Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 8
1.1. Солевой стресс и его влияние на растение 8
1.1.1. Гиперосмотический стресс 8
1.1.2 Окислительный стресс 9
1.2. Солеустойчивость растений 10
1.2.1. Клеточные детерминанты солеустойчивости 11
1.3. Ионный гомеостаз растительной клетки при солевом стрессе 11
1.3.1. Поступление ионов натрия в клетку 12
1.3.2. Удаление ионов натрия из растительных клеток 12
1.3.3. Компартментация ионов натрия в клеточных вакуолях 13
1.3.4. Поступление анионов хлора 13
1.4. Поддержание ионного гомеостаза при солевом стрессе в растениях 13
1.4.1. Начальное поступление в корень и удаление Na+ из клеток корня 13
1.4.2. Контроль поступления Na+ в ксилему 14
1.4.3. Реабсорбция Na+из ксилемы 14
1.4.4. Рециркуляция Na+ по флоэме из листьев обратно в корни 16
1.4.5. Вакуолярная компартментация Na+ в надземной части 16
1.4.6. Плазмалеммарный №+/Н+-антипортер в клетках листьев 17
1.4.7. Накопление Na+ в морфологических образованиях листа 17
1.5. Сигналы трансдукции солевого стресса в растениях 17
1.5.1. SOS сигнальный каскад в Arabidopsis thaliana 17
1.5.2. Сигналы трансдукции гиперосмотического стресса 18
1.5.2.1. АБК и Са2+-зависимые пути передачи стрессовых сигналов 19
1.6. Ка+/Н+-антипортеры эукариот 19
1.6.1. Сравнительный анализ функций Ыа+/Н+-антипортеров эукариот 19
1.6.2. Структурные особенности Ыа+/Н+-антипортеров 20
1.6.3. Структура Ка+/Н+-антипортеров растений 23
1.6.3.1. Плазмалеммарный Ма+/Н+-антипортер 23
1.6.4. Механизм функционирования Ма+/Н+-антипортера 25
1.7. Функционирование На+/Н+-антипортеров в животных клетках 26
1.7.1. Регуляция активности Na+/H+-airranopTepoB житвотных клеток 28
1.8. Ионные транспортеры дрожжей 29
1.9. Функциональное значение Na+/H+- и К+/Н+- антипортеров растений 30
1.9.1. К7Н+-антипортеры 30
1.9.2. На+/Н+-антипортеры 31
1.9.2.1. Биохимические свойства 31
1.9.2.2. Значение Ыа+/Н+-антипортеров для растительной клетки 33
1.9.2.3. Сравнение структуры и функций ионных транспортеров 34
1.10. Регуляция Иа+/Н+-антипортеров растений 35
1.10.1. С-и N-терминальные регуляторные домены 36
1.10.2. Регуляция экспрессии Ыа+/Н+-антипортеров на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях 37
1.11. Цели и задачи работы 39
II. Материалы и методы 42
2.1. Объект исследования 42
2.2. Получение растительного материала 42
2.3. Выделение РНК 42
2.4. Синтез первой цепи кДНК 43
2.5. ПЦР 43
2.6. Клонирование 44
2.7. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8. Получение и очистка полипептида HvNHX4 для получения поликлональных антител 44
2.9. Электрофорез белков в ПААГ с SDS 49
2.10. Иммуноблоттинг 14-3-3 белков и HvNHX4 49
2.11. Диссоциация сектора Vi от Vo V-АТФазы 49
2.12. Выделение плазматических мембран 50
2.13. Выделение вакуолярных мембран 50
2.14. Фракционирование мембран ячменя центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 50
2.15. Измерение АТФ - гидролазной активности в мембранных препаратах 51
2.16. Измерение Н+-транспортной активности Н+-АТРаз 51
2.17. Измерение ионного обмена и пассивной проницаемости везикул для протонов 52
2.18. Реактивы 52
2.19. Статистика 53
III. Результаты 53
3.1. Характеристика выхода, чистоты, ориентации выделенных везикул плазмалеммы и тонопласта 53
3.2. Измерение Н+-транспортной активности ІҐ-АТФаз плазмалеммы и тонопласта... 56
3.3. Измерение пассивной проницаемости везикул для протонов и АТФ-гидролазной активности 59
3.4. Исследование распределения 14-3-3 белков в мембранах тонопласта 61
3.5. Диссоциация Vi сектора V-АТФазыи иммунодетекция белков 14-3-ЗС 61
3.6. Ионный обмен в мембранных везикулах плазмалеммы и тонопласта 62
3.7. Кинетика ионного обмена в везикулах плазмалеммы и тонопласта 65
3.8. Влияние амилорида на ионный обмен 66
3.9. Идентификация предполагаемого К+/Н+- антипортера в ячмене 66
3.10. Установление внутриклеточной локализации HvNHX4 70
3.11. Вестерн анализ HvNHX4 в вакуолярных мембранах, выделенных из разных сортов ячменя 72
3.12. Исследование экспрессии HvNHX4 в разных сортах ячменя 73
IV. Обсуждение 75
4.1. Идентификация предполагаемого вакуолярного К+/Н+-антипортера ячменя HvNHX4 75
4.2. Функционирование ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта в проростках ячменя 79
4.2.1. Н+-АТФазы 79
4.2.2. Ма+/Н+-обменная активность в везикулах плазмалеммы и тонопласта 82
4.2.3. К+/Н+-обменная активность в везикулах тонопласта 87
Заключение 90
Выводы 92
Список литературы 93
- Функционирование На+/Н+-антипортеров в животных клетках
- Регуляция экспрессии Ыа+/Н+-антипортеров на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях
- Фракционирование мембран ячменя центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
- Измерение пассивной проницаемости везикул для протонов и АТФ-гидролазной активности
Введение к работе
Исследование действия на растения абиотических стрессов является одной из наиболее изучаемых проблем биологии растений. Повышенный интерес к исследованиям в этой области объясняется еще и тем, что ее научные вопросы тесно соприкасаются с проблемами экологии, защитой окружающей среды и экономики многих стран мира. Одна из основных проблем, с которой сталкивается земледелие в условиях засушливого климата, связана с засолением почв, которое часто возникает на орошаемых угодьях [Bernsyein & Hayward 1958]. При высоких концентрациях солей в почве растения, а, прежде всего, сельскохозяйственно-ценные культуры страдают от недостатка влаги и непосредственного влияния токсичных солей, и тем самым, снижается продуктивность агроценоза. Токсичные ионы в цитозоле клеток ингибируют многие метаболические процессы. Установлено, что один из способов адаптации растительных клеток к повышенным концентрациям токсичных солей сводится к регулированию поступления их в клетки, а также удалению солей из цитоплазмы либо в апопласт, либо в вакуоль [Blumwald 2000].
Эффективная стратегия получения солеустойчивых растений должна базироваться на знании молекулярно-биологических и биохимических механизмов, участвующих в формировании устойчивости. В последнее десятилетие достигнут определенный прогресс в понимании механизмов поддержания ионного гомеостаза в растительных клетках. Важным критерием устойчивого растения, принято считать высокое соотношение K+/Na+ в цитозоле клеток. Важная роль среди большого набора ионных транспортеров и ионных каналов, обеспечивающих это соотношение, принадлежит протонным насосам и Na+/H+-антипортерам плазмалеммы и тонопласта. №+/Н+-антипортеры используют ДрН, генерируемый протонными насосами, для удаления Na+ из цитоплазмы либо в апопласт, либо в вакуоль [Niu 1995]. Ыа+/Н+-антипортеры растений представляют собой мембранные белки, имеющие сходные структуру и функции. Это было установлено в опытах, проведенных в гетерологичной системе дрожжей и в опытах по сверхэкспрессии На+/Н+-антипортеров в растениях [Zhang & Blumwald 2001]. Однако каковы особенности работы ионных транспортеров при солевом стрессе в разных по солеустойчивости сортах сельскохозяйственно-ценных культур еще до конца не иследован.
Ранее в нашей лаборатории были охарактеризованы по солеустойчивости и накоплению ионов Na+ и К+ несколько контрастных сортов ячменя, и возник вопрос, существует ли взаимосвязь между полученными данными и функционированием ионных транспортеров. Калий в растительной клетке, как известно, является основным ионным осмотиком и расположен в двух пулах: вакуолярном и цитоплазматическом. Вакуоль в растительной клетке занимает гораздо больший объем, чем цитозоль и вакуолярный калий необходим для генерации клеточного тургора при росте клеток, однако, при повышенных концентрациях NaCl, функция калия в осмотической адаптации частично переходит ионам натрия. Ионы калия поступают в вакуоль по каналам и транспортерам, в том числе и при работе К+/Н+-антипортеров. Так, в томатах был идентифицирован вакуолярный К+/Н+-антипортер и установлены его функции [Venema et al. 2003], но ничего не известно об особенностях его экспрессии и его роли в солеустоичивости растений. В настоящей работе внимание было уделено идентификации гомолога К+/Н+-антипортера томатов в ячмене и изучение его экспрессии в контрастных по солеустоичивости сортах ячменя при повышенных концентрациях NaCl в среде, а также исследованию особенностей функционирования ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта в разных органах растений ячменя при различной сортовой солеустоичивости.
Функционирование На+/Н+-антипортеров в животных клетках
Ка+/Н+-антипортер плазмалеммы животных клеток для переноса протона из клетки использует градиент ионов натрия, генерируемый Na+,K+-ATOa3oft. Удаление избытка внутриклеточного Н+ в обмен на внеклеточный Na+ для поддержания оптимального рН цитоплазмы - наиболее эффективный способ для предотвращения накопления избытка кислот в клетках с высоким уровнем метаболизма. Помимо этого, работа Ыа+/Н+-антипортера необходима для поддержания клеточного объема и формы. Эти функции выполняет семейство изоформ №+/Н+-антипортера (NHE1-9), которые играют ключевые роли в таких клеточных процессах, как пролиферация, миграция, трансэпителиальный ионный транспорт, регуляция генной экспрессии и клеточный метаболизм [Wakabayashi et al. 1997]. Гомология между аминокислотными последовательностями NHE1-9 составляет 30-65%. Изоформы различаются профилем внутриклеточной локализации (табл. 1.3), чувствительностью к амилориду, катионной селективностью, и кинетическими параметрами ионного обмена. Экспрессиру-ются изоформы в разных тканях и органах, а также на разных стадиях онтогенеза [Lin et al. 2003].
Из таблицы 1.3 видно, что NHE1 экспрессируется во всех тканях и играет решающую роль в поддержании цитоплазматического рН [OrlowsKi & Grinstein 1997]. NHE2 и NHE4 экспрессируются в тканях почек и желудочно-кишечного тракта [Hoogerwerf et al. 1996, Pizzonia et al. 1998]. Экспрессия NHE3 [Biemesderfer et al. 1993] и NHE8 [Goyal et al. 2003] приурочена к апикальной мембране эпителиальных клеток почечных проксимальных трубок. NHE3 необходим для реабсорбции Na+ и НСОз", что способствует поддержанию осмотического и кислотно-щелочного баланса крови. NHE5 экспрессируется в тканях мозга и, как полагают, регулирует рН в нейронах [Klanke et al. 1995]. NHE6 экспрессируется в тканях сердца, мозга, и скелетных мышц [Numata et al. 1998]. Изоформы NHE1-5 расположены в плазматической мембране [Ritter et al. 2001], NHE6 - в мембранах митохондрий, NHE7, NHE8, NHE9 - в мембранах аппарата Гольджи и эндосомах [Nakamura et al. 20056]. Установлено также, что в зависимости от эндогенных и экзогенных факторов изменяется распределение Na+/H+-aiiTHпортера по поверхности клетки [Dunklebarger et al. 2004]. Между начальной скоростью Иа+/Н+-обмена и увеличивающимися концентрациями Na+ существует гиперболическая зависимость. Ыа+/Н+-обмен подчиняется кинетике насыщения Михаэлиса-Мэнтен. Км (Na+) для большинства изоформ NHE1- NHE3 составляет 3-50 мМ [OrlowsKi 1993]. NHE чувствительны к изменениям внутриклеточного рН, в отличие от Na+/H+-антипортеров растений и дрожжей. При физиологических значениях рН цитозоля NHE1 и NHE2 инактивированы, а при снижении рН Na+/H+- обменная активность возрастает. По поводу этой зависимости существует точка зрения Aronson с соавт. (1982) о том, что чувствительность NHE к изменению рН цитоплазмы может быть связана с наличием «Н+-сенсора», расположенного в трансмембранном сегменте. 1Ма+/Н+-обменная активность разных изоформ NHE в неодинаковой степени чувствительна к ингибированию амилоридом. Наиболее чувствительны NHE1 и NHE2, почти не ин-гибируются NHE5 и NHE3 [Counillon et al. 1993]. Установлено, что плазмалеммарный Ка+/Н+-антипортер животных клеток функционирует в качестве структурного «якоря» для прикрепления акатинового цитоскелета через комплекс актин-связывающих белков [Denker et al. 2000] и в качестве «скаффолда» для сборки сигнальных цепей в специализированных доменах плазмалеммы [Baumgartner et al. 2004]. Активность NHE1 регулируется различными эндогенными и экзогенными сигналами, в том числе гормонами и факторами роста, которые связываются рецепторами плазматической мембраны. Сигнал с рецептора передается на каскад протеинкиназ, которые фосфори-лируют определенные сайты в С - терминальном цитоплазматическом домене Na+/H+-антипортера [Wakabayashi et al. 1992, Winkel et al. 1993]. Другой способ регуляции Ыа+/Н+-антипортера заключается в связывании с ним регуля-торных белков. Известны негативные и позитивные регуляторы активности NHE1. Известно, что Са2+-зависимый связывающий белок - кальмодулин взаимодействует с аутоингиби-торным доменом NHE1 [Wakabayashi et al. 1994]. Са2+-связывающий белок СНР [Lin & Barber 1996] и 14-3-3 белки [LeBoux et al. 2001] взаимодействуют с С-терминальным доменном антипортера. Большой научный интерес представляет собой идентификация сигнальных цепей регулирующих активность NHE1. Факторы роста активируют NHE1 посредством классического Ras-ERK каскада (рис. 1.9). Установлено, что «нижележащие» эффекторы Ras, включая Raf, МЕК, ERK (р42/44 МАРК) передают сигнал на серин/треонин протеин-киназу р90, которая фосфор ил ирует NHE1 [Bianchini et al. 1997, Moor & Fliegel 1999]. Регуляция активности NHE1 осуществляется также через сигнальный каскад, состоящий из рецептора сопряженного с G-белками, низкомолекулярной ГТФазы RhoA и RhoA-серин-протеинкиназы [Hooley et al. 1996, Tominaga et al. 1998]. Увеличение транспортной активности NHE1 наблюдается и при гиперосмотическом стрессе в ответ на сжатие клетки, что необходимо для восстановления формы и объема. Krump с соавт. (1997) обнаружили, что активация NHE1 происходит вследствие уменьшения размера клетки, и не индуцируется ни стрессом, ни изменением ионной силы среды. Один из возможных механизмов объясняющих такое явление связан с активацией NHE1 через динамические изменения в актиновом цитоскелете. Показано, что взаимодействие NHE1 с актиновым цитоскелетом сказывается на его распределении в мембране и существенно для модуляции транспортной активности NHE1 [Shrode et al. 1995, Denker et al. 2000].
Следует отметить наличие близкого структурного сходства плазмалеммарных Na+/H+-антипортеров NHE1 и SOS1 растений. По всей видимости, длинный С - терминальный домен SOS1 Arabidopsis thaliana потенциально может быть вовлечен в подобного рода взаимодействия с цитоскелетом, хотя это предположение, несомненно, требует экспериментальных доказательств.
Клетки дрожжей имеют интегрированные защитные механизмы, которые позволяют этому организму выжить в условиях постоянного или транзиентного солевого стресса. Один из таких механизмов - поддержание низких концентраций ионов натрия в клетках. Na+ -АТФазе (ENA1/PMR2A) приписывают первостепенное значение в этом процессе. Другой белок - Ма+/Н+-антипортер NHA1 плазматической мембраны осуществляет не только удаление Na+ из клеток S. cerevisiae, но и регулируют рН и калиевый гомеостаз цитоплазмы [Наго et al. 1991, Prior et al. 1996, Banuelos et al. 1998]. Ыа+/Н+-антипортер NHX1 удаляет Na+ из цитоплазмы дрожжей в превакуолярный компартмент и обеспечивает осмотическую адаптацию при внезапном гиперосмотическом стрессе, что подтверждено в работах по мутации гена Nhxl [Nass et al. 1997, Nass & Rao 1999]. Оказалось, что функционирование NHX1 существенно для везикулярного транспорта белков [Bowers et al. 2000, АН et al. 2004, Brett et al. 2005] и, как полагают, это осуществляется посредством регулировки рН транспортных везикул и эндосом. Помимо систем удаления Na+ из цитоплазмы, поддержание ионного гомеостаза при солевом стрессе в S.cerevisiae осуществляется путем снижения поступления Na в клетки через модуляцию селективности и кинетики калиевых транспортеров TRK1 и TRK2, которые «переключаются» с низкоаффинного поглощения К+ и Na+ на высокоаффинное поглощение К+ при солевом стрессе [Gomez et al. 1996].
Регуляция экспрессии Ыа+/Н+-антипортеров на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях
Согласно результатам ряда работ, С-терминальный домен Ш+/Н+-антипортеров влияет на катионную селективность и транспортную активность. По данным Yamaguchi с соавт. (2003), в результате делеции С-терминального домена AtNHXl в 2 раза увеличалась скорость №+/Н+-обмена и менялось соотношение К+/Н+- и №+/Н+-обмена. Частичная делеция и замещение длинного С-терминалыюго домена привела к значительному ингибированию транспортной активности и изменению катионной селективности бактериальных Na+/H+-антипортеров [Hamada et al. 2001а, Waditee et al. 2001]. Таким образом, вышеприведенные факты дают основание полагать, что транспортная активность №+/Н+-антипортеров может регулироваться путем внесения ковалентных модификаций в определенные сайты аминокислотной последовательности С-терминального домена. Известно, что в результате фосфо-рилирования аминокислотных остатков серина, треонина, тирозина С-терминалыюго домена модулируется транспортная активность Ыа+/Н+-антипортеров в животных клетках, что сопровождается изменением кинетических параметров №+/Н+-обмена [Wakabayashi et al. 1997]. Аналогичный способ регуляции обнаружен у растений. Показано, что при измерении ионного обмена в системе мембранных везикул плазмалеммы листьев Arabidopsis thaliana, добавление в среду измерения SOS2 - серин-треонин протеинкиназы привело к увеличению Vmax №+/Н+-обмена в 2,5 раза [Qiu et al. 2003]. Кроме того, наблюдалось восстановление вакуолярного №+/Н+-обмена в sos2 мутантах до уровня обнаруженного в везикулах тоно-пласта, выделенных из растений дикого типа [Qiu et al. 2004]. Эти два исследования свидетельствуют в пользу того, что протеинкиназа фосфорилирует Ка+/Н+-антипортеры и, соответствешю, регулирует их транспортную активность. Мотивы фосфорилирования протеин-киназой SOS2 в последовательности плазмалеммарного и вакуолярного Na+/H+-антипортеров Arabidopsis thaliana пока не идентифицированы, но как полагают авторы, они расположены в С-терминальных доменах. Кроме посттрансляционных модификаций анти-портеров, их транспортная активность может регулироваться также при взаимодействии ре-гуляторных белков с С-терминальным доменом.
Вакуолярный Na+/H+-anranopTep дрожжей NHX1 - Saccharomyces cerevisiae содержит предполагаемый N- терминальный автоингибиторный домен, поскольку он не является сигнальным пептидом и отсутствует в гомологе AtNHXl Arabidopsis thaliana [Darley et al. 2000]. Более того, удалось экспериментально доказать вовлечение N- терминального авто-ингибиторного домена в регуляцию транспортной активности вакуолярного Са2+/Н+-антипортера растений (САХ) [Pittman & Hirschi 2001]. Надо полагать, что похожий процесс регуляции характерен и для Ма+/Н+-антипортеров.
Накопление мРНК является результатом двух процессов: активации транскрипции генов и ингибирования деградации мРНК. Активация транскрипции Na+/H+-airranopTepa связана с наличием в промотере соответствующего гена цис-элементов, которые связывают транскрипционные факторы, активируемые стрессом. Наиболее подробно был изучен промотер гена NHE1, кодирующего плазмалеммарный Na+/H+-anranopTep животных клеток. Промотер содержит сайты связывания рецепторов стероидных гормонов и транскрипционных факторов. Взаимодействие транскрипционных факторов с промоте-ром гена NHE1 было подтверждено косвенно - по увеличению количества мРНК NHE1 в ответ на воздействие форболовыми эфирами, глюкортикоидами, тироидными гормонами [Miller et al. 1991]. В промотере гена AtNHXl - вакуолярного Na+/H+-aHTHпортера Arabidopsis thaliana есть регуляторный элемент (ABRE), ответственный за АБК-зависимую регуляцию генной экспрессии. Показано, что количество транскриптов AtNHXl возрастает как при солевом стрессе, так и при воздействии экзогенной АБК (табл. 1.8). Экспрессия этого гена не менялась в sos мутантах арабидопсиса, что означает отсутствие контроля со стороны SOS - сигнального каскада [Shi et al. 2002], который вовлечен в регуляцию экспрессии гена SOS1, кодирующего плазмалеммарный Ыа+/Н+-антипортер [Shi et al. 2000]. В растениях транскрипционные факторы, активирующие транскрипцию генов Na+/H+ аптипортеров, пока не идентифицированы. Напротив, в бактериях известен позитивный белок-активатор (nhaR) транскрипции гена №+/Н+-антипортера плазматической мембраны. Показано, что nhaR одновременно функционирует еще и в качестве сенсора внутриклеточного Na+ [Padan et al. 2001]. Посттранскрипционный контроль - один из важных механизмов регуляции экспрессии генов стрессоустойчивости [Battels et al 1992, Hua et al. 2001] и может иметь место при регуляции стабильности мРНК и регуляции эффективности трансляции мРНК №+/Н+-антипортера. Однако до сих пор ничего не известно о наличии таких механизмов.
В таблице 1.8 показаны изменения экспрессии генов №+/Н+-антипортеров растений в ответ на разные стрессоры. Количество мРНК №+/Н+-антипортеров увеличивается в разных органах растений в ответ на гиперосмотический стресс, обработку АБК, КС1 и NaCl в 2,3-4,2 раза по сравнению с контролем. Из таблицы 1.8 также видно, что при солевом стрессе (NaCl) экспрессия разных изоформ вакуолярного антипортера кукурузы ZmNHXl-б характеризуется органно-специфичностыо. Помимо вышеперечисленных стрессовых воздействий, экспрессия гена вакуолярного №+/Н+-антипортера NHX1 возрастала при тепловом шоке, но обработка этиленом или УФ-радиция не оказывали никакого влияния на экспрессию [Porat et al. 2002].
О количественных изменениях белка №+/Н+-антипортера при стрессах имеются пока немногочисленные данные. Тем не менее, показано, что количество вакуолярного №+/Н+-антипортера AgNHXl и BvNHXl возрастает при солевом стрессе (NaCl), что, видимо, можно объяснить увеличением накопления транскриптов соответствующего гена при солевом стрессе (табл. 1.8). Увеличение количества белка Ма+/Н+-антипортера при солевом стрессе наблюдалось также в клетках дрожжей [Nass & Rao 1998], что говорит, вероятно, о сходной регуляции экспрессии На+/Н+-антипортеров эукариот.
Фракционирование мембран ячменя центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
Идентифицированный в наших исследованиях фрагмент предполагаемого вакуолярного К+/Н+-антипортера ячменя назвали HvNHX4. Профиль гидрофобности HvNHX4, приведенный на рисунке 3.15, совпадает с общими представлениями о структуре кати-он/протон-антипортеров растений, животных, дрожжей: N-терминальный гидрофобный мембранный домен и С- терминальный гидрофильный домен, обращенный в цитоплазму. Как показано в табл. 3.5 и на рисунке 3.18, аминокислотная последовательность HvNHX4 имеет высокую гомологию и близкородственна К+/Н+-антипортеру томатов (LeNHX2) и предполагаемым К+/Н+-антипортерам арабидопсиса (AtNHX5 и AtNHX6), и в значительно меньшей степени гомологична и отдаленно - родственна двум изоформам вакуолярного На+/Н+-антипортера ячменя HvNHXl и HvNHX2, а также вакуолярному Na+/H+-антипортеру арабидопсиса (AtNHXl).
Вакуолярные Na+/H+- и К+/Н+-антипортеры растений, принадлежащие к семейству NHX - родственных белков, к которым, согласно выравниванию аминокислотных последовательностей (рис. 3.16) и филогенетическому анализу (рис. 3.18) принадлежит HvNHX4, обладают разной селективностью к катионам. Вакуолярный Ыа+/Н+-антипортер Arabidopsis thaliana AtNHXl, отдаленно-родственный HvNHX4, при экспрессии в дрожжах и последующей реконструкции его в протеолипосомах обменивал К+ и Na+ с Н+ с одинаковой эффективностью [Venema et al. 2002]. Таким же способом исследовали К+/Н+-антипортер томатов LeNHX2, который близкородственен HvNHX4. Как оказалось, LeNHX2 катализировал К+/Н+-обмен, значительно эффективнее, чем Na+/H+-o6MeH [Venema et al. 2003]. Учитывая высокую гомологию HvNHX4 с уже известным вакуолярным К+/Н+-антипортером томатов и что К+ является основным катионом растительных клеток, можно полагать, что функциональная активность HvNHX4 связана с вакуолярным К+/Н+-обменом не только в нормальных, но и, возможно, при стрессовых условиях водного дефицита. Однако, вполне вероятно допустить, что при повышенных концентрациях ионов натрия в клетке в условиях солевого стресса, HvNHX4 мог бы транспортировать как К+, так и Na+ в вакуоль в обмен на протон.
Как видно из выравнивания аминокислотных последовательностей HvNHX4 и К+/Н+-антипортеров AtNHX5, AtNHX6, LeNHX4 (рис. 3.16а) наблюдается значительная консервативность N-гидрофобного домена и вариабельность С-терминального домена этих белков. Wiebe с соавт. (2003) установлено, что в результате мутагенеза консервативных аминокислотных остатков в N-гидрофобном домене полностью аннулировалась функция ионного обмена бактериального Na+/H+-airranopTepa, что дает основания полагать о вовлечении этого домена в транспортные функции. Предполагается, что с С-терминальным доменом связана регуляция транспортной активности и катионной селективности Na+/H+-aiiTHnopTepOB [Wakabayashi et al. 1997, Hamada et al. 2001a, Waditee et al. 2001]. Интересно отметить, что высокая степень вариабельности С-терминальных доменов разных изоформ вакуолярного Ш+/Н+-антипортера ячменя (HvNHXl, HvNHX2) и идентифицированного нами предполагаемого К+/Н+-антипортера (HvNHX4), по-видимому, указывает на наличие специфической регуляции активности этих ионных транспортеров в разных типах клеток и тканей растения. По всей вероятности, такой способ регуляции мог бы иметь существенное значение для координации функционирования ионных транспортеров тонопласта в растениях ячменя при повышенных концентрациях NaCl.
Относительно ориентации С-терминального домена вакуолярного Na+/H+- антипортера растений существуют противоположенные точки зрения. Во-первых, комшотерный анализ профиля гидрофобности Ыа+/Н+-антипортера из всех видов растений свидетельствует о том, что С-терминальный домен обращен в цитоплазму. Во-вторых, Yamaguchi с соавт. (2003) показали, что С-терминальный домен AtNHXl, экспрессированного в гете-рологичной системе дрожжей был обращен в вакуоль. В-третьих, этим данным противоречат результаты, полученные Qiu с соавт (2004). Авторами было установлено, что антитела, полученные на фрагмент С-терминалыюго домена AtNHXl, ингибировали Na+/H+-обменную активность в системе мембранных везикул тонопласта, что указывает на ориентацию С-терминального домена вакуолярного №+/Н+-антипортера в цитоплазму. Последний результат, по всей вероятности, точнее отражает укладку Ыа+/Н+-антипортера in vivo. В связи с этим, надо полагать, что специфика укладки этого ионного транспортера в дрожжах может несколько отличаться от реальной.
В наших исследованиях для определения внутриклеточной локализации HvNHX4 проводили фракционирование микросомальных мембран корней ячменя в линейном градиенте плотности сахарозы (рис. 3.20). Результаты иммунодетекции HvNHX4 свидетельствуют о его локализации этого белка, главным образом, во внутриклеточных мембранах (тонопласт, мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи). С какими точно функциями связан такой профиль внутриклеточной локализации остается пока неизвестным. Есть основания полагать, что локализация HvNHX4 в вакуолярных мембранах тесно связана с функцией компартментации К+ и (или) Na+ в вакуоль, посредством К+/Н+- и (или) Na+/H+-обмена, поскольку по литературным данным известно, что гомологи HvNHX4 - LeNHX2 и AtNHXl имеют похожий профиль внутриклеточной локализации и расположены в вакуо-лярных мембранах и осуществляют Na+/H+- и К ТіҐ -обмен [Apse et al. 1999, Venema et al. 2002, Venema et al. 2003].
Недавно была выявлена роль Ка+/Н+-антипортера дрожжей (NHX1) и человека (NHE7) в везикулярном транспорте белков [Nass & Rao 1998, Numata & Orlowski 2001, Brett et al. 2002]. Установлено, что Ыа+/Н+-антипортер дрожжей локализуется в мембранах превакуо-лярного компартмента и эндосомах, a Na+/H+-anranopTep человека расположен в рецирку-лирующих эндосомах и мембранах аппарата Гольджи. Генетические исследования показали, что unhxl мутанты дрожжей имеют нарушенную сортировку клеточных белков, тем самым, подтверждая необходимость NHX1 для везикулярного трафика белков [Bowers et al. 2000]. Не исключено, что присутствие HvNHX4 во фракциях внутриклеточных мембран может быть связано с ее участием в везикулярном транспорте, сопряженным с регуляцией рН внутри транспортных везикул и эндосом. На такую возможность указывает и такой факт, что кислый рН внутри везикул требуется для созревания и процессинга секретируемых белков, диссоциации и рециркулирования материала в эндосомах, белок-белковых взаимодействий [Ali et al. 2004]. Локализация HvNHX4 во фракциях соответствующих плазматическим мембранам (рис. 3.20), вероятно, обусловлена контаминацией другими клеточными мембранами.
Согласно установленному нами профилю внутриклеточной локализации HvNHX4, надо полагать, что этот белок вовлечен не только в компартментацию катионов в вакуоль посредством К+/Н+ или Ыа+/Н+-обмена и осмотическую адаптацию, но и, потенциально, может быть вовлеченным в регуляцию катионного гомеостаза и внутреннего рН органелл (эндо-плазматического ретикулума и аппарата Гольджи). С другой стороны, локализация HvNHX4 в этих двух органеллах может быть обусловлена просто транзитом HvNHX4 по секреторному пути.
Измерение пассивной проницаемости везикул для протонов и АТФ-гидролазной активности
Км (Na+) вакуолярного Na+/H+-o6Mena составляет 4-12 мМ (табл. 1.4), что соответствует физиологическим, хотя и пороговым концентрациям Na+ в цитозоле [Binzel et al. 1998]. Км (Na+) для плазмалеммарного Ш+/Н+-обмена составляют 13-22 мМ (табл. 1.4), что в 2-4 раза выше, чем для вакуолярного. Очевидно, что разная аффинность к Na+ для Na+/H+-обмена может означать наличие координации в работе ионных транспортеров, например, при разных концентрациях Na+ в цитозоле. Возможно предположить, что плазмалеммарный №+/Н+-антипортер «включается» по мере снижения способности к заполнению клеточных вакуолей Na+ при работе вакуолярного Ш+/Н+-антипортера в клетках проростков ячменя.
В наших исследованиях, Км (Na+) для плазмалеммарного №+/Н+-обмена в корнях сорта Эло (табл. 3.4) не превышает Км (Na+) Arabidopsis thaliana (22 мМ) [Qiu et al. 2003]. Км (Na+) для вакуолярного №+/Н+-обмена (табл. 3.4) оказалась в 3-4 раза больше, чем ранее опубликованная для Hordeum vulgare (9 мМ) [Garbarino & DuPont 1988] и меньше, чем у Mesembryanthemum crystallinum (51 мМ) [Barkla et al. 1995]. Между тем, сродство вакуолярного №+/Н+-антипортера ячменя к Na+ выше, чем к К+ (табл. 3.4), что указывает на наличие селективности вакуолярной компартментации при избытке Na+ в цитозоле. Поскольку между Км (Na+) для плазмалеммарного и вакуолярного Na+/H+-o6Mena отсутствует статически достоверная разница (табл. 3.4), то можно полагать, что оба механизма удаления Na+ из ци-тозоля функционируют в устойчивом сорте ячменя Эло параллельно в ответ на повышение NaCl в цитозоле.
Диссипация ДрН в везикулах тонопласта не только в присутствие Na+, но и К+ (рис. 3.10) указывает на транспорт этих ионов в вакуоль посредством работы вакуолярного К+/Н+-антипортера ячменя. Blumwald и Poole (1985) показали, что помимо Na+/H+- обмена в везикулах тонопласта, выделенных из суспензионной культуры Beta vulgaris имел место К+/Н+-обмен. Напротив, в работе Rams и соавт. (2002) в листьях Salicornia bigelovii был идентифицирован только вакуолярный №+/Н+-обмен, но отсутствовал К+/Н+-обмен. Согласно результатам, полученным в настоящей работе, при солевом стрессе наблюдалась активация вакуолярного К+/Н+-обмена в листьях сорта Эло по сравнению с контролем (рис. 3.10). Vmax К7Н+-обмена возрастала почти в два раза, а Км (К+) существенно не менялась при солевом стрессе (табл 3.4). Поскольку Км (К+) для К+/Н+-обмена не менялась при стрессе, а Vmax увеличивалась, то это позволяет сделать предположение об увеличении количества молекул белка и/или увеличение числа оборотов вероятного вакуолярного К+/Н+- антипортера ячменя. К+/Н+-обмен в везикулах тонопласта листьев сорта Белогорский почти не менялся при солевом стрессе (рис. 3.10). Следует отметить, что накопление К+ в наземной части сорта Эло было выше, чем в сорте Белогорский [Леонова и др. 2005], что коррелирует, в свою очередь, с параллельной активацией V-АТФазы и К+/Н+-обмена в сорте Эло. Наши данные согласуются с результатами Pitman и соавт. (1981), которыми было показано, что содержание К+ в вакуолях клеток ячменя возрастало в 7-8 раз при сильном засолении.
Итак, по результатам наших экспериментов нашла свое подтверждение исходная гипотеза о наличии взаимосвязи между содержанием Na+ и К+ в проростках контрастных по со-леустойчивости сортах ячменя и функциональной активностью ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта в условиях повышенных концентраций NaCl.
Клеточная вакуоль может выполнять функцию резервуара для ионов калия, а значит, содержание К+ в цитозоле поддерживается относительно постоянным за счет мобилизации вакуолярного К+. При продолжительном солевом стрессе постепенно нарастает дефицит К+ в цитозоле клеток, вызванный за счет блокирования ионами натрия калиевого транспортера плазмалеммы НКТ1 [Rus et al. 2004] и утечкой К+ из клетки в апопласт через калиевые каналы, открывающиеся при индуцируемой ионами натрия деполяризации мембранного потенциала плазмалеммы [Murata et al.1998]. Надо полагать, что в этих условиях концентрация ионов калия в цитозоле поддерживается достаточно высокой из-за выхода К+ из вакуолярного пула через SV- каналы [Leigh & Wyn Jones 1984, Ivashikina & Hedrich 2005].
Компартментация K+ в вакуолях - обычная ситуация динамического состояния при росте клеток растяжением, необходимая для поступления воды в клетку. Увеличиваясь в объеме, вакуоль прижимает цитозоль к клеточной стенке, создавая тем самым тургорное давление, которое необходимо для поддержания формы и объема отдельных клеток, и затем целых тканей [Morgan 1983]. Другое назначение вакуолярного К+/Н+-антипортера ассоциируется с регуляцией концентрации К+ в цитоплазме [Leigh & Wyn Jones 1984], а возможно и для «тонкой» регулировки рН цитозоля или вакуоли. Совершенно очевидно, что компартментация К+ в вакуоль необходима и для осмотической адаптации клеток в условиях водного дефицита при таких стрессах как засоление и засуха.
Полученные результаты свидетельствуют об ингибировании амилоридом вакуолярного №+/Н+-обмена и отсутствии влияния на вакуолярный К+/Н+-обмен (рис. 3.13). По-видимому, вакуолярный К+/Н+-обмен в везикулах листьев ячменя осуществляет вакуолярный К+/Н+-антипортер. Однако, мы не обнаружили взаимосвязи между активацией амило-рид-нечувствителыюго вакуолярного К+/Н+-обмена в везикулах, выделенных из листьев сорта Эло и количественными изменениями белка предполагаемого вакуолярного К+/Н+-антипортера ячменя HvNHX4 в мембранах. Этот факт объясняется тем, что К+/Н+-обмен могут осуществлять изоформы вакуолярного Na+/H+-anranopTepa ячменя, которые помимо Na+, возможно, селективны еще и к К+, но в разной степени чувствительные к амилориду. С другой стороны, могут функционировать иные К+/Н+-антипортеры в аминокислотной последовательности которых отсутствует амилорид-связывающий домен, и, следовательно, нечувствительных к амилориду. Так, в Arabidopsis thaliana было идентифицировано новое мультигенное семейство катион/протон антипортеров (СНХ). Белок AtCHX17 (Асе. No. NP 194101) экспрессируется в вегетативных частях растений и, как полагают, является К+/Н+-антипортером и участвует в осмотической адаптации клеток растений [Cellier et al. 2004].
Проведенные исследования позволяют предложить схему функционирования ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта на уровне целого организма при солевом стрессе в двух сортах ячменя, отличающихся по устойчивости к высоким концентрациям NaCl(pnc. 5.1).
При солевом стрессе в устойчивом сорте ячменя Эло V-АТФаза регулируется путем увеличения сопряжения между транспортом протонов и гидролизом АТФ в клетках корней и листьев. Следствием этого является генерация большей величины ДрН на тонопла-сте, что приводит к повышению эффективности функционирования Ма+/Н+-антипортеров - для компартментации токсичных ионов натрия в вакуоль, но без дополнительных затрат АТФ.
