Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 8
Гемотрансмиссивные инфекции: возбудители и их идентификация 8
Характеристика основных инфекционных агентов, передающихся через кровь. 8
Вирус иммунодефицита человека (HIV) 10
Вирус гепатита С (HCV) 11
Вирус гепатита В (HBV) 12
Т-лимфотропные вирусы человека I и II типов (HTLV-1,2) 14
Вирус Эпштейна-Барр 15
Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов 16
Цитомегаловирус 17
Вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов, парвовирусВ19 18
Проблема безопасности донорской крови 20
Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций 21
Серологические методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций 21
Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот 22
Амплификационные методы в скрининге донорской крови 26
Амплификационные методы количественного определения нуклеиновых кислот 29
Количественное определение нуклеиновых кислот по "конечной точке".. 30
Способы регистрации продуктов амплификации нуклеиновых кислот 32
Количественное определение нуклеиновых кислот методом амплификации с регистрацией результатов в режиме реального времени 45
Материалы и методы 50
Результаты и обсуждение 55
Метод мультиплексной qPCR на микрочипе 55
Обработка данных кинетики накопления флуоресцентного сигнала 60
Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе и регистрации продуктов амплификации 62
Количественная мультиплексная РСЯна микрочипе 68
Выбор генетических мишеней для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот 69
Определение пределов обнаружения вирусных нуклеиновых кислот 72
Калибровочные кривые для количественного определения нуклеиновых кислот 74
Одновременный количественный анализ нуклеиновых кислот HIV-1, HBV и HCV методом qPCR на микрочипе 77
Исследование образцов плазмы крови человека методом мультиплексной qPCR на микрочипе 78
Заключение 82
Выводы 83
Благодарности 84
Список литературы 85
- Вирус иммунодефицита человека (HIV)
- Серологические методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций
- Способы регистрации продуктов амплификации нуклеиновых кислот
- Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе и регистрации продуктов амплификации
Введение к работе
Снижение риска заражения пациентов при гемотрансфузиях является одной из актуальных проблем современной трансфузионной медицины. Решение этой проблемы представляется возможным при создании и внедрении в лабораторную практику службы крови современных быстрых надёжных и чувствительных методов обнаружения вирусов в донорской крови.
К настоящему времени значительный прогресс достигнут в разработке иммунологических методов, но их применение имеет существенное ограничение, в частности, эти методы не могут эффективно использоваться в период серонегативного окна, ассоциированного с инфекциями, вызванными вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV) и иммунодефицита человека (HIV), а также в случае иммуновариантных и неиммуногенных форм инфекции.
Методы, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот (Nucleic Acids Testing, NAT), являются чрезвычайно перспективными для внедрения в систему лабораторной диагностики, так как сочетают в себе высокую чувствительность и специфичность с возможностью непосредственного выявления и анализа фрагментов геномов инфекционных агентов. NAT-методы позволяют проводить исследования в мультиплексном формате, то есть обнаруживать несколько генетических мишеней одновременно.
Обнаружение и количественное определение нуклеиновых кислот основано на различных методических подходах, использующих принцип последовательность-специфичной амплификации нуклеиновых кислот, таких как: полимеразная цепная реакция (Polymerase Chain Reaction - PCR, Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction - RT-PCR), лигазная цепная реакция (Ligase Chain Reaction - LCR), последовательность-специфичная амплификация нуклеиновых кислот (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), и транскрипция-опосредованная амплификация
(Transcription-Mediated Amplification, ТМА). Кроме того, в современных разработках, в основном, применяется метод регистрации результатов непосредственно во время протекания реакции с помощью флуоресцентных красителей, что значительно сокращает время анализа, увеличивает чувствительность метода и позволяет проводить анализ количественно (quantitative PCR - qPCR).
Необходимо отметить, что при проведении qPCR в мультиплексном
формате возникает ряд трудностей: количество одновременно
идентифицируемых мишеней ограничивается возможными
межпраймерными взаимодействиями, а перекрывание спектров поглощения и испускания применяемых флуорофоров, не позволяет одновременно регистрировать более четырёх-пяти продуктов амплификации в одной реакции.
Применение олигонуклеотидных микрочипов, в которых каждая ячейка представляет собой отдельный независимый реакционный элемент, для проведения мультиплексной PCR с регистрацией результатов в режиме реального времени представляется наиболее перспективным подходом для одновременного обнаружения, идентификации и количественного многопараметрического анализа различных генетических мишеней.
Вирус иммунодефицита человека (HIV)
HIV относится к семейству Retroviridae. Существует 2 типа - HIV-1 и HIV-2, оба из которых вызывают иммуносупрессию, переходящую в синдром приобретённого иммунодефицита человека (СПИД). Наиболее распространённый тип HIV-1 делится на три группы М, N и О, группа М состоит из субтипов А-К [17]. Основным маркером при определении HIV-инфекции являются анти-HIV-l антитела и вирусный антиген р24 [7]. HIV является главной причиной приобретённого иммунодефицита человека — состояния, при котором начинается катастрофическое разрушение иммунной системы человека, что непременно приводит к летальному исходу за счёт возникновения оппортунистических инфекций [8].
ВИЧ-инфекция может передаваться половым путём, через заражённую кровь и её продукты, или «вертикальным» путём (от матери к плоду) [9]. В течение трёх недель после инфицирования у человека развивается синдром, характеризующийся симптомами схожими с гриппом, и ассоциированный с высоким уровнем вирусной нагрузки. После чего в течение 4-6 недель, у большинства инфицированных следует развитие иммунного ответа (появление антител) и уменьшение концентрации вирусов в крови. После стадии сероконверсии инфицированные обычно входят в клинически стабильную, бессимптомную фазу, которая может продолжаться в течение нескольких лет. Бессимптомный период характеризуется низкой вирусной нагрузкой и постепенным уменьшением количества CD4+ Т-лимфоцитов, что ведёт к развитию иммунодефицита, и возникновением оппортунистических заболеваний [10, 11].
Количественное определение уровня вирусных частиц в крови имеет высокое прогностическое значение для оценки тяжести протекания заболевания и эффективности применения противовирусной терапии. Определение может быть произведено количественным измерением р24 антигена, культуральными методами или с помощью амплификации нуклеиновых кислот [12]. Антиген р24 является основным белком ВИЧ и представлен в крови в двух состояниях - свободном и связанном с анти-р24 антителами. Свободный р24 антиген может быть количественно определён коммерческими иммунологическими системами, хотя чувствительность (определение истинноположительных образцов) такого определения невысока, так как антиген обнаруживается только у 20% инфицированных пациентов без выраженных признаков заболевания, и у 40-50% пациентов с явно выраженной симптоматикой. Предварительное разрушение комплекса р24 антигена с антителами повышает чувствительность определения, но, все-таки, у большинства бессимптомных пациентов вирусные белки не обнаруживаются [13, 14].
Также проводят культивирование вирусных частиц на активированной культуре мононуклеарных клеток крови (РВМС) здоровых доноров. Количественное определение титра вирусных частиц производится посредством инокуляции РВМС серийными разведениями образца инфицированной плазмы. Данный метод достаточно сложен и имеет ограниченное применение для отслеживания уровня вирусных частиц в крови, так как только небольшая часть вирусных частиц обладает инфицирующей способностью in vitro [15, 16]. Вирус гепатита С (HCV) Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae, и подразделяется на 6 генотипов. HCV представляет собой одноцепочечный РНК вирус с размером генома около 10 000 нуклеотидов, кодирующих примерно 3 000 аминокислот [17].
Считается, что вирус гепатита С является основным этиологическим агентом, ответственным за 90 - 95 % случаев посттрансфузионных не-А не-В гепатитов [18]. Основная среда обитания и размножения вируса гепатита С -макрофаги, эндотелиальные клетки и клетки печени. В 60-70% случаев, заражение влечёт за собой развитие хронических гепатитов, 60 % из которых приводят к циррозу печени [19]. Определение наличия инфекции осуществляется по антителам к а-эпитопу вируса. Детектируемый уровень серологических маркеров в ответ на инфицирование вирусом появляется через 8-16 недель и позже. Так как образующиеся антитела не являются защитными, возможно коинфицирование другим генотипом вируса. Количественное определение вирусных частиц в крови по уровню выработанных антител невозможно, поскольку такая корреляция отсутствует [20, 21].
Напротив, обнаружение РНК HCV амплификационными методами позволяет оценивать уровень вирусной нагрузки, назначать и отслеживать эффективность противовирусной терапии. Применение NAT-методов позволяет определять концентрацию вирусных агентов в крови как в период сероконверсии, так и у пациентов с хроническим гепатитом С с высоким уровнем серологических маркеров, в том числе получающих интерфероновую терапию [22, 23].
Вирус гепатита В (HBV) Относится к семейству Hepadnaviridae. По данным Всемирной организации здравоохранения, более чем два миллиарда человек по всему миру инфицированы вирусом гепатита В и более 350 миллионов из них являются носителями хронической инфекции [24]. Помимо передачи вируса через половые контакты и инфицированную кровь, возможно инфицирование через слюну и микротрещины в слизистой оболочке полости рта. Вирус гепатита В считается одним из самых контагиозных агентов [25]. Кроме поражения клеток печени — основной среды обитания вируса, вирус гепатита В так же может вызывать деструкцию почек, кишечника и иммунной системы [26]. Хронические носители вируса подвержены высокому риску осложнений, включая хронический гепатит, цирроз печени и гепатоклеточную карциному [27, 28, 29]. В 25% случаев развитие хронического гепатита В заканчивается неизлечимым раком печени [30].
Серологические методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций
Большинство серологических методов основано на образовании комплекса антиген-антитело (в различных вариантах), и введении в него метки с последующим её выявлением, что позволяет детектировать этот комплекс. В зависимости от типа метки различают следующие виды иммуноанализа: радиоиммуноанализ на основе радиоактивных меток (РИА), флуоресцентный иммуноанализ - на основе флуоресцентных меток (ФИА), ферментативный иммуноанализ - на основе ферментативных меток (ИФА) [69].
Наибольшее развитие, в последнее время, получил метод ферментативного иммуноанализа - ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) — ферментативный иммуносорбционный анализ. С помощью данного метода можно выявлять и количественно определять как сами вирусные и бактериальные антигены, так и антитела образованные против них. Применение моноклональных антител сделало иммуноанализ более чувствительным и специфичным [70].
Иммуноблотинг - метод для обнаружения и дифференцирования;-антител в сыворотке основан на принципах вестерн-блоттинга. Изначально вирусные белки и пептиды разделяются денатурирующим гель-электрофорезом, переносятся на мембрану и инкубируются с исследуемым образцом сыворотки, содержащим антитела к исследуемым агентам. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело выявляются с помощью1 описанных выше методик [71, 72]. Иммуноблотинг применяется как подтверждающий тест при определении многих вирусных инфекций.
Однако общий недостаток иммуноанализа заключается в его невысокой эффективности при идентификации вирусных агентов с ограниченным продуцированием антигенных детерминант, с большим периодом серонегативного окна, при скрытом протекании инфекции, а так же в случае иммуновариантных и неиммуногенных форм инфекции.
Открытие метода полимеразной цепной реакции (PCR) в середине 1980-х годов [73] послужило началом эры исследования «биологии жизни» на генетическом уровне.
Одной из наиболее развивающихся областей применения методов амплификации нуклеиновых кислот является молекулярно-генетическая лабораторная диагностика, направленная на выявление различных видов инфекционных агентов, включая широкий спектр вирусов [74].
Амплификационные методы (далее AM) обнаружения нуклеиновых кислот значительно расширили диагностические возможности вирусологических лабораторий, и позволили: проводить качественный анализ, генотипирование и количественное обнаружение вирусных агентов. Количественный анализ позволил определять вирусную нагрузку и динамику репликации вирусных частиц, и, таким образом, оценивать тяжесть протекания заболевания, делать прогноз и назначать адекватную антивирусную и интерфероновую терапию [75].
За последнее десятилетие интенсивная разработка как качественных, так и количественных методов анализа нуклеиновых кислот оказала огромное влияние и на развитие молекулярной лабораторной идентификации возбудителей социально-значимых инфекций - HIV, HCV, HBV [76].
Системы амплификации нуклеиновых кислот В разработанных на сегодняшний день AM применяют различные методологические подходы для амплификации генетических мишеней: полимеразную цепную реакцию (PCR), в том числе и с предварительной стадией обратной транскрипции (RT-PCR), изотермальную последовательность-специфичную амплификацию NASBA и ТМА и лигазную цепную реакцию LCR. Также используют метод гибридизации мишени со специфичной разветвленной ДНК (b-DNA) с последующей ферментативной амплификацией сигнала.
Полимеразная цепная реакция (PCR и RT-PCR) Полимеразная цепная реакция была первым разработанным методом амплификационного обнаружения и исследования последовательности нуклеиновых кислот, и остаётся до настоящего времени наиболее востребованным во всём мире. PCR может быть применена для непосредственной амплификации вирусной ДНК [77]. При амплификации РНК необходимо проведение перед PCR дополнительной стадии обратной транскрипции, во время которой происходит синтез кДНК [78]. Нуклеиновую кислоту мишени денатурируют при 95С на одноцепочечные фрагменты, после чего охлаждают до температуры отжига праймеров. Следующий этап, экстинкция (удлинение) праймеров, проводится при оптимальной температуре работы термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (72С). Последовательное повторение этих циклов друг за другом приводит к увеличению количества анализируемого участка исследуемой ДНК в геометрической прогрессии. Продукты реакции могут быть обнаружены с помощью ряда методов, таких как визуализация с помощью бромида этидия в агарозном геле, либо с помощью флуоресцентно или радиоактивно меченных последовательность-специфичных зондов, или с помощью ферментативных реакций.
Транскрипция - ассоциированные методы амплификации (NASBA, ТМА) Транскрипция-опосредованная амплификация (ТМА) и последовательность-специфичная амплификация нуклеиновых кислот (NASBA) довольно схожие одностадийные изотермические методы амплификации нуклеиновых кислот, включающие один пролонгированный цикл обратной транскрипции и транскрипции РНК с помощью Т7 РНК-полимеразы (Рисунок 1).
Способы регистрации продуктов амплификации нуклеиновых кислот
Применение неспецифичных ДНК-красителей в мультиплексной PCR позволяет проводить анализ только в качественном формате, но не в количественном. Дифференциация PCR продуктов в данном варианте производится только методом анализа температур плавления.
Напротив, главное преимущество qPCR с применением SGI заключается в возможности проведения анализа температур плавления уже дифференцированных продуктов амплификации [100]. Последовательность-специфичные флуоресцентные зонды
Чтобы избежать неспецифического накопления флуоресцентного сигнала, применяются, флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, комплементарные части амплифицируемой последовательности — молекулярные/флуоресцентные зонды. В большинстве разработанных методов исходному состоянию зонда соответствует отсутствие флуоресцентного сигнала. Эмиссия флуоресценции наблюдается при связывании зонда со своим комплементом.
Начальное тушение флуоресценции происходит за счёт флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) или эффекта тушения Дэкстера [101]. Эти эффекты проявляются при близком пространственном расположении по отношению друг к другу молекул репортера и тушителя флуоресценции. Увеличение физического расстояния между ними за счёт ферментативного расщепления зонда или его гибридизации на соответствующую мишень приводит к эмиссии флуоресцентного сигнала [102].
Флуоресцентные праймеры-зонды
Одним из первых примеров данной технологии является система праймеров Amplifluor [103]. Первоначально Amplifluor-праймеры образуют устойчивую шпилечно-петлевую структуру, на концах которой расположены молекулы флуорофора и тушителя флуоресценции (Рисунок 4). Специфический отжиг Amlifluor-праймера и его элонгация ведет к синтезу одной из цепей ампликона, которая, в свою очередь, становится матрицей для дальнейшей PCR. В процессе PCR шпилечно-петлевая структура, входящая в de novo синтезированную молекулу ДНК, достраивается до полноценного двухцепочечного PCR продукта, разворачивается, флуорофор и тушитель пространственно разделяются, приводя к эмиссии флуоресцентного сигнала. В модифицированной версии метода [104, 105] к одному из локус-специфичных праймеров на 5 конец добавляется универсальная адаптерная последовательность, служащая матрицей для отжига и экстендирования универсального флуоресцентно меченного Amplifluor праймера.
Аллель-специфичные праймеры данной конструкции также применяются для анализа точечных мутаций [106, 107].
Было показано, что праймеры, имеющие шпилечно-петлевую структуру и содержащие один флуорофор, присоединённый к С5-атому тимидина (Рисунок 6), при включении в PCR-продукт позволяют получить более высокие сигналы флуоресценции (LUX-праймеры). Однако должны выполняться два основных правила для работы данной системы: тимидин, несущий молекулу флуорофора, должен располагаться во второй-третьей позиции от 3 -конца праймера, а сам праймер должен заканчиваться 3 -концевым динуклеотидом GC или CG [108, 109]. Было продемонстрировано применение LUX-праймеров для количественного анализа и выявления одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) [ПО].
Для всех систем с применением праймеров-зондов характерно наличие ложноположительных сигналов в результате образования праймерных димеров или неспецифической амплификации. Повышение специфичности реакции возможно при применении олигонуклеотидов со специально подобранной вторичной структурой. Действительно, показано, что шпилечно-петлевые и самокомплементарные структуры увеличивают специфичность PCR, и, как следствие, уменьшают уровень неспецифичного флуоресцентного сигнала. LNA- и 4 -метоксиметилен-модифицированные нуклеотиды по 3 -концу аллель-специфичных праймеров также увеличивают специфичность PCR [113, 114].
Расщепляемые флуоресцентные зонды Метод PCR-опосредованного ферментативного расщепления флуоресцентно меченных зондов стал одним из первых для получения флуоресцентного сигнала в qPCR-методах. Флуоресцентные зонды, находясь в нативном состоянии, не излучают флуоресцентный сигнал за счёт FRET-эффекта. После гибридизации с наработанной de novo ДНК-мишенью, зонды подвергаются ферментативному расщеплению, что влечёт за собой пространственное разделение репортера и тушителя флуоресценции, что приводит к возникновению флуоресценции.
Наиболее известным представителем данной группы методов является метод TaqMan [115]. TaqMan-зонд представляет собой олигонуклеотид, меченный репортером и тушителем флуоресценции по 5 - и 3 -концам, соответственно. В исходном состоянии происходит FRET тушение флуоресценции. Последовательность TaqMan-зонда комплементарна специфичной последовательности внутреннего участка ДНК, которая амплифицируется двумя немодифированными праймерами. Во время элонгации праймеров, полимераза, благодаря своей нуклеазной активности, отщепляет 5 -флуоресцентно меченный нуклеотид прогибридизованного с мишенью зонда TaqMan (Рисунок 7).
Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе и регистрации продуктов амплификации
Концентрация SYBR Green I
Очевидно, что при увеличении концентрации флуоресцентного красителя должно наблюдаться повышение абсолютного флуоресцентного сигнала. Действительно, при 3-х кратном увеличении концентрации красителя значение абсолютного флуоресцентного сигнала возрастало более чем на 50%, в то же время было зарегистрировано и увеличение значения порогового цикла флуоресценции Ct (более чем на 3 цикла), что, в свою очередь, согласуется с литературными данными об ингибирующем действии высоких концентраций SYBR Green І на ДНК-полимеразу. В ходе работы показано, что рекомендуемая производителем однократная концентрация SYBR Green I, применяемая для регистрации двухцепочечной ДНК в растворе, является оптимальной и для проведения qPCR на микрочипе.
Температура отжига праймеров
При подборе оптимальных условий проведения qPCR на микрочипе был подтверждён факт, обнаруженный ранее [143], что при уменьшении температуры отжига праймеров на 5-6С наблюдалось значительное увеличение эффективности PCR, при этом специфичность реакции оставалась прежней. На рисунке 23 представлен график кинетики накопления флуоресцентного сигнала при амплификации кДНК гепатита С. Из рисунка видно, что при расчётной температуре отжига праймеров - 62С эффективность амплификации значительно снижается - ACt = +9 циклов, по отношению к результату, полученному при проведении реакции при температуре отжига 55С. Данный сдвиг соответствует разнице в начальной концентрации амплифицируемой мишени почти в 100 раз (Рисунок 23А). Казалось бы, что уменьшение температуры отжига на 7С должно приводить к неспецифической амплификации, однако, как следует из рисунка 23В, температура плавления продукта амплификации осталась прежней, что позволяет говорить о высокоспецифичной амплификации участка генома анализируемой НК. Другими словами, подтверждается тот факт, что температуры отжига, рассчитанные для проведения PCR в растворе не могут быть прямо экстраполированы на PCR, проводимую на микрочипе, и, очевидно, данный температурный сдвиг необходимо учитывать для корректной работы амплификационных микрочипов.
Композиция геля, используемого в данной работе, отличалась от состава, использованного в работе Стрижкова, так же как и последовательности олигонуклеотидов, - тем не менее, введение корректировки температуры отжига на указанную величину повышало эффективность PCR.
Был разработан метод qPCR на микрочипе с детекцией результатов в режиме реального времени для количественного определения НК HIV-1, HBV и HCV в образцах плазмы крови человека.
Метод включает два этапа: а) стадия мультиплексной предамплификации, совмещённая с обратной транскрипцией - RT-PCR и б) стадия мультиплексной qPCR на биологическом микрочипе, совмещённая с регистрацией результатов амплификации в режиме реального времени.
Первая стадия RT-PCR, проводимая в пробирке, предназначена для получения кДНК с РНК вирусов гепатита С и HIV-1 и корректирования динамического диапазона количественных измерений. Стратегия двустадийной PCR была применена для повышения чувствительности и специфичности системы. При подборе условий проведения стадии мультиплексной RT-PCR производилась оптимизация температурно-временных режимов, концентрации ионов магния, нуклеозидтрифосфатов, количества ферментов и праймеров. Обратная танскрипция проводилась с применением последовательность-специфичных праймеров. Оптимальные условия проведения реакции представлены в главе «Материалы и методы». На рисунке 24 представлена схема микрочипа для проведения мультиплексной qPCR и регистрации результатов в режиме реального времени. Микрочип состоял из 14 гелевых ячеек, в трёх из которых иммобилизованы праймеры, специфичные к последовательностям HIV-1, HBV и HCV. Остальные ячейки, содержащие неспецифические олигонуклеотиды, предназначены
