо прочих функций, HNF4a является ключевым регулятором

дифференцировки гепатоцитов. Он регулирует экспрессию транстиретина, утрата HNF4a

приводит к потере таких гепатоцитарных маркеров, как трансферрип и альбумин [Duncan

et al., 1997]. Сайты связывания с HNF4a найдены и на промоторах других

транскрипционных факторов печени. Так, HNF4a регулирует экспрессию гена HNFla, важнейшего индуктора многих печеньспецифических генов [Kuo et al, 1992]. Таким образом, HNF4a инициирует дифференцировку как при помощи непосредственной активации промоторов генов, так и за счет регуляции через другие транскрипционные факторы.

Диабет

Мутации в гене HNF4a ассоциированы с сахарным диабетом молодых первого типа

(MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young) type I), который передается по механизму

аутосомного доминантного наследования и чаще всего проявляется в раннем возрасте (до

25 лет). Заболевание характеризуется гипергликемией и нарушением глюкозо-зависимой

секреции инсулина, возникающей вследствие дисфункции панкреатических Р-клеток

[Eeckhoute et al, 2003]. Известно восемь различных мутации гена HNF4a, приводящих к

синтезу нефункционального белка [Bartoov-Shifman et al, 2002].

Наиболее часто встречающейся формой диабета молодых является MODY3,

ассоциированная с мутацией на 12 хромосоме человека в гене HNFla. Показано, что

HNFla является непосредственным транскрипционным активатором гена инсулина.

Таким образом, изменения структуры HNFla делают невозможным его активность в

качестве транскрипционного фактора, что и приводит к значительному снижению

секреции инсулина [Yamagata et al, 1996; Frayling et al, 1997]. Вследствие существования

регуляционной петли между HNFla и HNF4a, при функциональных мутациях одного

фактора транскрипционная активность другого также изменяется. Клинические картины,

наблюдаемые при MODY1 и MODY3, схожи.

Гепатокащерогеиез

Более чем у полумиллиона человек ежегодно диагностируется гепатоцеллюлярный

рак, однако механизмы возникновения и развития этого заболевания по-прежнему

остаются малоизученными. Развитие гепатоцеллюлярных карцином определяется как

многостадийный процесс, характеризующийся постепенным изменением спектра

экспрессии тканеспецифических генов, к числу которых относятся гепатоцитарные

ядерные факторы (ГЯФ, см. ниже). Падение экспрессии последних ассоциировано с

прогрессией гепатокарцином и приобретением ими злокачественного фенотипа

[Лазаревич, 2004].

Эксперименты по экзогенной экспрессии HNF4al в клетках линии быстрорастущей

дедифференцированной гепатомы мыши, проведенные в нашей лаборатории, показали,

что восстановление экспрессии этого фактора приводит к реверсии злокачественного

фенотипа. Клетки начинают приобретать эпителиальную морфологию и экспрессировать белки, отвечающие за формирование плотных и щелевых межклеточных контактов. Кроме этого, происходит восстановление экспрессии других печеньспецифических транскрипционных факторов (HNF4a7, HNFla, HNF6, FoxA3), замедление пролиферации in vitro и in vivo, а также подавление способности к метастазированию [Lazarevich et ah, 2004]. Было также показано, что в дифференцированных гепатокарциномах по сравнению с клетками нормальной печени активируется экспрессия HNF4a7, в то время как в дедифференцированных опухолях происходит полное подавление синтеза всех изоформ этого гена. Эти результаты, а также данные, полученные при анализе образцов, полученных при резекции опухолей в РОНЦ РАМН [Флейшман и др., 2008], говорят о том, что индукция альтернативного промотора Р2 маркирует ранние этапы злокачественного перерождения клеток печени и может рассматриваться как потенциальный диагностический маркер гепатоканцерогенеза [Лазаревич и Альперн, 2008].

Специфичность экспрессии и роль HNF4a на отдельных этапах онтогенеза

Ранний эмбриогенез

Мышиные эмбрионы, дефектные по HNF4a, погибают на 10.5 д. э. р. (день

эмбрионального развития) в результате задержки и аномального прохождения

гаструляции [Chen etal, 1994].

Нормальный эмбриогенез у мышей на ранних этапах происходит по следующему сценарию: на 6.5 д. э. р. формируется мезодерма, на 7.5 д. э. р. у эмбрионов уже развита переднее-задняя ось, мезодерма из первичной полоски распространяется по всему эмбриону, формируются хорион, желточный мешок, аллантоис и амнион, а на 8.5 д. э. р. уже различимы нотохорд и сомиты.

Первым нарушением, обнаруживаемым у гомозиготных мутантных по HNF4a эмбрионах, оказывается повышенный уровень апоптоза клеток эктодермы на 6.5 д. э. р. На 8.5 д. э. р. указанные эмбрионы представляют собой небольшие сферы с овальными структурами в дистальной части; эктодерма слегка утолщается для образования эпителиальной трубки; зачатки примитивной мезодермы различимы, однако они не образуют ни одной из нормальных мезодермальных структур; внеэмбриональные ткани сильно редуцированы, обнаруживаются рудименты амниона, хориона и желточного мешка.

Примечательно, что на 7 и 8 д. э. р. клетки эктодермы мутантного эмбриона продолжают гибнуть. Вероятнее всего именно это нарушение и является основной причиной неудачной гаструляции с последующей гибелью всего эмбриона. О том, что мезодерма все же частично формируется, но с суточной задержкой, свидетельствует экспрессия гена Brauchyru (Т) на 7.5 день в небольшом кластере клеток примитивной эктодермы, увеличивающемся к восьмому д. э. р. и образующему рудиментарные остатки нотохорда на 8.5 день. В норме транскрипционная активность этого мезодермального маркера выявляется уже на 6.5 д.э.р. Такая же суточная задержка наблюдается и в экспрессии гена FoxA2. [Chen et al, 1994].

Гибридизацией РНК in situ было показано, что ген HNF4a начинает экспрессироваться в висцеральной энтодерме на 4.5 д. э. p. [Duncan et al, 1994]. Таким образом, можно предположить, что экспрессия HNF4a в этой вне эмбриональной ткани необходима для выживания клеток эмбриональной эктодермы и нормального прохождения гаструляции [Chen et al, 1994].

В развивающемся зародыше экспрессия гена HNF4a наблюдается в зачатке печени и кишечнике через 8.5 дней, а затем в поджелудочной железе и почках к 10 дню эмбрионального развития [Duncan et al, 1994 ; Taraviras et al, 1994].

Во взрослом организме ген HNF4a экспрессируется в печени, желудочно-кишечном тракте, поджелудочной железе и почках [Sladek et al, 1990; Nakhei et al, 1998; Dell and Hadzopoulou-Cladaras, 1999]. На разных этапах онтогенеза и также в отдельных органах наблюдается экспрессия различных изоформ HNF4a. На 12.5 день эмбрионального развития в печени мышей соотношение изоформ а7 и al, последняя из которых обладает большей /яранс-активационной способностью, составляет приблизительно 1 к 10. Однако непосредственно перед рождением содержание HNF4a7 снижается, а через 45 дней после рождения становится не детектируемым, в то время как количество HNF4al резко увеличивается, достигая к 45 дню после рождения десятикратного увеличения по сравнению 12.5 днем эмбрионального развития [Kyrmizi et al, 2006]. В поджелудочной железе и желудке доминирующей остается изоформа HNF4a7 [Briancone/a/.,2004].

Инактивация гена HNF4a летальна для эмбриона мыши. Через 7.5 дней эмбрионального развития у мышей наблюдается нарушение развития висцеральной (внеэмбриональной) энтодермы, что приводит к аномальной гаструляции и гибели мышей на 10.5 день [Chen et al, 1994; Duncan et al, 1997]. Однако показано, что добавление к HNF4a ^_/" диплоидным эмбрионам мыши тетраплоидных тканей висцеральной эндодермы от нормальных эмбрионов способствует их развитию из диплоидных клеток и позволяет

осуществить гаструляцию на средних этапах развития [Duncan et al, 1997]. Результаты указанных экспериментов позволили более детально изучить роль HNF4a в эмбриогенезе. Было показано, что дифференцировка клеток вентральной энтодермы в сторону предшественников гепатоцитов происходит без участия HNF4a. Он также не оказывает влияния на морфологию эмбриональной печени, образованную гепатобластами. Однако он необходим для дифференцировки гепатоцитов из гепатобластов, обусловленной индукцией экспрессией генов, совокупный эффект которых определяет дифференцированный фенотип клеток печени. В числе генов, чья экспрессия репрессирована в эмбриональной печени HNF4a мышей, гены аполипопротеинов apoAl, ароАП, ароВ, ароСШ, ароСП, а также альдолаза В, фетшаланин гидролаза (РАН, phenylalanine hydroxylase), L-FABP, трансферрин (TFN), ретинол-связывающий белок (RBP), и эритропоэтш (Еро). Кроме этого, инактивация HNF4a приводит к снижению экспрессии транскрипционных факторов HNFla и PXR (Preganane-X receptor). Спектр экспрессии других печеньспецифических транскрипционных факторов (включая HNF1B, HNF6, FoxA, С/ЕВР и др.) остался неизменным [Li et al, 2000]. Таким образом, экспрессия HNF4a не критична для формирования зачатка эмбриональной печени, однако необходима для начала дифференцировки гепатобластов в гепатоциты и поддержания функционального состояния последних во взрослом организме.

Поздний эмбриогенез и взрослый организм

Эксперименты, направленные на выявление функции HNF4a на этапах развития,

следующих за гаструляцией, подтвердили данные, полученные ранее. Для создания

кондиционного нокаута гена HNF4a скрещивали мышей, у которых второй экзон этого

гена фланкирован сайтами LoxP, с мышами, экспрессирующими ген рекомбиназы Сге в

клетках эмбриональной печени под контролем промотора гена альбумина и энхансера

АФП. На 15-й день эмбрионального развития у потомков таких мышей HNF4a не

выявляется. Клетки печени HNF4a '' мышей не имеют характерной полигональной формы

и полярностью и не образуют тканевых структур, свойственных печени. Значительно

снижается экспрессия целого ряда генов, которые отвечают за функционирование

дифференцированных гепатоцитов. В их числе гены, кодирующие транспортные белки

крови, аполипопротеины и метаболические ферменты, транскрипционные факторы

HNFla и PXR, а таюке группа генов, отвечающих за формирование межклеточных

контактов (Е-кадхерин, коннексины, ZO-1 и другие) [Parviz et al, 2003; Battle et al, 2006].

Таким образом, на средних этапах эмбрионального развития (10 - 14 д. э. р.) фактор

HNF4a необходим для дифференцировки гепатоцитов и поддержания их функциональной

активности, а также для того, чтобы клетки печеночной паренхимы приобрели морфологию эпителиальных и сформировали нормальную архитектуру печени.

Ранее для инактивации гена HNF4a в печени взрослых мышей была использована система Cre-loxP [Hayhurst et al, 2001]. В гепатоцитах таких мышей серьезно нарушен липидный обмен, что выражается в значительном накоплении внутриклеточных жиров и в снижении уровня сывороточного холестерина и триглицеридов. Кроме того, содержание желчных кислот в сыворотке крови повышается вследствие снижения уровня экспрессии генов многочисленных белков, участвующих в транспорте жирных кислот, таких как ароВ, ароСП, ароСШ и белок, связывающий жирные кислоты L-FABP [Hayhurst et al, 2001]. Эти результаты согласуются с данными по анализу спектра экспрессии генов в печени HNF4a "^А эмбрионов мыши на 12 день развития [Li et al, 2000]. Следовательно, можно говорить о группе функциональных генов печени, активность которых регулируется фактором HNF4a на ранних стадиях развития эмбриона и поддерживается во взрослом состоянии.

Существуют также и гены, экспрессия которых регулируется HNF4a только в процессе эмбрионального развития. К ним относятся гены ApoAI и PXR [Li et al, 2000; Катіуа et al, 2003]. Изменение спектра генов-мишеней в процессе развития характерно для ГЯФ, в частности - для HNFla и FoxA [Лазаревич и Флейшман, 2008].

ГЯФ образуют внутри клетки сложные каскады регуляторных взаимодействий, которые обеспечивают координацию взаимной экспрессии генов, а также транскрипции других респонсивных генов. В ходе развития организма происходит постепенное изменение набора факторов, связывающихся с теми или иными промоторами, и усложнение регуляционной иерархии. Сравнение последствий инактивации HNF4a на стадиях эмбрионального развития, приводящих к нарушению синтеза большинства других ГЯФ, с результатами инактивации во взрослом организме подтверждает тот факт, что стабильность системы возрастает при увеличении ее сложности.

Сравнение функциональных особенностей изоформ белка FINF4a показало, что мыши, на всем протяжении развития которых синтезируется только ос7-изоформа, сградают нелетальным нарушением жирового и глюкозного обмена, а также нарушением процесса детоксикации. Эти изменения происходят вследствие нарушения экспрессии ряда генов, участвующих в метаболизме жирных кислот, и транскрипционного фактора CAR, регулирующего экспрессию гена CYP3A4, кодирующего одну из форм цитохрома Р-450 [Tirona et al., 2003]. У мышей, в клетках тканей которых синтезируется только HNF4al, не было обнаружено существенных изменений в функции поджелудочной железы. Таким образом, можно сделать вывод, что изоформы HNF4a являются в

значительной степени взаимозаменяемыми, а экспрессия гена HNF4al может целиком компенсировать отсутствие фактора HNF4a7 [Briancon and Weiss, 2006].

Анализ спектра экспрессии генов в Р-клетках поджелудочной железы мышей, нокаутированных по гену HNF4a, показал, что этот фактор вовлечен в регуляцию генов, участвующих в контроле пролиферации. HNF4a необходим для активации сигнального пути Ras/ERK и для репликации р-клеток. Таким образом, он способствует увеличению их количества в случае возникновения потребности в дополнительном синтезе инсулина [Gupta et ah, 2007]. Помимо р-клеток, экспрессия гена HNF4a обнаруживается в других типах экзокринных клеток, а также в протоковых клетках взрослой поджелудочной железы. Кроме того, исследования на мышиных эмбрионах с инактивированным геном HNF4a в эпителиальных клетках прямой кишки показали, что экспрессия гена HNF4a критична для дифференцировки бокаловидных клеток прямой кишки и нормального функционирования этого органа [Garrison et ah, 2006].

Подводя итог, можно заключить, в эмбриогенезе HNF4a не является ключевым фактором для формирования зачатка печени, но его экспрессия необходима для дифференцировки гепатоцитов и эпителиального морфогенеза. Во взрослой печени этот фактор регулирует экспрессию широкого спектра гепатоспецифических генов, вовлеченных в разнообразные метаболические каскады. В Р-клетках поджелудочной железы HNF4a регулирует экспрессию генов, участвующих в контроле пролиферации, метаболизме глюкозы и секреции инсулина. HNF4a участвует в контроле пролиферации и поддержании эпителиальной морфологии и в дифференцировке других типов клеток, а именно бокаловидных клеток и энтероцитов кишечника, а также эпителиальных клеток почки.

Регуляция экспрессии гена HNF4a

Анализ спектра экспрессии различных гепатоцитарных ядерных факторов при

гепатоканцерогенезе показал, что полное снижение активности ГЯФ ассоциировано с опухолевой прогрессией. Кроме того, экзогенная экспрессия HNF4a в клетках дедифференцированной гепатомы приводит к частичному восстановлению печеночных функций и экспрессии гепатоспецифических генов [Lazarevich et ah, 2004]. Из этих наблюдений можно сделать целый ряд выводов. В частности, не подлежит сомнению роль HNF4a, как центрального регулятора сети ГЯФ. Кроме этого, существуют указания, что в опухолях инактивация этого фактора носит обратимый характер, то есть его репрессия осуществляется на транскрипционном уровне. Таким образом, исследование механизмов

регуляции экспрессии гена HNF4a имеет важное значение для выявления причин его репрессии в процессе гепатоканцерогенеза.

Ген HNF4a экспрессируется с двух независимых промоторов, в результате активности которых может образоваться девять сплайс-форм мРНК этого белка (см. выше). В клетках эмбриональной печени транскрипция гена HNF4a осуществляется преимущественно с промотора Р2 {Рисунок 1), в результате чего образуются изоформы HNF4a7-a9, называемые «эмбриональными». Активация промотора Р1 приводит к синтезу «взрослых» изоформ HNF4al-a6, которые преобладают в печени взрослого организма. «Эмбриональные» изоформы отличаются тем, что их N-концевая последовательность укорочена и лишена /я/гакс-активационного домена, который присутствует у «взрослых» изоформ [Nakhei et al, 1998].

Помимо паренхимы печени, HNF4a экспрессируется и в других тканях. Активность промотора Р1 наблюдается в холангиоцитах печени, проксимальных почечных канальцах, эпителиоцитах слизистой оболочки тонкой и толстой кишки и выводящего канала придатка семенника [Tanaka et al, 2006]. Транскрипцию с промотора Р2 выявляли в клетках желчных каналов, слизистой тонкого и толстого кишечника, желудка, в экзо- и эндокринных клетках поджелудочной железы [Tanaka et al, 2006]. Анализ активности промоторов в различных опухолях показал, что в гепатокарциномах одновременно с подавлением Р1 может происходить активация Р2. При раке прямой кишки детектируют активность обоих промоторов. Транскрипция с обоих промоторов HNF4a наблюдается в ряде органов пищеварительного тракта, а также в опухолях, происходящих из этих органов. Для рака легкого, щитовидной железы, груди, яичников, эндометрия и простаты активации ни одного из промоторов HNF4a не показано [Тапака et al, 2006].

Регуляция активности промотора Р1

Промотор Р1 не содержит таких консервативных последовательностей,

свойственных промоторным элементам, как ТАТА-бокс или ССААТ-бокс. Анализ

структуры хроматина и поиск сайтов, гиперчувствительных к ДНКазеІ, в области

промотора Р1 позволил определить наличие двух основных регуляторных элементов этого

промотора. Во-первых, был определен участок -98 /-68 п. о., достаточный для активации

транскрипции, который, как оказалось, содержит сайт связывания HNFla. Во-вторых, был

картирован энхансерный элемент в районе -5.5 /-6.5 т. п. о от точки начала транскрипции.

Следует отметить, что указанные участки проявляли гиперчувствительность к ДНКазеІ

только в тех тканях, которые экспрессировали HNF4a. Это позволило предположить, что

именно в этих районах расположены основные элементы связывания с

транскрипционными факторами [Zhong etal, 1994].

Регуляторные элементы промотора Р1 содержат сайты связывания многих ядерных факторов: HNF1, FoxA, HNF6, а также раннего энтодермального фактора GATA6. По-видимому, активация транскрипции гена HNF4al в разных системах происходит с участием различных транс-активаторов. В процессе эмбриогенеза ген HNF4al активируется за счет синергичного действия HNFip и GATA6, в то время как во взрослом состоянии основная роль в /ирш/с-активации Р1 отводится HNFla и HNF6, а ядерный рецептор COUP-TFI подавляет его транскрипцию. Подтверждением этому может служит тот факт, что в организме новорожденных мышей HNFla замещает HNFip на промоторе HNF4al [Kyrmizi et ah, 2006]. Возможно, HNF4al осуществляет негативную регуляцию экспрессии HNFip и GATA6, которая происходит при достижении белком HNF4al определенной критической концентрации в клетке [Hatzis and Talianidis, 2001].

Несмотря на высокую степень гомологии промоторных последовательностей гена HNF4a мыши и человека, Р1 промотор последнего содержит по сравнению с промотором мыши два дополнительных функциональных z/uc-элемента. Первый представляет собой сайт связывания для Sp-І, а второй — мотив DR-1, общий для связывания ядерных рецепторов гормонов. С DR-1 могут связываться HNF4a, COUP-TF и рецепторы ретиноевой кислоты RXRa-RARa [Hatzis and Talianidis, 2001].

Помимо проксимального промоторного элемента, регуляция активности Р1 осуществляется дистальным энхансером. Анализ активности репортерного гена под контролем последовательностей, содержащих фрагменты регуляторного района HNF4al различной длины, показал, что в районе около -6 т. п. о. от точки инициации транскрипции имеется энхансерный элемент длиной 700 п. о. Энхансер содержит сайты связывания факторов семейств HNF1, FoxA, HNF4, С/ЕВР, а также гормон-связывающие элементы, которые способны модулировать базальный уровень транскрипции минимального промотора гена HNF4al [ВаШу et ah, 2001]. Энхансерная последовательность, как и последовательность проксимального промотора, является высоко консервативной и на 86% гомологична последовательности энхансерного элемента человека.

Во взаимодействии энхансера с промотором участвуют факторы СВР/р300 и Swi/Snf, что повышает эффективность транскрипции. Важную роль в активации экспрессии гена HNF4al играет С/ЕВРа, мутации в сайте связывания которого приводят к уменьшению энхансерной активности. При активации МАР-киназного каскада наблюдается понижение уровня экспрессии гена С/ЕВРа, следствием чего является понижение уровня экспрессии гена IINF4a. Белок С/ЕВРа выполняет ключевую роль в .

стабилизации комплекса энхансера с промотором, в привлечении РНК-полимеразы II и активации экспрессии HNF4a [Hatzis et al, 2006].

Имеются данные о возможности негативной авторегуляции гена HNF4al, по крайней мере в некоторых экспериментальных системах [Magenheim et al, 2005]. Также показано, что онкосупрессор р53 способен не только репрессировать активность HNF4a в результате белок-белкового взаимодействия, но и снижать уровень экспрессии соответствующего гена посредством сложного механизма, включающего в себя взаимодействие с белком-активатором HNF6 и привлечение деацетилазной активности на промотор PI [Maeda et al, 2006].

В последнее время появилось много данных, свидетельствующих о регуляции экспрессии гена HNF4a и ряда других ГЯФ различными внеклеточными сигналами. Значительную роль в регуляции уровня дифференцировки отводят клеточному микроокружению, которое определяется положением клетки относительно кровеносных сосудов и других элементов архитектуры органа, а также действием ростовых факторов, взаимодействием с соседними клетками, в том числе клетками других типов, контактами с внеклеточным матриксом. Отсутствие большинства этих факторов в культуре клеток приводит к тому, что утрачиваются такие важные аспекты дифференцировки, как специфическая клеточная морфология и полярность [Abelev and Lazarevich, 2006]. При переводе гепатоцитов в культуру экспрессия гена HNF4al уменьшается, однако может восстанавливаться при культивировании клеток в трехмерном матриксе. Многочисленные данные позволяют предположить, что HNF4a является центральным фактором, определяющим регуляцию активности сети ГЯФ в зависимости от элементов микроокружения, факторов роста и цитокинов [Лазаревич и Флейшман, 2008]. Так, например, трансформирующий фактор роста, TGFp, играющий важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки эпителиальных тканей, регулирует экспрессию гена HNF4a через активацию транскрипционных факторов SMAD3, SMAD4 и Snail [Chou et al, 2003; Cicchini et al, 2006]. На нескольких модельных системах показано TGFp-зависимое подавление экспрессии гена HNF4al, ассоциированное с гиперэкспрессией гена транскрипционного репрессора Snail, который способен непосредственно связываться с промотором PI [Cicchini et al, 2006]. В других исследованиях подавление синтеза HNF4al при воздействии TGFp связывают с активацией транскрипционного фактора WT1 [Berasain et al, 2003].

Регуляция активности промотора Р2

Экспрессия гена HNF4a с дистального промотора Р2 активируется гомеобоксными

белками HNFla, HNFip, HNF6 и Pdxl - регулятором дифференцировки панкреатических

р-клеток [Thomas et al., 2001; Briancon et al, 2004]. В отличие от печени, в поджелудочной железе взрослого организма наиболее представленными оказываются именно FfNF4aP2 изоформы.

HNF4al может индуцировать транскрипционную репрессию промотора Р2. Иммунопреципитация хроматина показала, что HNF4a способен связываться с Р2 в гепатоцитах и Р-клетках поджелудочной железы [Odom et al, 2004]. Гиперэкспрессия гена HNF4al в клетках линии ММН (иммортализованные гепатоциты мыши из эмбриональной печени), синтезирующих HNF4a7, приводит к значительному снижению активности репортерного гена, находящегося под контролем промотора Р2. Возможно, HNF4al-зависимая репрессия альтернативного промотора происходит тогда, когда превышается пороговый уровень этого белка. Накопление HNF4al в клетке после рождения, а также возможное проявление его репрессорной активности при связывании с промотором Р2, которое может подавлять активирующее действие факторов HNFla и HNF6, является вероятным объяснением того факта, что уровень HNF4al выше уровня HNF4a7 в зрелых гепатоцитах. С этим согласуются данные о структурной активности регуляторных элементов гена HNF4a7 во взрослой печени [Briancon et al, 2004]. Пока нет сведений о том, зависит ли HNF4al-индуцируемая репрессия промотора Р2 от его транс-активационных функций.

Факторы, участвующие в регуляции экспрессии HNF4a

Как уже говорилось выше, активность HNF4a в основном регулируется на транскрипционном уровне. Существует довольно большое число факторов, которые регулируют экспрессию этого гена. Их можно разделить на две группы. Во-первых, это тканеспецифические транскрипционные регуляторы, к которым относятся многочисленные гепатоцитарные ядерные факторы, в том числе сам HNF4a. Вторую группу образуют общераспространенный факторы транскрипции, являющиеся эффекторами внутриклеточных сигнальных каскадов (TGFP, МАР-киназы, р53).

Печеньспецифические факторы транскрипции

Помимо HNF4a существует еще несколько семейств неродственных гепатоцитарных

ядерных факторов. К ним относятся HNF1, С/ЕВР, FoxA (HNF3) и HNF6 (Onecut). Они образуют внутри клеток печени общую регуляторную сеть. Между ГЯФ существуют

иерархические взаимосвязи, которые претерпевают значительные изменения в процессе онтогенеза [Kyrmizi et al, 2006].

Совокупная активность сети ГЯФ, тонко контролируемая как в эмбриогенезе, так и при нормальном функционировании или патологических состояниях во взрослой печени, определяет тканеспецифический транскрипционный профиль гепатоцитов, основного функционального типа клеток печени. Промоторы HNF4a содержат сайты связывания большого числа транскрипционных факторов, среди них есть сайты связывания для всех известных ГЯФ.

Кроме ГЯФ, заметную роль в регуляции экспрессии печеночных генов, особенно на ранних стадиях онтогенеза, могут играть ранние энтодермальные факторы семейства GATA и ядерные рецепторы FTF и COUP-TF. Ниже мы подробно рассмотрим наиболее важные факторы, участвующие в развитии печени.

HNF1

К этому семейству относятся два белка - HNFla и HNFip. По структуре ДНК-

связывающего домена эти белки относят к суперсемейству гомеобелков. Сайты

связывания этих факторов выявлены в большинстве гепатоспецифических генов и обычно

располагаются в проксимальных промоторных регионах. Делеция этих участков заметно

снижает уровень экспрессии соответствующего гена [Song et al, 1998; Li et al, 2000].

Функции этих белков разнесены во времени: HNFip играет важную роль в

дифференцировке висцеральной энтодермы и формировании печени, почек и

поджелудочной железы в эмбриогенезе, а HNFla необходим для поддержания

дифференцированного состояния этих органов на постнатальном этапе развития

[Лазаревич, 2004]. Белки этого семейства кодируются разными генами, но имеют схожие

ДНК-связывающие домены, и по структуре этих доменов относятся к суперсемейству

гомеобелков [Mendel et al, 1991].

Гены-мишени HNF1 кодируют белки, участвующие в образовании межклеточных контактов, метаболизме липидов, глюкозы, аминокислот, транспорте органических анионов. У мышей, нокаутных по гену HNFla, происходит нормальное развитие печени, однако снижена экспрессия многих печеночных генов и выявляется дисфункция почек и поджелудочной железы. Мыши погибают от почечной недостаточности, у них также нарушена секреция инсулина Р-клетками поджелудочной железы [Pontoglio et al, 1998]. Отсутствие HNFip летально для эмбриона [Coffinier et al, 1999].

Было показано, что в р-клетках поджелудочной железы HNFla и Pdxl активируют Р2 промотор HNF4a. Эти данные согласуются с тем фактом, что нарушение экспрессии HNF4a, вызванное в частности мутациями в промоторе Р2, так же как и нарушения

функции HNFla, ассоциированы с инсулиновой недостаточностью и, как следствие, диабетом молодых (MODY) (подробнее про диабет см. выше) [Hansen et al, 2002]. Однако ранее были получены многочисленные свидетельства того, что HNF4a способен активировать экспрессию HNFla, связываясь со своим респонсивным элементом в его промоторе [Tian and Schibler, 1991 ; Kuo et al, 1992]. Кроме того, HNF4a индуцирует транскрипцию HNFla в клетках гепатомы крысы Н5, в которой экспрессия именно этих двух генов напрямую коррелирует с дифференцировочным статусом [Kuo et al, 1992; Bulla and Fournier, 1994 ; Spath and Weiss, 1997].

Таким образом, можно говорить о наличие регуляторной петли между факторами HNF4a и HNFla, свойственной многим транскрипционным факторам, которая.позволяет осуществлять тонкую регуляцию экспрессии генов, обуславливающих функционирование конкретного типа клеток.

С/ЕВР '

Транскрипционные факторы этого семейства содержат ДНК-связывающий домен

bZIP типа, N-концевой mpawc-активационный доменом и спиральную структуру типа

«лейциновой застежки», обеспечивающую димеризацию. Белки С/ЕВР (CCAAT/Enhancer-

Binding Protein) имеют сходную структуру и могут образовывать гомо- и гетеродимеры,

связываясь с общей последовательностью ДНК. В печени экспрессируются С/ЕВРа,

С/ЕВРР и С/ЕВР5 [Takiguchi, 1998].

Белок С/ЕВРР и доминантно-негативный ингибитор транскрипции LIP кодируются одним геном. Их соотношение в клетке регулируется на уровне трансляции, а также за счет С/ЕВРа-зависимого протеолитического расщепления С/ЕВРр. Гетеродимеры белков семейства С/ЕВР с белком LIP, у которого отсутствует N-концевой /ттраноактивационный домен, подавляют транскрипцию генов-мишеней. Уровни экспрессии С/ЕВРа и Р связаны с пролиферативным статусом клетки. В норме их соотношение поддерживается на постоянном уровне, однако при повреждении печени, сопровождающемся регенерацией, уровень С/ЕВРа падает, а уровень С/ЕВР Р заметно возрастает, при этом общее количество С/ЕВР остается неизменным [Rana et al., 1995]. Инактивация С/ЕВРР приводит к значительному снижению скорости пролиферации гепатоцитов, а у С/ЕВРа"" мышей наблюдается гиперплазия печени. По-видимому, С/ЕВРа (но не С/ЕВРР) способен связывать Rb-подобные факторы, препятствуя образованию их комплекса с E2F, необходимого для перехода клеток в S-фазу [Timchenko et al., 1999].

С/ЕВРр является важным переключателем процессов, связанных с контролем пролиферации и поддержанием дифференцировки. В частности, С/ЕВРр способен индуцировать транс-дифференцировку клеток поджелудочной железы в гепатоциты.

Экзогенная экспрессия С/ЕВРР в панкреатических клетках линии AR42J-B13 приводит к снижению уровня амилазы, специфического маркера экзокринных клеток поджелудочной железы, транслокации HNF4a в ядро и активации экспрессии ряда печеньспецифических генов [Shen et al, 2000]. В то же время Pdxl-независимое подавление экспрессии С/ЕВРР недостаточно для индукции панкреатической дифференцировки из клеток печени [Meivar-Levy et al, 2007]. Этот пример демонстрирует, что программа дифференцировки эпителиальных клеток может получить иное направление в результате изменения внутриклеточного соотношения всего лишь нескольких транскрипционных регуляторов.

FoxA (HNF3)

Белки семейства FoxA содержат ДНК-связывающий домен типа «крылатая спираль»

(winged helix). По третичной структуре этот домен у белков FoxA имеет большое

структурное сходство с ДНК-пакующими гистонами HI и Н5. Это позволяет

предположить, что факторы FoxA не только непосредственно влияют на экспрессию генов

путем связывания со специфическими сайтами ДНК, но и участвуют в изменении

нуклеосомной организации хроматина, делая его доступным для других трапс-

активаторов [Zaret, 1994].

К семейству FoxA принадлежат белки FoxAl, FoxA2 и Fox A3, которые узнают одинаковые последовательности ДНК, взаимодействуя с ними в виде мономеров. В эмбриогенезе первым, на 6.5 день развития появляется FoxA2, затем начинают экспрессироваться FoxAl и FoxA3 [Ang et al, 1993]. Инактивация FoxAl существенно снижает скорость роста мышей после рождения и вызывает их гибель из-за нарушения гомеостаза глюкозы [Kaestner et al, 1999]. Вероятно, FoxAl является слабым активатором транскрипции, конкурирующим с FoxA2 за общие сайты связывания. Мыши с инактивированным FoxA3 не имеют видимых нарушений, но отличаются от нормальных измененным уровнем транскрипции некоторых гепатоспецифических генов [Kaestner et al, 1998].

Мышиные эмбрионы FoxA2"^/_ погибают на девятые сутки эмбрионального развития за счет нарушения образования кишечной трубки и отделения зародыша от желточного мешка [Ang and Rossant, 1994]. Кондиционная инактивация FoxA2 во взрослой печени не влияет на уровни экспрессии других ГЯФ и гепатоспецифических генов [Sund et al, 2000], что указывает на существенное различие регуляторных взаимодействий между транскрипционными факторами в эмбриональной и взрослой печени.

HNF6 (Onecut)

HNF6 стал первым охарактеризованным представителем нового класса

транскрипционных регуляторов ONECUT, содержащих гомеобокс и ДНК-связывающий

домен типа CUT. Белок HNF6 может взаимодействовать в виде мономера с сайтами

связывания FoxA в промоторах некоторых гепатоспецифических генов.

HNF6 появляется на девятый день развития мышиного эмбриона в зачатке печени и в нервной системе [Landry et al, 1997]. Во взрослом организме он экспрессируется в поджелудочной железе, селезенке, мозге, семенниках и печени. Инактивация HNF6 нарушает дифференцировку экзокринных клеток поджелудочной железы и приводит к развитию диабета. Кроме того, у таких животных не образуется желчный пузырь и нарушено образование желчных протоков [Clotman et al, 2003]. К настоящему времени HNF6 представляется наиболее вероятным регулятором дифференцировки гепатобластов в холангиоциты, образующие желчные протоки. Показано, что он регулирует экспрессию HNF1J3 в этих клетках.

HNF6 играет ключевую роль в формировании панкреатических предшественников в эмбриогенезе за счет инициации экспрессии панкреатического и дуоденального гомеобокса 1 (Pdxl), самого раннего маркера панкреатических клеток-предшественниц. Оказалось, что экспрессия HNF6 в эмбриональной энтодерме зависит от активности интронного энхансера. Этот энхансер содержит функциональные сайты связывания для представителей семейства HNF1. Примечательно, что HNFlp появляется в энтодерме раньше HNF6, и это появление является необходимым условием активации HNF6. Таким образом, можно предположить, что именно последовательная индукция HNF1(3-HNF6-Pdxl лежит в основе нормальной дифференцировке клеток поджелудочной железы [van Poll etal, 2006].

Транскрипционный фактор FTF (fetoprotein transcription factor) был

идентифицирован как ядерный рецептор, участвующий в активации гена АФП в

эмбриональной печени [Bernier et al, 1993]. В отличие от классических ядерных

рецепторов, FTF связывается с ДНК в виде мономера и не нулсдается в лиганде. Факт

наличия функциональных сайтов связывания FTF в промоторах FoxA2, HNF4a и HNFla

[Galarneau et al, 1996] позволяет рассматривать этот фактор не только как специфический

активатор промотора гена АФП, но и как одно из важных звеньев в пути передачи

сигналов дифференцировки энтодермы и регуляции экспрессии генов, определяющих

гепатоцитарпый фенотип. Вероятно, FTF занимает промежуточное положение между

ранними маркерами энтодермы (GATA) и транскрипционными факторами,

определяющими формирование печени (HNF4a, HNFla и FoxA2). При этом влияние FTF на вторую группу генов ограничивается ранними стадиями развития - в зрелых неделящихся гепатоцитах с сайтами связывания FTF взаимодействуют другие ядерные рецепторы [Pare et al, 2001]. По-видимому, FTF критичен лишь на ранних этапах дифференцировки печени.

COUP-TF

Факторы семейства COUP-TF (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription

factors) относятся к суперсемейству ядерных рецепторов, лиганд этих факторов не

идентифицирован. Димеры белков COUP-TFI и COUP-TFII узнают прямые повторы DR1,

с которыми связываются многие типы ядерных рецепторов, в том числе HNF4a [Sladek et

al, 1990]. В гепатоцитах COUP-TF чаще всего выполняют функцию негативных

регуляторов транскрипции, действуя как антагонисты HNF4a [Ladias and Karathanasis,

1991]. Как и другие рецепторы, не имеющие лиганда, факторы COUP-TF

взаимодействуют с корепрессорами.

GATA

Факторы этого семейства получили свое название благодаря обязательному

наличию последовательности GATA в сайте связывания ДНК. ДНК-связывающий домен

белков семейства высоко консервативен и относится к типу «цинковых пальцев» [Morrisey

et al, 1998]. Описано два подсемейства, каждое из которых представлено тремя

представителями: GATA1, GATA2, GATA3, и GATA4, GATA5, GATA6. В

дифференцировке печени участвуют преимущественно GATA4 и GATA6. Белки этого

семейства являются самыми ранними маркерами энтодермы.

Мыши, дефектные по GATA6, погибают на 6.5 д. э. р. вследствие нарушения

формирования висцеральной энтодермы. В таких эмбрионах подавлена экспрессия

HNF4a, HNFla, FoxA2, GATA4 и АФП.

Нетканеспецифические аспекты регуляции активности HNF4a

Влияние нетканеспецифических регуляторных путей на процессы пролиферации и дифференцировки клеток печени изучено недостаточно. По нашему мнению, основным кандидатом на роль связующего звена между сетью гепатоцитарньк ядерных факторов и нетканеспецифических внутриклеточных сигнальных каскадов является HNF4a, который не только контролирует гепатоспецифическую экспрессию генов, но и определяет

эпителиальную морфологию, а также регулирует процесс клеточной пролиферации [Spath and Weiss, 1998].

Существуют данные о способности HNF4a активировать промотор гена р21, ингибитора циклин-зависимых киназ, в клетках эмбриональной карциномы мыши F9. Следствием этой р53-независимой активации является остановка клеточного цикла. Аналогичные результаты получены на клетках крысиного легочного эндотелия. Эти данные еще раз указывают на участие HNF4a в регуляции процессов пролиферации и эпителиального морфогенеза [Chiba et al, 2004].

В литературе была описана способность белка-онкосупрессора р53 подавлять транскрипционную активность HNF4aPl в некоторых клеточных линиях, в том числе в клетках дифференцированной гепатомы HepG2. Взаимодействуя с лиганд-связывающим доменом HNF4aPl, р53 восстанавливает его гистон деацетилазную активность [Maeda et al, 2002].

Глюкокортикоиды участвуют в запуске финальной стадии дифференцировки гепатоцитов после рождения [Montoliu et al, 1995]. Как следствие этого было показано, что глюкокортикоидный гормон влияет на соотношение между количеством белков HNF4al и HNF4a7 [Nakhei et al, 1998].

Внеклеточный матрикс (ВКМ) может оказывать серьезное влияние на экспрессию гепатоспецифических генов в культуре клеток. Было продемонстрировано, что экспрессия генов HNF4a, С/ЕВРа, С/ЕВРВ, apoAI и альбумина значительно снижена при росте нормальных мышиных гепатоцитов на чашках, покрытых коллагеном, по сравнению с теми, на которые нанесен ламинин-богатый гель, образованный клетками EHS-саркомы. В этом геле клетки приобретают сферическую форму, в то время как на чашках с коллагеном они образуют плоский монослой. Известно, что глюкокортикоидные гормоны стимулируют прикрепление клеток к пластику [Tanaka et al, 1978]. Однако индукция экспрессии печеньспецифических генов дексаметазоном наблюдалась исключительно в культуре клеток, растущих на коллагене [Oda et al, 1995].

Есть основания утверждать, что именно HNF4a определяет изменение экспрессии печеньспецифических генов при нарушении клеточных контактов с ВКМ [Battle et al, 2006].

Опухолевый супрессор р53

Мультифункциональный онкосупрессорный белок р53 является одним из важнейших регуляторов клеточного цикла. Этот белок играет ключевую роль в

сохранении целостности генетического материала клетки. Активация р53, происходящая в ответ на различные стимулы, ассоциированные с повреждением ДНК, может приводить к аресту клеточного цикла, инициируя процесс репарации ДНК, или, в случае невозможности последнего, к апоптозу клеток. Отсутствие р53 приводит к накоплению мутаций, вызванных нарушением контроля репликации. В 50% опухолей человека обнаруживаются мутации в гене р53, обуславливающие его функциональную инактивацию (Almog and Rotter, 1997).

Являясь мощным ингибитором клеточного роста, р53 обладает сложной многокомпонентной системой регуляции. Центральное место в ней принадлежит белку MDM2, лигазе, связывающейся с р53 для последующего убиквитинилирования и протеасомной деградации. В свою очередь сам белок MDM2 является транскрипционной мишенью р53. Таким образом, создается негативная регуляторная петля, в которой р53 активирует экспрессию MDM2, поддерживающего низкий уровень р53 в процессе нормального клеточного роста и развития. При возникновении неблагоприятной ситуации, такой как повреждение ДНК, гипоксия, активация онкогена, происходит фосфорилирование р53, препятствующее его связыванию с MDM2, в результате чего р53 стабилизируется и накапливается в ядре. Некоторые онкогены способны инактивировать ARF, белок, связывающийся с MDM2 и ингибирующий убиквитинилирование р53. Потеря ARF вызывает быстрое накопление мутаций и приводит к опухолевой трансформации [Vousden, 2000].

р53-зависимая остановка клеточного цикла и индукция апоптоза связаны с транс-активационными функциями онкосупрессора. Было продемонстрировано, что замена нормального р53 на его мутантный транскрипционно неактивный вариант в эмбриональных тимоцитах мыши приводит к потере способности индуцировать апоптоз и останавливать клеточный цикл [Chao et al, 2000]. В случае необходимости активации апоптотического сигнального пути происходит р53-зависимая активация транскрипции проапоптотических генов Вах, Noxa др. [Vousden, 2000]. Ірянс-активация белка p2jWAFi/ciPi _ингибитора циклин-зависимых киназ является важным этапом р53 опосредованной остановки клеточного цикла.

Существуют многочисленные указания на действие р53 в качестве репрессора транскрипции генов-мишеней, однако репрессорныи механизм во многих случаях остается до конца не выясненным [Но and Benchimol, 2003 ; Mirza et al, 2003]. В некоторых случаях р53 связывается с ДНК и блокирует респонсивный элемент какого-либо активатора транскрипции. р53 может рекрутировать деацетилазы или ДНК-метилазы

на промоторы-мишени и таким образом изменять структуру хроматина, делая его транскрипционно неактивным [Esteve et al, 2005].

Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки

Процессы дифференцировки и пролиферации клеток неразрывно связанны. Активно

пролиферирующие клетки обычно дедифференцированы, однако, в определенный момент они переходят в состояние покоя (фазу Go клеточного цикла), предшествующую началу дифференцировки. Регуляцией перехода клетки в ту или иную фазу клеточного цикла занимаются специальные белки - циклин зависимые киназы, на которые в свою очередь оказывают влияние на регуляторные элементы многих сигнальных путей. Будучи одной из наиболее важных мишеней р53, белок р21 является ингибитором циклин-зависимых киназ. Дифференцировка различных клеточных линий ассоциирована с активностью этого белка. Было продемонстрировано, что введение в опухолевые клетки вектора, экспрессирующего р21, приводит к остановке клеточного цикла и инициации процесса терминальной дифференцировки [Yang et al, 1995]. В некоторых клеточных линиях индукция р21 может происходить и р53-независимым образом [Missero et al, 1995]. Индукция р21 в некоторых дифференцирующихся клеточных линиях не обязательно указывает на прямое влияние этого белка на процесс дифференцировки. Экспрессия р21 может быть связанна с остановкой клеточного цикла в Gi фазе и переводе клетки в стадию терминальной дифференцировки Go [Macleod et al, 1995]. В пользу этого говорит тот факт, что р2Г^/_ мыши нормально развиваются и у них не наблюдаются нарушения дифференцировки кишечного эпителия. Эти наблюдения свидетельствуют, что р53 может играть важную роль в процессе дифференцировки клеток, тем не менее существуют и альтернативные пути, участвующие в этом процессе и не связанные с р53 и р21 сигнальными путями [Almog and Rotter, 1997].

Последствия инактивации р53 у мышей

Эмбриогенез мышей, у которых отсутствует функциональный белок р53, проходит

без заметных нарушений. Нокаутные по этому гену мыши рождаются нормальными, но вследствие отсутствия контроля генетической стабильности и накопления соматических мутаций к 6 месяцам они умирают из-за образования опухолей, в основном лимфом (70%) [Dumble etal, 2001].

Изучение клеточного цикла и дифференцировки клеток печени у р53"^/_ мышей показало, что в процессе эмбриогенеза и непосредственно после рождения развитие

печени не претерпевает никаких видимых нарушений. Этот факт доказывает, что р53 не играет критической роли в развитии организма на ранних этапах, либо утрата его функции может быть компенсирована другими факторами, например, гомологами рбЗ и р73. Однако для клеток печени взрослых нокаутных мышей было показано увеличение пролиферативной активности и наличие значительного, по сравнению с нормой, количества мелких овальных клеток, экспрессирующих маркеры как зрелых, так и незрелых гепатоцитов. Гепатобластоподобные клетки накапливаются в печени р53^_/' мышей, не переходя к стадии дифференцировки. Этот факт заставляет считать, что отсутствие р53 приводит к нарушению дифференцировочного процесса в стволовых клетках взрослого организма [Dumble et al, 2001]. В нормальной взрослой печени в низком количестве обнаруживаются так называемые овальные клетки. Они представляют собой бипотентные стволовые печеночные клетки и являются предшественниками гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков.

Негативная регуляция АФП белком р53

Онко-эмбриональный белок АФП является печеньспецифическим белком из

семейства альбуминов. В норме он экспрессируется только в эмбриональной печени и после рождения его уровень в крови быстро падает. Однако при возникновении гепатокарцином, повреждений печеночной ткани, а также при регенерации после гепатэктомии АФП вновь обнаруживается в крови. Белок АФП используется в медицине как важный диагностический маркер нарушения нормального функционирования печени, в частности при развитии опухолей [Abelev and Eraiser, 1999]. Точный механизм, определяющий включение экспрессии АФП при возникновении опухолей, до сих пор остается невыясненным [Лазаревич, 2000].

По мнению Barton и соавторов, р53 способен оказывать репрессорное действие на экспрессию АФП. Эксперименты in vitro по иммунопреципитации хроматина показали, что р53 способен взаимодействовать с ДНК в регуляторном регионе АФП и изменять структуру хроматина, влияя таким образом на экспрессию этого белка. Авторы утверждают, что в дистальном промоторном регионе АФП существует сайт связывания белка трянс-активатора FoxA, который может конкурентно ингибироваться р53. Инактивация транскрипции АФП белком р53 происходит независимо от уровня ацетилирования гистонов. Гиперацетилирование гистонов не способствует снятию репрессорного действия р53 [Ogden et al, 2001].

Негативная регуляция экспрессии HNF4aPl белком р53

Недавняя работа Maeda и соавторов свидетельствует в пользу того, что р53

снижает активность гена HNF4a, связываясь с промотором Рів клетках линии гепатомы человека HepG2.

Несмотря на то, что эктопическая экспрессия р53 с мутантным ДНК-связывающим доменом не оказывает ингибирующего эффекта на промотор Р1, механизм действия онкосупрессора на транскрипцию HNF4aPl вероятнее всего комплексный. Исследователи показали, что ингибирование гистоновых деацетилаз частично снимает репрессорный эффект р53 на Р1. Кроме того, р53 может взаимодействовать с активатором промотора Р1 фактором HNF6 как in vivo, так и in vitro, и препятствовать его связыванию со специфическим участком ДНК [Maeda et al., 2006].

Ранее эта же группа исследователей показала, что в линии клеток эмбриональной почки 293 р53 может связываться с белком HNF4al и ингибировать его транс-активационные функции, а также связываться с промоторами генов-мишеней HNF4al и привлекать к ним деацетилазы [Maeda et al, 2002].

Трансформирующий фактор роста (TGF0)

Трансформирующий фактор роста представляет собой секретируемый полипептид, который является сигнальной молекулой и действует на клетку посредством серин/треониновых киназ и внутриклеточных эффекторных белков Smad. Тот факт, что TGFp способен подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в различных типах клеток, а также то, что нарушение TGFB-сигнального пути в результате мутаций его компонентов является частым событием при канцерогенезе, заставляет рассматривать его в качестве опухолевого супрессора. В то же время, большинство опухолей человека гиперэкспрессирует TGFp, а его аутокринная и паракринная стимуляция способствует повышению уровня метастазирования клеток. По многочисленным данным, TGFp способен индуцировать эпителиально-мезанхимальный переход (ЭМП), который необходим для увеличения инвазивного потенциала опухолевых клеток. Предполагается, что действие TGFp в качестве опухолевого супрессора проявляется на ранних стадиях канцерогенеза, в то время как при прогрессии он может усиливать инвазивность и способность опухолевых клеток к метастазированию [Akhurst and Derynck, 2001; Roberts etai, 2003].

Описанная при канцерогенезе двойственная роль TGFp подтверждается и результатами исследований роли этого фактора при нормальном развитии. TGFp участвует в регуляции многочисленных клеточных процессов как во время

эмбрионального развития, так и при поддержании тканевого гомеостаза во взрослом организме. Существуют данные, указывающие на то, что действие TGFP в одних клеточных типах на определенном этапе развития может быть совершенно противоположным его действию на окружающие клетки на следующей стадии [Sporn and Roberts, 1990].

TGFP лиганд

Суперсемейство TGFp принято подразделять на 2 подсемейства, включающие в

себя 9 семейств: подсемейства TGFp/активин (TGFp и активиновое семейства) и BMP/GDF (ВМР2, ВМР5, ВМРЗ, GDF5, Vgl и семейства промежуточных и дальних факторов). Члены BMP/GDF и активинового семейства играют важную роль преимущественно в эмбриогенезе, контролируя такие процессы, как гаструляция, нейрогенез, определение дорзовентральной оси, и участвуют в регуляции закладки и развития многих органов [Massague, 1998 ; Piek and Roberts, 2001].

На сегодняшний день идентифицировано 5 генов, относящихся к семейству TGFP (TGFP 1-5) из которых только первые 3 встречаются у млекопитающих [Yinglmg et al, 1995]. Члены этого семейства характеризуются высокой гомологией на белковом уровне, поэтому в течение длительного времени исследователи полагали, что их биологические свойства идентичны. В связи с этим большинство работ было посвящено изучению функции TGFpl, типичного представителя семейства. Однако данные, полученные в последнее время, указывают на существование различий в биологических эффектах, вызываемых факторами TGFp [Sanford et al, 1997; Piek and Roberts, 2001]. Кроме этого, их инактивация у мышей вызывает различные фенотипические нарушения. Нокаут TGFpl приводит к эмбринальной гибели части животных в вследствие нарушения формирования желточного мешка. Родившиеся мыши умирают в течение месяца из-за нарушения развития иммунной системы и появления множественных очагов воспаления [Bissell et al, 2001]. Инактивация гена TGFP2 у мышей приводит к смерти сразу после рождения из-за нарушений в развитии сердечно-сосудистой системы, легких, глаза, костей позвоночника, а также массированного апоптоза [Bartram et al, 2001]. При инактивации TGFP3 наблюдаются нарушения в развитии неба («волчья пасть») и легких [Kaartinen et al, 1995].

Экспрессия членов семейства TGFP происходит дифференцированно в отдельных тканях. TGFpi является универсальным фактором и экспрессируется почти всеми типами клеток, в то время как TGFP2 и TGFP3 синтезируются в ограниченном числе тканей. В< гепатоцитах нормальной взрослой крысиной печени экспрессии факторов TGFP не наблюдается. Однако все 3 представителя семейства экспрессируются на разном уровне в синусоидальных, Купферовских и звездчатых клетках печени. При гепатэктомии,

гепатоканцерогенезе или других стрессорных воздействиях в гепатоцитах наблюдается быстрое повышение экспрессии TGF(3. Следует отметить, что при гепатэктомии в гепатоцитах значительнее всего повышается уровень экспрессии TGFp2 [Bissell et al, 2001].

Белки семейства TGFP синтезируются в виде белкового предшественника, от которого в процессе созревания отделяется сигнальный пептид и N-концевой продомен, получивший название LAP (Latentcy-Associated Protein). За отделение LAP в клетках млекопитающих отвечает субтилизин-подобная про-протеин конвертаза (SPCl/Furin или SPC4/PAGE4). Биологически активной формой TGFP является димер, состоящий из связанных между собой гидрофобными и дисульфидными связями мономеров. В комплексе с LAP димеры удерживаются нековалентными взаимодействиями и N-гликозидными связями, в таком виде TGFp секретируется в кровь или межклеточную жидкость. Во многих типах клеток (например, в звездчатых клетках печени и гепатоцитах) синтезируется 130 кДа белок LTBP (Latent TGFP Binding Protein), соединяющийся дисульфидной связью с одним из мономеров LAP и также входящий в состав экскретируемого комплекса. Комплекс, состоящий из LAP, TGFP и LTBP с массой, равной 235 кДа, получил название большого латентного комплекса. В составе такого комплекса члены семейства TGFp биологически неактивны, однако указанный белковый комплекс необходим для правильного фолдинга, секреции и локализации TGFP в организме. Латентный комплекс заякорен в матриксе через N-гликозидную связь белка LTBP с компонентами ВКМ [Oklu and Hesketh, 2000].

Для активации TGFP должен освободиться из латентного комплекса с LAP белком. В расщеплении комплекса могут участвовать протеазы (плазмин, металлопротеиназа (ММР)-2, ММР-9), активные формы кислорода (АФК) и изменения рН. Механизмы активации могут отличаться в различных типах клеток. Ряд клеточных рецепторов, таких как интегрины, рецептор маннозы-6-фосфата, декорин и тромбоспондин-1, способны связывать LAP и изменять его конформацию, что приводит к высвобождению активного димера TGFP, в то же время рН и АФК приводят к денатурации LAP, нарушая, таким образом, связь между LAP и TGFp. После активации димер способен связаться с TGFP-рецепторами и активировать их, запуская тем самым каскад внутриклеточной передачи сигнала [Pardali and Moustakas, 2007].

Рецепторы TGFP

В передаче сигнала от TGFp принимают участие 3 типа рецепторов. TGFp

рецепторы (TpR) I и II типа относятся к классу серин/треониновых трансмембранных киназ и участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, a TPR III типа не имеет

внутриклеточного домена, но участвует в активации латентной формы TGFp, в его накоплении и кластеризации (Рисунок 2) [Massague, 1998].

Цитоплазматический домен TpPJ содержит уникальный домен GS-домен (30 аминокислот), названный так из-за большого числа SGSSSG-повторов. Фосфорилирование именно этого домена ответственно за активацию внутриклеточных субстратов [Wrana et al., 1994]. Рецепторы TPRI и TpRII отличаются механизмами фосфорилирования. Серии 213 околомембранного цитоплазматического района TpRII фосфорилируется независимо от связывания с лигандом, в то время как серии 165 TPRI -только после взаимодействия с лигандом. Фосфорилирование этих остатков необходимо для активации рецепторов и регулирует интенсивность сигнала [Luo and Lodish, 1997].

К рецепторам III типа относятся протеогликаны: бетагликан и эндоглин. Это мембранные белки, которые взаимодействуют с TGFp, но не обладают внутриклеточным доменом, что исключает их самостоятельное участие в передаче внутриклеточного сигнала.

Бетагликан обладает высокой аффинностью ко всем членам семейства TGFp и усиливает их связывание с TpRII. Показано существование тройного комплекса бетагликан-TGFpi-TpRII на поверхности клеток. Бетагликан особенно важен для узнавания TGFP2. Сам по себе TGFP2 не способен самостоятельно связываться с TpRII, так как имеет к нему слишком малую аффинность. Бетагликан экспрессируется не всеми типами клеток, что свидетельствует о том, что он не является незаменимым компонентом TGFP-сигнального каскада — в эндотелиальных клетках его роль выполняет трансмембранный гликопротеин эндоглин. В отсутствие бетагликана TGFp2 не может активировать рецептор (например, в эндотелии сосудов) [Massague and Chen, 2000]. Считается, что бетагликан способен не только концентрировать молекулы TGFP на поверхности клеток, но и обеспечивает их оптимальную конформацию для узнавания рецепторами. У мышей с нокаутом TPR3 наблюдались летальные дефекты в развитии сердца и печени, которые были обусловлены подавлением ТОРр2-зависимой сигнализации, а гиперэкспрессия бетагликана в клетках, в которых он изначально отсутствовал, приводила к усилению TGFP2 индуцируемой сигнализации [Pardali and Moustakas, 2007]. Эндоглин также относится к группе рецепторов Ш типа. Он экспрессируется в эндотелиальных клетках и в моноцитах, эритроидных предшественниках и в некоторых других типах клеток. Несмотря на сходство с бетагликаном по аминокислотной последовательное ти, эндоглин связывается с TGFpi и TGFP3, но не с TGFp2 [Lastres et al., 1996]. Так же, как и бетагликан, эндоглин способен

Рисунок 2. Smad-зависимый TGFp-сигнальныи путь. TGFp взаимодействует с гетеротетрамерным рецепторным комплексом ТріШ/ТрИ посредством связывания с бетагликаном на поверхности клетки. Затем TpRD фосфорилирует TpRI, который в свою очередь фосфорилирует R-Smad. Активированные R-Smad образуют комплекс с Co-Smad и транслоиируются в ядро. Гетеромерный комплекс белков Smad спобен связываться с ДНК и взаимодействовать с кофакторами транскрипции (ТФ), регулируя транскрипцию генов-мишеней. I-Smads и белки Smurf, локализованные в ядре, выходят в цитоплазму при активации TGFP-сигнального пути и способствуют убиквинтилированию (Lib) рецептора TGFp* и последующей его деградации. I-Smad также ингибируют фофорилированне R-Smad.

формировать комплексы с TpRI и ТрШП.

Гиперэкспрессия эндоглина снижает активность TGFp сигнального пути. Мутации в нем или в одной из изоформ TPRI приводят к схожим заболеваниям человека, но физиологическая роль эндоглина до конца пока не ясна [Massague, 1998]. У мышей, не экспрессирующих эндоглин, нарушается ангиогенез, у человека это приводит к наследственной геморрагической телангиотензии I типа, характеризующейся нарушением в образовании артериальной системы печени, а также фиброзом или циррозом печени [Bissell е/ а/., 2001].

В отсутствие лиганда TpRI и TPRII находятся на поверхности клетки в гомодимерной форме. Активированные димеры TGFP-лиганда связываются с TpRIII, который облегчает презентацию лиганда и взаимодействует с гетеро-тетрамерным комплексом рецепторов TpRI и TpRII. После связывания активированного димера TGFp с гетеро-тетрамерным рецепторным комплексом изменяется конформация внутриклеточных доменов рецепторов, в результате происходит транс-фосфорилирование TpRI киназой TPRII. После фосфорилирования TpRI его каталитический центр оказывается активированным и приобретает способность фосфорилировать свои внутриклеточные субстраты. К числу наиболее изученных субстратов относятся белки семейства Smad, играющие главную роль в передаче сигнала от мембраны к ядру в TGFp сигнальном пути. [Shi and Massague, 2003].

Белки Smad

Каскад регуляторных белков Smad (гомологичных белкам С. elegans SMA и D.

melanogaster MAD, Mothers Against Decapentaplegic) представляет собой эволюционно консервативный компонент цепи передачи внешних сигналов в ядро клетки. Он играет важнейшую роль в обеспечении реализации и регуляции генетических программ, обуславливающих формирование тканей и органов при развитии организма.

Семейство регуляторных белков Smad млекопитающих включает восемь представителей, которые функционально разделяют на три группы: рецепторные R-Smad, медиаторные Co-Smad и ингибирующие I-Smad [Pardali and Moustakas, 2007].

R-Smad непосредственно фосфорилируются рецептором I типа в С-концевой последовательности в мотиве Ser-Ser-X-Ser (SSXS). К этой труппе относятся Smadl, Smad2, Smad3, Smad5 и Smad8. В ответ на воздействие TGFp фосфорилируются исключительно Smad2 и Smad3, тогда как другие Smad активируются остальными факторами этого семейства. Фосфорилирование С-концевой последовательности R-Smad позволяет им связываться с Co-Smad и транслоцироваться в ядро, где они могут рекрутировать транскрипционные факторы и регулировать экспрессию TGFP-

респонсивных генов. Единственным представителем Co-Smad, обнаруженным у млекопитающих, является Smad4, он участвует в сигнализации, индуцируемой как TGFp, так и другими членами этого суперсемейства. Следует отметить, что фосфорилировать R-Smad может не только TpRI, но и другие серин/треониновые киназы (ERK, РКС).

Ингибирующие I-Smad способны подавлять передачу сигнала от активированных рецептором Smad. У человека известно два представителя этой группы Smad6 и Smad7. Smad6 преимущественно ингибирует сигнал от BMP, a Smad7 - от TGFp и активина [Massague, 1998]. Активация TGFp/Smad сигнального пути приводит к быстрой индукции экспрессии I-Smad (Smad7), а также убиквитин лигазы из семейства Smurf. Smad7 конкурентно ингибирует фосфорилирование R-Smad TPRI (Рисунок 2) [Pardali and Moustakas, 2007].

Взаимодействие R-Smad и TpRI регулирует белок SARA. SARA ассоциирован с плазматической мембраной и взаимодействует как с нефосфорилированными R-Smad, так и с рецепторным комплексом. Когда рецептор активируется и Smad2/3 фосфорилируются, Smad2/3 диссоциирует от SARA и рецепторного комплекса, связываясь со Smad4. Кроме этого Smad7 может привлекать к рецепторному комплексу фосфатазы, которые инактивируют его, а также непосредственно связываться и активировать каталитическую активность белков Smurf, которые убиквитинилируют TPRI, что в свою очередь способствуют эндоцитозу и лизосомальной деградации лиганд-рецепторного комплекса [Pardali and Moustakas, 2007].

TGFp сигнальный путь

После активации рецепторного комплекса киназа TpRI фосфорилирует R-Smad.

Активированный R-Smad (Smad2/3) способен связываться со своим цитоплазматическим партнером Co-Smad (Smad4), после чего происходит транслокация образованного комплекса в ядро. В ядре комплекс Smad вместе с различными транскрипционными факторами регулирует экспрессию респонсивных генов {Рисунок 2). В неактивном состоянии Smad существуют в виде гомо-олигомеров, локализованных в цитоплазме [Massague, 1998].

Белки семейства Smad, за исключением одной из форм Smad2, могут непосредственно связываться с ДНК. В структуре МН1 (MAD Homology) домена R-Smad и Smad4 обнаружена высоко консервативная последовательность р-шпильки, ответственная за взаимодействие с ДНК. Таким образом, взаимодействие между различными белками Smad и ДНК вряд ли селективно в ряду представителей этого семейства. В то же время наиболее распространенная удлиненная сплайс-форма Smad2 у позвоночных содержит вставку в 30 а. к. в Mill домене, которая не позволяет ему

связываться с ДНК. Роль этой вставки до сих пор не ясна. Мыши с нокаутом Smad2 умирают на ранних этапах эмбрионального развития, при этом мыши, которые экспрессируют только укороченный вариант Smad2, имеют нормальный фенотип. Это подтверждает гипотезу о том, что форма Smad2, не способная связываться с ДНК, не является необходимой для выживания и нормального развития. Возможно, Smad2 играет роль конкурентного ингибитора в транскрипционных комплексах, образованных гетеродимерами R-Smad.

Smad4 и все R-Smad за исключением Smad2, узнают минимальный Smad связывающий элемент (SBE, Smad Binding Element) 5^Л-ОТСТ-3\ Промоторы многих Smad-респонсивных генов содержат одну или несколько последовательностей SBE, которые содержат дополнительное основание S'-GTCTG-S^Pardali and Moustakas, 2007]. Аффинность Smad белков по отношению к SBE in vivo слишком слабая, поэтому для активации транскрипции в промоторах респонсивных генов содержатся конкатемеры последовательностей SBE [Zawel et al, 1998]. К тому же в ядре комплексы Smad белков довольно часто взаимодействуют с различными транскрипционными факторами и белками хроматина, что позволяет регулировать транскрипцию гена, в промоторе которого расположена только одна последовательность SBE [Massague and Wotton, 2000].

Некоторые TGFp-респонсивные гены не содержат в промоторных районах канонических SBE, но при этом могут связывать комплекс Smad белков. Так, например, в промоторе с-Мус содержится TGFp-ингибиторный элемент (TIE). Исследование промотора этого гена показало, что последовательность S'-GGCTT-S' связывает Smad3 или Smad4 [Chen et al, 2002]. К тому же было показано, что Smad могут связываться GC-богатыми последовательностями, как в случае с активацией транскрипции гена Idl, где требуются наличие в промоторе как канонической SBE, так и GC-богатой последовательности [Korchynskyi and ten Dijke, 2002].

Активированный комплекс R-Smad-Smad4 достигает высокого сродства и селективности в отношении промоторов генов-мишеней за счет связывания с транскрипционными факторами. Среди сотен TGFp-респонсивных генов в определенной клетке только несколько могут быть мишенями специфического комплекса R-Smad-Smad4-TpaHCKpnnHHOHHbm фактор. Соответственно, если клетка не экспрессирует транскрипционные факторы-партнеры, то в ней не будут активироваться или репрессироваться определенные гены-мишени TGFp. Таким образом может достигаться специфичность экспрессии TGFp-респонсивных генов в зависимости от типа клеток. Транскрипционные факторы могут избирательно взаимодействовать с комплексами, образованными Smad2-Smad4 или Smad3-Smad4. Более того, в некоторых случаях

партнеры Smad могут определять тип регуляции экспрессии гена-мишени, активацию или репрессию. Более 50 транскрипционных факторов, принадлежащих к различным семействам ДНК-связывающих белков, способны взаимодействовать со Smad в ядре, определяя разнообразие физиологических ответов клетки на воздействие TGF(3.

Основными коактиваторами транскрипции TGFP-респонсивных генов являются базальные факторы транскрипции рЗОО и СВР, которые взаимодействуют со Smadl, Smad2, Smad3 и Smad4 в МН2 домене. К наиболее известным корепрессорам относятся TGIF, E2F, Ski и SnoN, которые могут связываться как со Smad2, так и со Smad3, подавляя транскрипцию ряда генов [Massague et al, 2005].

Кроме того, Smad3 взаимодействует с рядом ядерных рецепторов, среди которых рецептор витамина D (VDR), андрогеновый рецептор (AR) и HNF4a [Brown et al, 2007]. Взаимодействуя с FINF4a, Smad3 под действием TGF(31 индуцирует экспрессию гена АроСШ, основного компонента липопротеинов низкой плотности [Kardassis et al, 2000].

Механизм выбора того или иного ядерного партнера и/или гена-мишени пока остаются неясными.

Альтернативные сигнальные пути

Smad-независимая сигнализация, индуцированная TpR, включает в себя три

возможных варианта: 1) TPR активируют компоненты Smad-независимых сигнальных каскадов, которые модулируют активность Smad белков; 2) активированные Smad белки модулируют активность компонентов других сигнальных путей, которые участвуют в дальнейшей передаче сигнала; 3) TPR напрямую активирует компоненты Smad-независимых сигнальных путей, которые не изменяют активность Smad [Moustakas and Heldin, 2005].

TGFp может активировать и целый ряд сигнальных каскадов, часть из которых участвует в регуляции активности Smad, зачастую подавляя ее. Было показано, что активация МАР-киназы (МАРК, Mitogen activated kinase) ERK приводит к фосфорилированию линкерного домена R-Smad, препятствуя транслокации Smad в ядро и, соответственно, ингибируя их транскрипционную активность [Kretzschmar et al, 1997]. TGFp-индуцированная киназа JNK способна фосфорилировать Smad3 [Engel et al, 1999], но кроме этого активирует транскрипционный фактор c-Jun, который способствует образованию комплекса Smad2 с его репрессором TGIF и таким образом ингибируя Smad2-3aBHCHMyK) транскрипцию [Pessah et al, 2001]. TGFP-зависимая активация фосфоинозитол-3 киназы (PI3K) может приводить к фосфорилированию Smad3 и способствует его транслокации в ядро [Runyan et al, 2003].

Кроме этого многочисленные сигнальные пути, которые активируются в результате связывания TGFp с рецепторным комплексом, могут самостоятельно оказывать влияние на процессы клеточной жизнедеятельности независимо от Smad. Среди них ERK1/2, JNK и р38, а также Ras и Rho-подобные малые ГТФазы [Yue and Mulder, 2000].

Активация TpRII может приводить не только к фосфорилированию TpRI, как считалось ранее [Massague, 1998], но и к фосфорилированию рецептора Рагб. Активированный Рагб связывается с убиквитин лигазой Smurfl, что в дальнейшем приводит к убиквитинилированию и деградации RhoA.. В результате происходит реорганизация цитоскелета и разрушение плотных контактов [Ozdamar et ah, 2005]. Активированный TpRII может также взаимодействовать с проапоптотическим адапторным белком Daxx, что приводит к активации JNK сигнального каскада и индукции апоптоза в эпителиальных клетках и гепатоцитах [Perlman et ah, 2001].

Помимо этого активированный комплекс TGFp рецепторов может связываться с нерецепторной киназой ТАКІ (TGFp Activated Kinase 1). ТАКІ принадлежит к семейству MAP киназ и способна запускать МАР-киназный каскад, активировать JNK и р38 киназы, а так же фосфорилировать киназу ингибиторной субъединицы NF-kB, IKK, что приводит к активации NF-kB [Lewis et ah, 2004].

В свою очередь было показано, что активация Ras/Erk каскада может индуцировать экспрессию TGFpi, и таким образом усиливать действие TGFp. TGFP-индуцируемая активация МАРК каскадов может также влиять на транскрипцию TGFP-респонсивных генов, регулируя активность транскрипционных факторов, взаимодействующих со Smad [Moustakas et ah, 2001].

Таким образом, даже при инактивации Smad-сигнального каскада реакций, возникающей в некоторых случаях при канцерогенезе и других паталогиях, TGFP способен активировать внутриклеточные сигнальные каскады и оказывать влияние на основные процессы клеточной жизнедеятельности. Наличие большого числа пересекающихся сигнальных путей может объяснять спектр разнообразных процессов, которые регулируются TGFp.

TGFp-зависимая регуляция экспрессии HNF4a

Исследования, касающиеся влияния TGFP-сигнального пути на экспрессию HNF4a во многом основаны на изучении ЭМП и ассоциированных с ним процессов дедифференцировки эпителиальных клеток при опухолевой прогрессии. Способность вызывать ЭМП является одним из важнейших проопухолевых свойств TGFp.

Впервые ЭМП был описан эмбриологами как часть процесса закладки сердца, плаценты и многих других органов. Во взрослом состоянии ЭМП наблюдается при процессах заживления ран и в ходе опухолевой прогрессии [Piek and Roberts, 2001]. Основными критериями ЭМП являются: утрата эпителиальной полярности, разделение на отдельные клетки, приобретение подвижности, разрушение плотных и адгезионных контактов, десмосом и реорганизация фокальных контактов, появление актиновых стресс-фибрилл. На молекулярном уровне самым частым событием является изменение цитоскелета, переход от цитокератиновых промежуточных фи ламенто в, характерных для эпителиоцитов, к виментиновым, типичным для фибробластоподобных клеток [Thiery, 2002].

Одним из наиболее важных маркеров ЭМП является начало экспрессии транскрипционных факторов (Snail), подавляющих синтез эпителиального кадхерина (Е-Cadherin). Е-кадхерин - трансмембранный гликопротеид, участвующий, с одной стороны в формировании межклеточных контактов, а с другой стороны - в сигнальном пути, контролирующем пролиферацию и адгезию [Calvisi et al, 2001]. Репрессия Е-кадхерина, как правило, происходит на транскрипционном уровне, в этом процессе могут быть задействованы многие клеточные сигнальные пути (TGFP, FGF, Wnt). К другим важным событиям следует отнести изменение спектра экспрессируемых субъединиц интегринов, главных компонентов фокальных контактов, участвующих в прикреплении и подвижности клеток, а также экспрессию мезенхимальных маркеров (фибронектин). Помимо этого, важным моментом в процессе приобретения способности к инвазии является гиперэкспрессия протеолитических ферментов, способных ремоделировать ВКМ [Thiery, 2002].

Показано, что TGFP может индуцировать ЭМП через различные сигнальные каскады, включающие RhoA [Bhowmick et al, 2001], Ras/MAPK [Janda et al, 2002], a также Jaggedl/Notch [Zavadil et al, 2004]. Кроме этого, TGFp участвует в регуляции перестроек ВКМ [Maeda et al, 2006].

В целом ряде работ было показано, что первичные крысиные гепатоциты, пережившие обработку TGFpl (TPE-FH), претерпевают ЭМП. В этих клетках наблюдается многие классические признаки ЭМП: гиперэкспрессия Snail и подавление транскрипции Е-кадхерина, утрата эпителиальной морфологии, появление актиновых стресс-фибрил в цитоплазме и замена кератиновых филаментов на виментиновые. Кроме того, в TpE-FH снижается уровень дифференцировки, что выражается в утрате или снижении уровня экспрессии маркеров дифференцировки HNF4a, HNFla и Р и печеньспецифических белков (АФП, альбумина). В то же время, в TPT-FH наблюдается активация синтеза белка

0V-6, маркера предшественников гепатоцитов, активация экспрессии фибронектина, виментина и bcl-XL. TpT-FH утратили чувствительность к TGFpi-индуцируемому апоптозу, хотя они остались чувствительны к апоптозу, вызываемому другими факторами, пусть и в меньшей степени [Valdes et al, 2002]. TpT-FH избегают проапоптотического действия TGFp за счет гиперактивации PI3K, что в свою очередь приводит к активации NF-kB и подавлению апоптоза [Valdes et al, 2004].

В другой работе было показано, что в Met трансформированных гепатоцитах мыши (ММН) TGFp способен индуцировать ЭМП, который характеризуется снижением экспрессии HNF4a, HNFla, а также других эпителиальных маркеров [Cicchini et al, 2006]. Существуют указания на то, что TGFp 1-зависимая индукция Snail в клетках почки собаки MDCK-II, ассоциированная с ЭМП, осуществляется в результате активации МАРК сигнального пути и зависит от МЕК, но не связана с активностью Smad4 [Peinado et al, 2004].

Известно, что HNF4a является важнейшим регулятором дифференцировки гепатоцитов и обладает морфогенной активностью, его гиперэкспрессия в клетках дедифференцированной гепатомы приводит к частичному восстановлению эпителиальной морфологии [Lazarevich et al, 2004]. Кроме этого, его экспрессия в фибробластах ЗТЗ достаточна для индукции мезенхимально-эпителиального перехода [Parviz et al, 2003], а в клетках эмбриональной карциномы F9 - для начала синтеза белков, участвующих в образовании плотных контактов и определяющих клеточную полярность [Chiba et al, 2005]. Таким образом, HNF4a представляется одним из наиболее вероятных кандидатов на роль мишени TGFp, репрессия которого является одним из ключевых событий для индукции ЭМП.

Показано, что TGF(3 может подавлять экспрессию CYP7A1, гена холистеролгидроксилазы, участвующего в синтезе желчных кислот, в клетках нормальных гепатоцитов и линии гепатомы человека HepG2. Механизм подавления связан с транскрипционной репрессией гена HNF4a, которая происходит в результате Smad3-зависимой сигнализации [Li and Chiang, 2007].

Кооперация р53 и TGFP сигнальных путей

В литературе встречается ограниченное число сообщений, касающихся участия р53 в TGFP-сигнальном пути.

Было показано, что р53 может участвовать в регуляции клеточной дифференцировки, модулируя активность TGFP-сигнального пути при эмбриональном

развитии Xenopus посредством физического взаимодействия с внутриклеточными эффекторами TGFP на промоторах респонсивных генов [Takebayashi-Suzuki et al, 2003].

Роль р53 в стимуляции TGFP-зависимой активации транскрипции была подтверждена на нескольких клеточных моделях млекопитающих. Так, подавление экспрессии р53 в клетках линии гепатомы человека HepG2 приводит к блокированию TGFP-индуцированной экспрессии целого ряда генов, в числе которых p21^WAFI, PAI-1 (Plasminogen inhibitor activator), а также металлопротеиназа MMP2 [Cordenonsi et al, 2003]. В другом исследовании было обнаружено, что эктопическая экспрессия мутантных форм р53 изменят способность TGFp индуцировать экспрессию р21, PAI-1, ММР2, а также специфического белка гладкой мускулатуры (SM22) и Smad7 [Kalo et al., 2007]. Кроме этого, авторы показали, что указанные р53 мутантные формы влияют сразу на несколько этапов TGFp-сигнального каскада, включая фосфорилирование Smad2, образование комплекса Smad2-Smad4 а также транслокацию этого комплекса в ядро. Указанное действие р53 было вызвано подавлением экспрессии гена T/3RII, связанное с непосредственным взаимодействием мутантного р53 с промотором этого гена.

Исследования лаборатории Бартон демонстрируют, что TGFp-зависимое подавление экспрессии гена АФП происходит в результате взаимодействия Smad с р53. Последний способен рекрутировать на промотор АФП по крайней мере два транскрипционных репрессора SnoN и mSin3. Было показано, что в промоторе АФП присутствуют перекрывающиеся последовательности респонсивных элементов р53 и Smad. Кроме этого, компьютерный анализ продемонстрировал возможное наличие перекрывающихся респонсивных элементов р53 и Smad более чем в 50 локусах в геноме человека [Wilkinson et al, 2005 ; Wilkinson et al, 2008].

Неоднократно сообщалось о возможности пересечения TGFp и МАРК сигнальных каскадов. В частности, показано, что киназа ERK может напрямую фосфорилировать R-Smad белки, что приводит к блокированию TGFP-зависимой сигнализации. В то же время взаимодействие TGFp и Ras/MEK/ERK сигнальных путей может выражаться в кооперативном влиянии на регуляцию пролиферации и других процессов в развитии организма [Derynck and Zhang, 2003 ; Shi and Massague, 2003]. Недавно было показано, что нокаут р53 у Xenopus приводит к блокированию индукции экспрессии мезодермальных маркеров при действии фактора роста фибробластов (FGF, fibroblast growth factor). Этот эффект связан с тем, что в норме действие FGF, опосредованное через активацию Ras сигнального пути, приводит к фосфорилированию р53, который после этого оказывается способен взаимодействовать с беками Smad и рекрутироваться на промоторы генов-мишеней, кодирующих мезодермальные маркеры [Cordenonsi et al, 2007]. Эти данные

свидетельствуют о наличии механизмов, в которых р53 участвует в направлении внешних сигналов, в частности связанных с TGFP-сигнализацией.

Существует предположение о том, что р53 может быть необходим для TGFP-зависимого подавления клеточного роста и более того, что инактивация р53, вызванная его мутациями, может приводить к выходу клетки из цитостатического контроля, который обеспечивается компонентами TGF-сигнального пути [Cordenonsi et ah, 2003]. Однако эти гипотезы нуждаются в экспериментальных проверках [Atfi and Baron, 2008].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Список использованных растворов и сред

ТЕ буфер: 10 мМ трис-HCl, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА (Sigma);

ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер), буфер для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле: 0.04 М трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА.

lx PBS, забуференный физиологический раствор (ЗФР): 1.37 М NaCl, 270 мМ КС1, 130 мМ Na2HP04, 150 мМ КН2Р04.

Модуляция транс-активационных функций изоформ

Существуют данные о том, что изоформы HNF4a могут димеризоваться между собой, образуя, таким образом, более десятка комбинаций белков с различной транс-активациошюй силой [Sladek et al, 1999 ; Torres-Padilla et al, 2001].

Модуляция транс-активационных функций изоформ Группы изоформ HNF4a, образующиеся в результате транскрипции с альтернативных промоторов Р1 и Р2 (далее называемые HNF4aPl и HNF4aP2 соответственно), различаются по N-концевому участку. Изоформы HNF4aPl содержат шранс-активационный домен AF-1, а у изоформы HNF4aP2 он отсутствует. При взаимодействии FINF4aPl с кофакторами транскрипции GRIP-1 (Glucocorticoid Receptor-Interacting Protein 1) и СВР/рЗОО (cAMP-response element-Binding Protein) активность AF-1 может значительно увеличиваться, в то время как трянс-активационные функции HNF4aP2 не изменяются. Несмотря на то, что обе группы изоформ HNF4aPl и HNF4aP2 способны взаимодействовать с GRIP-1, СВР/рЗОО и SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors) через AF-2, синергический эффект от взаимодействия с коактиваторами GRIP-1 и СВР/рЗОО достигается только в случае HNF4aPl. Следует отметить, что и репрессорное действие HNF4aPl при взаимодействии с SMRT сильнее, чем HNF4aP2. Последнее, вероятнее всего, объясняется лучшей способностью HNF4aPl изоформ привлекать деацетилазы к промотору гена-мишени. Существуют указания на то, что домен AF-2 может взаимодействовать как с коактиваторами, так и с корепрессорами, в то время как домен AF-1 связывается исключительно с коактиваторами транскрипции. Таким образом, только HNF4aPl могут реализовать синергичное или антагонистическое действие различных коактиваторов и корепрессоров транскрипции [Torres-Padilla et al, 2002]. Также было показано, что внутри группы HNF4aPl изоформа HNF4a2 сильнее, чем HNF4al, активируется кофакторами СВР, GRIP-1 и SRC-1 [Sladek et al, 1999].

Коактиваторы транскрипции могут играть важную роль в поддержании функциональной активности HNF4a. Существуют данные о том, что в линии гепатомы человека HepG2 ген HNF4a экспрессируется на высоком уровне, однако его транс активационные функции в аспекте активации генов-мишеней и, как следствие в поддержании дифференцированного статуса клетки, оказываются супрессированы. Экзогенная экспрессия кофакторов транскрипции SRC-1 и PGC-la усиливает активность респонсивных к HNF4a генов и значительно восстанавливает нормальный гепатоцитарный фенотип клеток [Martinez-Jimenez et al, 2006].

HNF4a может непосредственно взаимодействовать с различными транскрипционными факторами, такими как белки семейства SMAD (Sma-MAD, Mothers Against Decapentaplegic) [Chou et al, 2003] и p53 [Maeda et al, 2006]. Взаимодействие белков SMAD4 и SMAD3 (но не SMAD2) с HNF4a посредством домена AF-1 способствует усилению транс-активирующей способности HNF4a [Chou et al, 2003]. Обратная ситуация наблюдается в случае взаимодействия FfNF4a с р53, который способен репрессировать отрянс-активационные функции HNF4aPl, связываясь с его активационным доменом, а также привлекая деацетилазную активность на промоторы его генов-мишеней [Maeda et al, 2006].

Было показано, что комплекс Smad4-Smad3 способен связываться с HNF4a на промоторе АроСШ и активировать его экспрессию именно за счет усиления трапс-активационной силы HNF4a [Kardassis et al, 2000].

Группы изоформ FINF4a имеют разный спектр генов-мишеней. Так HNF4aP2 эффективнее активирует ранние гепатоцитарные гены, такие как альфа-фетопротеин (АФП), а HNF4aPl - гены дифференцировочных маркеров печени [Лазаревич, 2004]. Таким образом, наличие изоформ с различными активационными свойствами обеспечивает тонкую регуляцию различных групп генов-мишеней на разных стадиях развития организма [Duncan et al, 1997; Hayhurst et al, 2001].

Функции HNF4a Недавние исследования показали, что в гепатоцитах взрослого человека HNF4a связывается с промоторными областями 12% проанализированных генов, в то время как вторая РНК-полимераза связывается с 23%, и ни один другой транскрипционный фактор не демонстрировал связывание с более чем 2.5% промоторов [Odom et al, 2004]. Анализ генов-мишеней HNF4a, а также исследования по инактивации HNF4a во взрослом организме указывают на то, что этот фактор регулирует экспрессию генов, отвечающих за синтез сывороточных белков крови и метаболических ферментов, участвующих в обмене углеводов, жиров, стероидов, ксенобиотиков и аминокислот [Hayhurst et al, 2001; Odom et al, 2004]. Кроме этого, под его контролем находятся гены, кодирующие компоненты системы коагуляции крови и протеолиза. HNF4a играет ключевую роль в функционировании печени и поджелудочной железы, и нарушение его синтеза приводит к серьезным нарушениям метаболизма [Parviz et al, 2003]. Метаболизм В печени и поджелудочной железе HNF4a регулирует экспрессию многих генов, участвующих в метаболизме углеводов, жиров, стероидов и ксенобиотиков. Помимо активации экспрессии генов в результате прямого действия на свои сайты связывания в промоторных элементах, HNF4a способен взаимодействовать, в частности, с PGC-la — транскрипционным коактиватором, регулирующим многие процессы энергообмена клетки, в том числе адаптивный термогенез, митохондриальный биогенез и глюконеогенез, вызванный голоданием. При образовании такого комплекса HNF4a индуцирует транскрипцию генов глюкоза-6-фосфатазы и фосфоенолпируват карбоксилазы — основных ферментов глюконеогенеза [Rhee et al, 2003]. Кроме того, HNF4a активирует CYP7A1 - катализатор первой ступени синтеза желчных кислот и Ntcp (Na /Taurocholate cotransporting polypeptide) транспортерный белок органических анионов - основные медиаторы базолатерального движения желчных кислот по гепатоциту [Hayhurst et al, 2001]. HNF4a необходим также для экспрессии аполипопротеинов ароАП, ароСП, ароСШ, а также других переносчиков жирных кислот L-FABP (Fatty acid binding protein) и МТР (Microsomal triglyceride transfer protein) — важнейших регуляторов обмена липидов. HNF4a активирует экспрессию транскрипционного фактора PXR, который, в свою очередь, участвует в регуляции экспрессии гена CYP3A4, кодирующего цитохром Р 450 ЗА4 [Tirana et al, 2003]. Таким образом, HNF4a косвенно участвует в процессах гидроксилирования стероидных гормонов и ксенобиотиков [Li et al, 2000]. В Р-клетках поджелудочной железы HNF4a активирует экспрессию гена инсулина [Bartoov-Shifinan et al, 2002] и необходим для индуцированной глюкозой секреции этого гормона [Wang et al, 2000].

Участие белка р53 в процессе клеточной дифференцировки

Процессы дифференцировки и пролиферации клеток неразрывно связанны. Активно пролиферирующие клетки обычно дедифференцированы, однако, в определенный момент они переходят в состояние покоя (фазу Go клеточного цикла), предшествующую началу дифференцировки. Регуляцией перехода клетки в ту или иную фазу клеточного цикла занимаются специальные белки - циклин зависимые киназы, на которые в свою очередь оказывают влияние на регуляторные элементы многих сигнальных путей. Будучи одной из наиболее важных мишеней р53, белок р21 является ингибитором циклин-зависимых киназ. Дифференцировка различных клеточных линий ассоциирована с активностью этого белка. Было продемонстрировано, что введение в опухолевые клетки вектора, экспрессирующего р21, приводит к остановке клеточного цикла и инициации процесса терминальной дифференцировки [Yang et al, 1995]. В некоторых клеточных линиях индукция р21 может происходить и р53-независимым образом [Missero et al, 1995]. Индукция р21 в некоторых дифференцирующихся клеточных линиях не обязательно указывает на прямое влияние этого белка на процесс дифференцировки. Экспрессия р21 может быть связанна с остановкой клеточного цикла в Gi фазе и переводе клетки в стадию терминальной дифференцировки Go [Macleod et al, 1995]. В пользу этого говорит тот факт, что р2Г/_ мыши нормально развиваются и у них не наблюдаются нарушения дифференцировки кишечного эпителия. Эти наблюдения свидетельствуют, что р53 может играть важную роль в процессе дифференцировки клеток, тем не менее существуют и альтернативные пути, участвующие в этом процессе и не связанные с р53 и р21 сигнальными путями [Almog and Rotter, 1997].

Последствия инактивации р53 у мышей Эмбриогенез мышей, у которых отсутствует функциональный белок р53, проходит без заметных нарушений. Нокаутные по этому гену мыши рождаются нормальными, но вследствие отсутствия контроля генетической стабильности и накопления соматических мутаций к 6 месяцам они умирают из-за образования опухолей, в основном лимфом (70%) [Dumble etal, 2001].

Изучение клеточного цикла и дифференцировки клеток печени у р53"/_ мышей показало, что в процессе эмбриогенеза и непосредственно после рождения развитие печени не претерпевает никаких видимых нарушений. Этот факт доказывает, что р53 не играет критической роли в развитии организма на ранних этапах, либо утрата его функции может быть компенсирована другими факторами, например, гомологами рбЗ и р73. Однако для клеток печени взрослых нокаутных мышей было показано увеличение пролиферативной активности и наличие значительного, по сравнению с нормой, количества мелких овальных клеток, экспрессирующих маркеры как зрелых, так и незрелых гепатоцитов. Гепатобластоподобные клетки накапливаются в печени р53_/ мышей, не переходя к стадии дифференцировки. Этот факт заставляет считать, что отсутствие р53 приводит к нарушению дифференцировочного процесса в стволовых клетках взрослого организма [Dumble et al, 2001]. В нормальной взрослой печени в низком количестве обнаруживаются так называемые овальные клетки. Они представляют собой бипотентные стволовые печеночные клетки и являются предшественниками гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков.

Негативная регуляция АФП белком р53 Онко-эмбриональный белок АФП является печеньспецифическим белком из семейства альбуминов. В норме он экспрессируется только в эмбриональной печени и после рождения его уровень в крови быстро падает. Однако при возникновении гепатокарцином, повреждений печеночной ткани, а также при регенерации после гепатэктомии АФП вновь обнаруживается в крови. Белок АФП используется в медицине как важный диагностический маркер нарушения нормального функционирования печени, в частности при развитии опухолей [Abelev and Eraiser, 1999]. Точный механизм, определяющий включение экспрессии АФП при возникновении опухолей, до сих пор остается невыясненным [Лазаревич, 2000].

По мнению Barton и соавторов, р53 способен оказывать репрессорное действие на экспрессию АФП. Эксперименты in vitro по иммунопреципитации хроматина показали, что р53 способен взаимодействовать с ДНК в регуляторном регионе АФП и изменять структуру хроматина, влияя таким образом на экспрессию этого белка. Авторы утверждают, что в дистальном промоторном регионе АФП существует сайт связывания белка трянс-активатора FoxA, который может конкурентно ингибироваться р53. Инактивация транскрипции АФП белком р53 происходит независимо от уровня ацетилирования гистонов. Гиперацетилирование гистонов не способствует снятию репрессорного действия р53 [Ogden et al, 2001].

Негативная регуляция экспрессии HNF4aPl белком р53 Недавняя работа Maeda и соавторов свидетельствует в пользу того, что р53 снижает активность гена HNF4a, связываясь с промотором Рів клетках линии гепатомы человека HepG2.

Несмотря на то, что эктопическая экспрессия р53 с мутантным ДНК-связывающим доменом не оказывает ингибирующего эффекта на промотор Р1, механизм действия онкосупрессора на транскрипцию HNF4aPl вероятнее всего комплексный. Исследователи показали, что ингибирование гистоновых деацетилаз частично снимает репрессорный эффект р53 на Р1. Кроме того, р53 может взаимодействовать с активатором промотора Р1 фактором HNF6 как in vivo, так и in vitro, и препятствовать его связыванию со специфическим участком ДНК [Maeda et al., 2006].

Ранее эта же группа исследователей показала, что в линии клеток эмбриональной почки 293 р53 может связываться с белком HNF4al и ингибировать его транс-активационные функции, а также связываться с промоторами генов-мишеней HNF4al и привлекать к ним деацетилазы [Maeda et al, 2002].

Трансформирующий фактор роста (TGF0) Трансформирующий фактор роста представляет собой секретируемый полипептид, который является сигнальной молекулой и действует на клетку посредством серин/треониновых киназ и внутриклеточных эффекторных белков Smad. Тот факт, что TGFp способен подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в различных типах клеток, а также то, что нарушение TGFB-сигнального пути в результате мутаций его компонентов является частым событием при канцерогенезе, заставляет рассматривать его в качестве опухолевого супрессора. В то же время, большинство опухолей человека гиперэкспрессирует TGFp, а его аутокринная и паракринная стимуляция способствует повышению уровня метастазирования клеток. По многочисленным данным, TGFp способен индуцировать эпителиально-мезанхимальный переход (ЭМП), который необходим для увеличения инвазивного потенциала опухолевых клеток. Предполагается, что действие TGFp в качестве опухолевого супрессора проявляется на ранних стадиях канцерогенеза, в то время как при прогрессии он может усиливать инвазивность и способность опухолевых клеток к метастазированию [Akhurst and Derynck, 2001; Roberts etai, 2003].

Трансформация клеток Е. Coli

В работе использовали замороженные компетентные клетки E.coli, приготовленные с помощью набора для создания компетентных клеток «Z-competent E.coli transformation kit» (Zymed). Клетки размораживали на льду, добавляли к ним 5-15 нг плазмидной ДНК и оставляли на льду на 40 минут. Затем клетки рассевали на предварительно нагретые до 37С чашки Петри с LB агаром, содержащим ампицилин в концентрации 50 мг/мл, и инкубировали в течение ночи при 37С. Бактериальные клоны отбирали и тестировали на наличие плазмиды с помощью рестрикционного анализа плазмидной ДНК.

Трансфекция и инфекция клеток линии HepG2 Трансфекцию эукариотических клеток линии HepG2 проводили с использованием трансфицирующего липосомного реагента Fugene (Roche) согласно протоколу фирмы-изготовителя. Для этого среду без антибиотика смешивали с реагентом Fugene, раскапывали по пробиркам, в которые добавляли трансфицируемые плазмиды, и инкубировали в течение 15 минут. Полученную смесь вносили в чашки с клетками и инкубировали в течение 24 часов, после чего клеткам меняли среду и инкубировали еще в течение 24-48 часов. Для выравнивания результатов измерений активности люциферазы все клетки вместе с исследуемыми или контрольными плазмидами ко-трансфицировали плазмидой pRLK (Promega), кодирующей белок рениллу - люциферазу из организма Renilla reniformis.

Инфекцию клеток HepG2 лентивирусным вектором, кодирующим миРНК к р53, проводили по следующей методике. Клетки НЕК293Т рассевали на 6 сантиметровые чашки и через 6 часов проводили трансфекцию клеток смесью из четырех плазмид, три из которых кодировали структурные и функциональные белки лентивируса (pLPl, pLP2, pVSVG). Четвертая плазмида кодировала миРНК к р53, а также зеленый флуоресцентный белок (вектор pLSL-shp53GFP). Трансфекцию осуществляли при помощи стандартного кальций-фосфатного метода [Chen and Okayama, 1988]. На второй день клеткам НЕК293Т меняли среду и рассевали клетки HepG2, предназначавшиеся для инфекции. На третий день собирали среду с чашек с клетками 293Т, фильтровали ее через 0.45 мкн фильтр и наливали в чашки с клетками HepG2. Процедуру повторяли на четвертый день. Уровень трансфекции клеток НЕК293Т и последующей инфекции HepG2 оценивали по свечению зеленого флуоресцентного белка при длине волны 490 нм в инвертированном флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 (Carl Zeiss).

Анализ активности репортерного гена люциферазы Измерение активности люциферазы проводили с помощью набора Dual-Lucifarase Reporter Assay System (Promega) согласно рекомендациям фирмы производителя. Система позволяет одновременно измерять свечение двух различных белков: продукта гена люциферазы светлячка, кодируемого последовательностью в векторе pGL3-Basic, и продукта гена люциферазы Renilla reniformis, находящегося в векторе pRLK. По степени свечения продукта люциферазы Renilla reniformis можно проводить выравнивание образцов друг относительно друга.

Лизис клеток проводили в 100 мкл однократного лизирующего раствора (Passive Lysis Solution, Promega) в течение 15 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. 20 мкл клеточного лизата вносили в центрифужную пробирку, в которую предварительно помещали 80 мкл раствора для определения активности люциферазы. Перемешивали 2-3 раза пипетированием, переносили в люминометр (Turner BioSystems) и измеряли интенсивность свечения люциферазы. В ту же пробирку добавляли раствор для измерения активности рениллы, быстро перемешивали и помещали в люминометр для измерения интенсивности свечения рениллы.

Выделение РНК Суммарную клеточную РНК из образцов тканей мышей или культур клеток выделяли при помощи набора для выделения РНК «Wizard SV Total RNA Isolation System» (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Ткани предварительно измельчали в парах жидкого азота в охлажденном гомогенизаторе Поттера. Качество полученной РНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле, а концентрацию измеряли спектрофотометрически спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

Выделение высокомолекулярной геномной ДНК Нормальную печень взрослой мыши линии C57B1/DBA (Fl BDF) гомогенизировали в парах жидкого азота, а затем растворяли гомогенат в 500 мкл буфера STE. К клеточной суспензии добавляли додецилсульфат натрия до 1% и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл, суспендировали и инкубировали при температуре 37С в течение двух часов. Полученный лизат депротеинизировали дважды фенолом и хлороформом и переосаждали равным объемом изопропилового спирта в 0.25 М NaCl. ДНК, выпавшую в осадок, извлекали стеклянной палочкой, промывали 70% этанолом и растворяли в буфере ТЕ. Выделенную ДНК хранили на 4С.

Ферментативный гидролиз геномной ДНК рестриктазой Hindlll проводили в течение 3-5 часов при 37С, добавляя каждые 1.5-2 часа двукратный избыток фермента. После переосаждения ДНК использовали для ПЦР амплификации с использованием специфических праймеров (см. ниже).

Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК Для получения препаративных количеств плазмидной ДНК клетки EColi, трансформированные соответствующими плазмидами, выращивали из отдельной колонии в 250 мл среды LB с добавлением ампициллина (до концентрации 50 мкг/мл) в течение ночи при интенсивном перемешивании и 37С. Затем бактерии осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин при 4С. Клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл раствора для лизиса из набора для выделения плазмид «Wizard DNA Purification System» (Promega). Далее плазмидную ДНК выделяли в соответствии с рекомендациями производителя и элюировали с колонки в 250 мкл воды, свободной от нуклеаз. Качество полученной плазмидной ДНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле, а концентрацию измеряли спектрофотометрически при длине волны 260 нм и рассчитывали по формуле: Концентрация ДНК (мкг/мл) = ОДгбох50хР, где Р -разведение. Полученную плазмидную ДНК хранили при -20 С.

Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4aP2

Роль цитокинов семейства TGFP в канцерогенезе до сих пор исследована недостаточно. Повышенное содержание TGFpl в крови пациентов с опухолями печени является неблагоприятным прогностическим маркером [Tsai et al, 1997 ; Rossmanith and Schulte-Hermann, 2001]. Тем не менее, в зависимости от внутриклеточного контекста он может выступать как в качестве опухолевого супрессора, подавляющего пролиферацию и запускающего программу апоптоза, так и в роли индуктора ЭМП и фактора, усиливающего инвазивность опухолевых клеток [Breuhahn et al, 2006 ; Fransvea et al, 2008].

Группа исследователей под руководством I. Fabregat показала, что при обработке культуры первичных гепатоцитов из эмбриональной печени крыс фактором TGFpi наблюдается массовая гибель клеток, однако выжившие гепатоциты претерпевают ЭМП, который сопровождается утратой некоторых дифференцировочных маркеров, таких как HNF4a и HNFla, и началом экспрессии маркера предшественников гепатоцитов (овальных клеток) и опухолевых клеток печеночного происхождения OV-6 [Valdes et al, 2002]. В свою очередь, ЭМП рассматривается многими авторами как один из важнейших этапов канцерогенеза [Thiery and Sleeman, 2006].

Исследования образцов опухолевой ткани пациентов с гепатокарциномами, проведенное в нашей лаборатории, а также эксперименты по эктопической экспрессии HNF4al в линии дедифференцированной гепатомы мыши указывают на то, что изменение спектра экспрессии изоформ гена HNF4a может приводить к изменению дифференцировочного статуса клетки [Lazarevich et al, 2004 ; Флейшман и др., 2008]. На основании этих данных было сформулировано положение о том, что нарушение нормальной экспрессии гена HNF4a является важной детерминантой прогрессии гепатокарцином.

Принимая во внимание результаты исследований действия TGF01 на клетки гепатоцитарного происхождения, а также данные собственных исследований, мы решили изучить возможность участия факторов семейства TGFP в регуляции экспрессии гена HNF4a и, как следствие, TGFp-зависимого изменения дифференцировочной программы гепатоцитов.

В нашей лаборатории было проведено исследование изменения спектра экспрессии генов, которое происходит при одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мыши, методом гибридизации с кДНК микрочипами, содержащими специфические зонды к 9 тысячам генов мыши [Лазаревич, 2003]. Было показано, что многие гены, экспрессия которых претерпевает наиболее значимые изменения, являются TGFP-респонсивными.

Суммируя эти данные, можно заключить, что активация TGFp сигнального пути в опухолевых клетках гепатоцитарного происхождения может приводить к снижению дифференцировочного статуса, ключевым регулятором которого является HNF4a. Мы решили выяснить, как факторы семейства TGFp регулируют экспрессию гена HNF4a.

Эксперименты, проведенные в нашей лаборатории, выявили, что одноступенчатая прогрессия гепатокарцином мыши, ассоциированная с репрессией гена HNF4a, TGFp!

Влияние цитокинов семейства TGFP на экспрессию печеньспецифических генов в культуре HepG2. Клетки инкубировали в культуральной среде с 5 нг/мл TGFpi (дорожки I и 3) или TGFp2 (дорожки 2 и 4) в течение 24 или 48 часов, после чего из клеток выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР. Н/О - клетки, не обработанные цитокином. Реакцию с праймерами к гену GAPDH использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию. сопровождается гиперэкспрессией факторов семейства TGFP и, в частности, TGFp2 [Овчинников, 2004]. Кроме этого было показано, что экспрессия генов, кодирующих рецепторы TGFp" I и II типов (TpRI и TpRII), а также фактора TGF03 при канцерогенезе мыши и человека значимых изменений не претерпевает [Флейшман и др., 2008]. Мы решили исследовать действие факторов TGFpi и 2 на изменение спектра экспрессии печеньспецифических генов в культуре гепатомы человека HepG2.

Для того чтобы выяснить, влияет ли активация сигнальных путей, регулируемых TGFp, на экспрессию гена HNF4a и других гепатоцитарных ядерных факторов и маркеров дифференцировки в клетках гепатомы HepG2, мы инкубировали их в присутствии 5 нг/мл TGFpi или TGFJ32 в течение 24 или 48 часов и анализировали экспрессию интересующих нас генов методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами. Мы обнаружили, что эффект, оказываемый на клетки гепатомы HepG2 цитокинами семейства TGFP, сходен с изменениями, наблюдаемыми в печени p53 f мышей -происходит активация экспрессии эмбриональных изоформ HNF4aP2 и частичное подавление уровня экспрессии взрослых изоформ HNF4aPl {Рисунок 9). Было показано, что оба указанных цитокина оказывают сходный эффект на экспрессию изоформ. Через 24 часа после добавления цитокинов наблюдается максимальная индукция экспрессии эмбриональных изоформ HNF4aP2, а через 48 часов уровень транскрипции взрослых изоформ HNF4aPl достигает минимума.

Необходимо отметить, что наряду с подавлением экспрессии HNF4aPl через 48 часов происходит репрессия респонсивного по отношению к HNF4a гена HNFla, который в свою очередь является активатором транскрипции HNF4aPl [Kuo et al, 1992 ; Li et al, 2000 ; Ferrer, 2002]. Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показывают, что HNF4a взаимодействует с промотором гена HNFla начиная с 14.5 дня эмбрионального развития мыши [Kyrmizi et al, 2006]. Можно говорить о том, что действие факторов семейства TGFp на линию гепатомы человека приводит к нарушению авторегуляторной петли, включающей в себя факторы семейств HNF4a и HNFla.

При воздействии TGFP в клетках HepG2 наблюдалось также подавление экспрессии С/ЕВРа, гепатоцитарного ядерного фактора, участвующего в активации экспрессии промотора Р1 гена HNF4a [Hatzis et al, 2006]. Возможно, снижение экспрессии С/ЕВРа является событием, предшествующим падению уровня транскрипции HNF4aPl.

Кроме того, под действием TGFp в клетках HepG2 происходит подавление экспрессии основного маркера дифференцированных гепатоцитов, альбумина. Экспрессия этого гена частично регулируется транскрипционным фактором HNFla [Tranche et al, 1997]. Можно предположить, что подавление экспрессии гена альбумина происходит вследствие репрессии HNF4aPl, которая приводит к снижению уровня HNFla.

Похожие диссертации на Механизмы транскрипционной регуляции гепатоцитарного ядерного фактора 4

Механизм регуляции активности 2'-фосфодиэстеразы в культуре клеток NIH 3Т3 Карташева Ольга Николаевна

Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1Лябин Дмитрий Николаевич

Молекулярные механизмы регуляции соматического гипермутирования иммуноглобулиновых геновБлагодатский Артем Сергеевич

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитанияЗацепина Ольга Георгиевна

Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспресии теломерных ретротранспозонов Drosophila melanogasterШпиз Сергей Григорьевич

Роль факторов инициации в регуляции трансляции в клетках КРЕБС-2, зараженных вирусом энцефаломиокардита Дижур Александр Михайлович

Гены фактора некроза опухолей и лимфотоксинов: регуляция экспрессии и анализ биологических функций методом генетического нокаутаКупраш Дмитрий Владимирович

Механизмы активации и регуляции инозитол (1,4,5) - трисфосфат - активируемых кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431Киселев, Кирилл Игоревич

Механизмы регуляции функциональной активности рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата эндоплазматического ретикулума Глушанкова Любовь Николаевна

Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilisФедорова, Ксения Павловна