Введение к работе
Актуальность проблемы. В начале 80-х годов обнаружен класс белков, которые обеспечивают внутриклеточный транспорт и правильное сворачивание как вновь-синтезированных полштептвдных цепей, так и белков, денатурированных в результате различных клеточных стрессов (тепловой и холодовои шоки, оксидативный стресс и тд) Такие белки были названы шаперонами Среди обширного класса шаперонов существует семейство олигомерных белков, состоящих из 14-16 субъединиц с молекулярным весом около 60 кДа, объединенных в две взаимодействующие друг с другом кольцевые структуры с двумя обширными внутренними полостями Такие шапероны были названы шаперонинами Шаперонин клеток Е coh GroEL -один из наиболее интенсивно исследуемых как со структурной, так и с функциональной точек зрения
Этот белок состоит из 14 идентичных субъединиц с молекулярным весом 57,2 кДа каждая, обладает слабой АТФ-азной активностью и функционирует как шаперон в присутствии своих лигандов ионов К+ и Mg2-1", АДФ, АТФ и белкового ко-шаперонина GroES GroEL взаимодействует с широким спектром денатурированных белков, предотвращая их агрегацию и обеспечивая приобретение этими белками жесткой третичной структуры Несмотря на значительное количество работ по исследованию структуры и функции GroEL, механизм его функционирования как молекулярного шаперона окончательно не установлен В наиболее популярной модели функционирования GroEL предполагается, что ненативный белок связывается во внутренней полости одного из двух колец шаперонина В присутствии адениновых нуклеотидов GroEL образует комплекс с ко-шаперонином GroES, который «прикрывает» внутреннюю полость со связанным в ней ненативным белком, образуя камеру ("ячейку Анфинсена"), которая предохраняет сворачивающийся белок от нежелательных межмолекулярных контактов и обеспечивает окончательное сворачивание белка
\\
\
Однако, несмотря на привлекательность такой модели и ее соответствие ряду экспериментальных фактов, она не может претендовать на универсальность Во-первых, GroEL может осуществлять шаперонную функцию и в отсутствие своих лигандов, включая ко-шаперонин GroES Во-вторых, GroEL обеспечивает правильное сворачивание крупных (более 50 Ша) белков, которые не могут поместиться в его внутреннюю полость В-третьих, эукариотический аналог GroEL функционирует как молекулярный шаперон даже в том случае, когда его внутренняя полость занята большим антителом Все эти факты указывают на то, что для расширения нашего представления о механизме функционирования GroEL как молекулярного шаперона необходимо подробное исследование взаимодействия шаперонина с денатурированными белками и факторов, влияющих на это взаимодействие Представляет также интерес изучение конформационных изменений GroEL при его взаимодействии со своими лигандами
Цели работы. Основной целью данной работы явилось исследование комплексообразования GroEL с различными денатурированными белками, факторов, влияющих на этот процесс, и разработка универсальной модели функционирования GroEL как молекулярного шаперона
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы были определены ионные условия, обеспечивающие прочное взаимодействие GroEL с белковыми мишенями различного заряда, стехиометрические параметры комплексов GroEL с различными денатурированными белками и показано, что приобретение сворачивающимся белком нативной конформации происходит вне его комплекса с шаперонином, т е в свободном состоянии На основании полученных результатов предложена новая более универсальная модель функционирования GroEL как молекулярного шаперона, не накладывающая ограничений на размер и количество связываемых шаперонином белковых мишеней
Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют в основном фундаментальное значение для понимания механизмов сворачивания белка как in vitro, так и in vivo, а также белок-белкового узнавания Вместе с тем, некоторые результаты могут быть использованы для решения практических задач в области биотехнологии - для широкомасштабного выделения клеточных шаперонов, и медицины - для разработки новых методов диагностики шаперон-зависимых заболеваний
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в 15 публикациях Результаты работы представлялись на симпозиумах II и III Съездах биофизиков России (1999 и 2004 гг), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пушино, 28 мая-2 июня 2000 г), научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад И Н Буланкина, (Харьков, Украина, 16-17 января, 2001г), VHI Украинском биохимическом съезде, (Черновцы, Украина, 1-3 октября 2002г), Путинских конференциях молодых ученых (1997 и 2005 гг), научной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 15-16 июня 2006), международных конгрессах 30th FEBS Congress & 9th IUBMB Conference "The Protein World" the FEBS Journal (July 2-7,2005, Budapest, Hungary) и 31th FEBS Congress "Molecules ш Health & Disease" the FEBS Journal (June 24-29, 2006, Istanbul, Turkey)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 131 странице, содержит 18 рисунков и 3 таблицы Список литературы включает 213 ссылок
