Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Структурно-функциональная организация генома растений
1.1. Уникальные последовательности генома растений
1.2. Характеристика основных семейств генов растительного генома
1.2.1. Семейство генов устойчивости растений
1.2.2. Семейство MADS-box генов
1.2.3. Семейство генов протеинкиназ растений
1.3. Повторяющиеся последовательности генома растений
1.3.1. Фракция высокоповторяющейся ДНК
1.3.2. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: гены рРНК и их спейсерные участки
1.3.3. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы генома растений
1.4. Молекулярные методы анализа растительного генома
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 81
3.1. Анализ геномного полиморфизма представителей трех родов сем. Solanaceae 81
3.1.1. Молекулярное маркирование генома методами AFLP-, RAPD- и ISSR анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum L
3.1.1.1. Анализ межвидового и внутри видового полиморфизма представителей рода Solanum методом AFLP
3.1.1.2. Анализ межвидового и внутривидового полиморфизма представителей рода Solanum методом RAPD 85
3.1.1.4. Анализ генома представителей рода Solanum методом ISSR маркирования межмикросателлитных последовательностей
3.1.1.5. Определение филогенетических отношений представителей рода Solanum 91
3.1.1.6. Выявление межсортового полиморфизма у представителей Solanum: AFLP-, RAPD- и ISSR-маркирование сортов картофеля (S. tuberosum) и RAPD анализ сортов баклажана (S. melongena) 95
3.1.1.7. Молекулярный анализ фрагментов RAPD-спектра генома картофеля
3.1.1.7. Влияние одиночной замены в праймере на перекрываемость спектров RAPD- фрагментов
3.1.7.2. Анализ молекулярной природы полученных RAPD фрагментов 106
3.1.2. Молекулярное маркирование генома методами RAPD-, AFLP- и ISSR-анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon (Tourn.)Mill. 108
3.1.2.1. Опре деления генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом RAPD 111
3.1.2.2. RAPD-анализ сортов культивируемого томата Lycopersicon esculentum 112
3.1.2.3. Опре деление генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon. методом ISSR 118
3.1.2.4. Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом AFLP
3.1.2.5. Таксономические и филогенетические взаимоотношения у дикорастущих и культивируемых видов Lycopersicon, выявляемые при использовании RAPD-, AFLP- и ISSR- маркирования генома 120
3.1.3. Молекулярное маркирование генома RAPD-, AFLP- и ISSR- методами и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Capsicum L.
3.1.3.1. Анализ межвидового полиморфизма видов и сортов рода Capsicum методом AFLP 124
3.1.3.2. Анализ внутривидового полиморфизма у Capsicum, выявляемого методом AFLP 130
3.1.3.3. Использование AFLP-системы молекулярного маркирования для определения филогении видов рода Capsicum. 133
3.1.3.4. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum RAPD-методом
3.1.3.5. RAPD-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении рода Capsicum 1 „
3.1.3.6. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum методом ISSR- маркирования межмикросателлитных последовательностей
3.1.3.7. ISSR-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении видов рода Capsicum
3.1.3.8. Использование систем молекулярного маркирования для определения таксономически спорных образцов генетических коллекций Capsicum
3.1.3.9. Комплексный анализ генетического разнообразия видов Capsicum chinense и Capsicum frutescens с использованием AFLP-, RAPD-, ISSR- систем молекулярного маркирования 1, т
3.1.3.10. Комплексный анализ генома рода Capsicum с использованием AFLP-, RAPD- и ISSR-систем молекулярного маркирования. 158
3.2. Молекулярный анализ основных адаптивно значимых семейств генов (генов резистентности, MADS-box генов и генов, кодирующих протеинкиназы) у представителей сем. Solanaceae 166
3.2.1. Разработка метода DDP-маркирования генома.
3.2.1.1. NBS-маркирование семейства генов резистентности (R-генов и RGAs)
3.2.1.2. MADS- маркирование семейства гомеозисных генов и РК- маркирование семейства генов серин-треониновых протеинкиназ.
3.2.2. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Solanum
3.2.2.1. Определение полиморфизма семейства генов резистентности у сортов картофеля европейской и отечественной селекции
3.2.3. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Capsicum
3.2.3.1. Общая характеристика полиморфизма RGA-фрагментов видов перца, выявленного при использовании метода NBS- маркирования 182
3.2.3.2. Использование метода NBS-маркирования для определения филогении RGA-семейства последовательностей у Capsicum 184
3.2.3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных RGA-фрагментов генома Capsicum 186
3.2.4. Молекулярный анализ семейства MADS-box генов и их аналогов у представителей рода Capsicum 187
3.2.4.1. Использование метода MADS-маркирования для определения филогении семейства MADS-содержащих последовательностей генома Capsicum 190
3.2.5. Молекулярный анализ семейства генов, кодирующих серин- треониновые протеинкиназы у представителей рода Capsicum
3.2.5.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных РК- фрагментов 192
3.3. Разработка метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе 198
3.3.1. Использование метода TAIL PCR для анализа эмбрио-дефектной летальной мутации, вызванной инсерцией мобильного элемента
3.4. Исследование нуклеотидного полиморфизма гена 5.8S и транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК у представителей сем. Solanaceae
3.4.1. Анализ последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных последовательностей рибосомной ДНК у видов рода Solatium и Lycopersicon 208
3.4.2. Анализ последовательности ITS1-5.8S-ITS2 рибосомной ДНК у видов рода Capsicum 213
3.5. Детекция SNP в генах Lycopersicon esculentum и Soliumт tuberosum и SNP-маркирование генома сортов картофеля 226
3.5.1. Выявление SNP в генах томата, картофеля и перца 2?7
3.5.2. Использование SNP для маркирования сортов S. tuberosum генома и определения аллельного статуса методом пиросеквенирования 229
3.6. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома Solanaceae 235
3.6.1. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов картофеля 235
3.6.2. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов перца.
3.7. Молекулярный анализ хлоропластного генома представителей родов Solanum, Lycopersicon и Capsicum
3.7.1. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК сортов картофеля 250
3.7.2. Анализ микросателлитных локусов хлоропластной ДНК сортов картофеля 256
3.7.3. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома представителей родов Capsicum и Lycopersicon 260
Заключение 267
Выводы 273
Список литературы 276
- Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы генома растений
- Влияние одиночной замены в праймере на перекрываемость спектров RAPD- фрагментов
- Использование систем молекулярного маркирования для определения таксономически спорных образцов генетических коллекций Capsicum
- Использование метода TAIL PCR для анализа эмбрио-дефектной летальной мутации, вызванной инсерцией мобильного элемента
Введение к работе
Семейство Solanaceae является одним из самых представительных семейств двудольных растений и, кроме того, включает виды, являющиеся основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель, томат и перец, относящиеся к трем основньш родам семейства Solatium, Lycopersicon и Capsicum.
Род Solanum является самым многочисленным из родов семейства Solanaceae. Картофель (Solanum tuberosum) и родственные ему дикорастущие и культивируемые клубнеобразующие виды Solanum объединены в подсекцию Potatoe, которая, была подразделена на 19-25 серий (Юзепчук, 1938, Букасов, 1955, 1980, Жуковский 1964, Букасов, Камераз, 1972, Hawkes, 1990, 1994). Такая классификация основывалась прежде всего на морфо-физиологических данных и / или географии распространения видов, а также подразумевала наличие филогенетических отношений между видами, составляющими одну серию. Проводимая в последнее время ревизия и значительное расширение коллекций образцов видов Solanum выявили существенные проблемы, связанные с определением уровней биоразнообразия и филогенетических связей, а также установлением границ для видов и серий видов (Spooner, Castillo, 1997, Spooner, Hijmans, 2001, van der Berg et al, 2002). Для выявления спорных таксономических вопросов и более полной характеристики вида и серии видов рекомендовалось использовать молекулярные методы маркирования генома. Использование методов молекулярного анализа хлоропластной и ядерной ДНК картофеля показало часто встречающееся объединение в одну серию неродственных видов (Hosaka, 1996, Spooner, Castillo, 1997, Kardulos et al., 1998, Brayen et al., 1999, van der Berg et al., 2001). До настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне ясным, также не были проведены оценки межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений между сериями видов.
Несмотря на небольшое количество видов, составляющих род Lycopersicon (9-11), классификация томатов до сих пор окончательно не разработана. Исходно таксономия рода Lycopersicon базировалась на морфологических (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999), цитологических (Rick, Yoder, 1988), а так же биохимических (Rick, 1983, Rick, Yoder, 1988) характеристиках, на основании которых было предложено несколько классификаций рода (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999). Однако также как и в случае с родом Solanum, до настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне определенным.
Перец (род Capsicum) наряду с томатом и картофелем, является одной из основных овощных культур, однако, в отличие от последних представляет собой один из наименее исследованных родов этого семейства. Несмотря на то, что пять из двадцати семи, выделяемых на сегодняшний день, видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum изучены весьма скудно как в генетическом, так и молекулярном плане.
Данные по систематике рода Capsicum также весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980; Walsh, Hoot, 2001). Некоторые систематики описывали свыше 100 видов, в то время как другие выделяли лишь несколько видов, составляющих этот род (Eshbaugh, 1980). При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды имеют перекрьшающуюся морфологию, в результате чего идентификация, основывающаяся на морфологическом анализе, часто бывает весьма затруднительна. Исследование запасных белков семян (Panda et al., 1986) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей рода Capsicum (Jensen et al., 1979) нередко показывает невозможность выделить отдельные виды. Схожие трудности в идентификации возникают и при использовании цитологического анализа (Pickersgill, 1979). Все это указывает на необходимость использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешающих систем молекулярного маркирования.
Также крайне актуальны вопросы, связанные с оценкой и анализом геномного полиморфизма основных родов и видов, составляющих семейство Solanaceae. Большая часть биохимических и молекулярных исследований были сфокусированы в основном на анализе только культивируемых видов, таких как Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum и Capsicum annuum (Prince et al, 1992,
Paran et al, 1998, Rodriguez et al, 1999), в то время как потенциал биоразнообразия остальных как культивируемых, так и дикорастущих видов упускался из виду. Между тем не исключено, что именно они могут стать донорами важных агрономических признаков, и в первую очередь устойчивости к фитопатогенам и вредителям (Pickersgill, 1980; Тимина, Балашова, 1983; Мамедов, Пивоваров, 2002).
Исходя из выше изложенного, целью данного исследования было проведение комплексного мультилокусного молекулярного анализа ядерного и хлоропластного генома Solanaceae, который позволил бы охарактеризовать различные его участки; выявление уровней межвидового и внутривидового геномного полиморфизма, в том числе и последовательностей семейств адаптивно-значимых генов, у представителей трех родов сем. Solanaceae. Также особый интерес представляло определение филогении взятых в анализ культурных и дикорастущих видов Solarium, Lycopersicon и Capsicum и подтверждение таксономические статусы каждого образца, а также в ряде случаев определение таксономических границ вида. Для достижения поставленных были целей сформулированы следующие задачи:
1. Использование методов молекулярного мультилокусного анализа (AFLP, RAPD, ISSR), маркирующие как уникальные, так и повторяющиеся участки генома, для определения уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей Solanaceae. Определение молекулярной природы амплифицированных RAPD фрагментов. Выявление уровней полиморфизма и степени родства у сортов картофеля, томата и перца.
2. На основе комплексного молекулярного маркирования генома перца установление филогенетические связи между видами родов семейства.
3.Использование метода анализа микросателлитных локусов ядерного и хлропластного генома для определения уровней полиморфизма этих локусов и маркирования генома представителей Solanaceae.
4. Разработка метода маркирования полиморфизма последовательностей основных адаптивно-значимых семейств растительных генов (семейства генов устойчивости, гомеозисных генов и генов протеинкиназ), и определение потенциала биоразнообразия этих генов у представителей Solanaceae. Анализ представленности генов устойчивости в геноме и определения возможности генетической эрозии у современных сортов картофеля.
5. Создание коллекции SNP маркеров и применение ее для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля.
6. Определение и характеристика последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5.8S рРНК у видов рода Solatium и Capsicum Исследование нуклеотидного полиморфизма данных последовательностей.
Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы генома растений
В настоящее время процессы органогенеза цветка являются наиболее изученными морфогенетическими процессами у растений. За последние 10-12 лет со времени идентификации первых генов наблюдается значительный прогресс, в результате чего практически полностью определена иерархическая система регуляторных генов, вовлеченных в процесс образования флоральной меристемы и формирования органов цветка (Yanofsky et al., 1990; Schwartz-Sommer et al., 1990). Были определены ключевые гены, контролирующие процессы органогенеза цветка и показано, что они обладают определенной гомологией и присутствием специфических последовательностей, сходных с таковыми у ряда гомеозисных генов дрожжей и млекопитающих. Это семейство генов растений было названо MADS, или MADS-box, семейством по присутствию в их составе 180 н.п. высоко консервативной MADS-box-последовательности, кодирующей -60 аминокислотный домен транскрипционного фактора, ответственного за ДНК-связывание, ядерную локализацию, димеризацию и связывание с другими регуляторными факторами транскрипции (Theissen et al., 2000; Ng, Yanofsky, 2001; Immink et al., 2002). MADS является акронимом названий четырех белков: МСМ1 Saccharomyces cerevisiae, AG AMOS Arabidopsis thaliana, DEFFICIENS Antirrhinum majus и SRF Homo sapiens.
В настоящее время, основываясь на последовательностя, представленных в генбанках, идентифицировано около 100 (104-107) MADS-box генов арабидопсиса и, по крайней мере, 71 ген - у риса, при этом интересно то, что у арабидопсиса 20 последовательностей MADS генов не имели аналогов в геноме риса (Arabidopsis Genome Initiative, 2000; de Bodt et al., 2003). MADS-box гены были обнаружены и в геномах других растений, как однодольных, так и двудольных, таких как Лилейные, кукуруза, пшеница, львиный зев, петунья, томат, яблони и ряда других (Fischer et al., 1995; Theissen et al., 2000; Ng, Yanofsky, 2001). Кроме того, показано присутствие MADS-box генов в геномах мхов, папоротникообразных и голосеменных растений (Mouradov et al., 1999; Henschel et al., 2002). MADS-box домены являются наиболее консервативной частью MADS генов, в большинстве случаев располагающихся в N-концевой части белка. Как уже было сказано, основной функцией MADS домена является ДНК связьюающая. При этом была определена последовательность, которая узнается MADS доменом. Эта последовательность CC(A\T)6GG, называемая CArG box, присутствует в промоторных районах многих генов, вероятно регулирующихся белками MADS-box генов (Shore, Sharrocks, 1995; Tilly et al, 1998).
По своему строению семейство MADS-box генов может быть разделено на два основных типа: тип I и тип П. Оба типа генов несут MADS-box последовательности, за исключением которых они не имеют общих протяженных гомологии. Для ряда представителей более полиморфного семейства MADS генов типа I характерно присутствие специфических высоко консервативных С-концевых мотивов (De Bodt et al., 2003; Parenicova et al., 2003), в других присутствует лишь последовательность MADS-box. Кроме того, MADS гены I типа характеризуются наличием в генах единичного экзона, в то время как остальные MADS гены имеют в среднем по 7 экзонов (Alvarez-Buylla et al., 2000; De Bodt et al., 2003). Также на сегодняшний день не было получено ни одного мутантного фенотипа MADS генов I типа, в отличие от генов II типа. Этот факт может быть объяснен тем, что MADS гены I типа экспрессируются только под действием определенных внешних факторов или имеют слабо проявляющуюся функцию. Это косвенно доказывается тем, что экспрессия может детектироваться только при использовании метода RT-PCR, основанного на обратной транскрипции и во много раз усиливающего сигнал (Parenicova et al., 2003). Однако, исходя из имеющихся данных, а также из ряда наших исследований, мы склонны предположить, что отсутствие мутаций скорее говорит о том, что гены I типа могут быть псевдогенами. В пользу этого говорит и наличие только одного экзона, а также и то, что для некоторых MADS генов I типа было показано присутствие поли (А) последовательности (van de Peer, личное сообщение). Другим фактором, предполагающим возможность использования обратной транскрипции, является присутствие ретротранспозон-подобных элементов в непосредственной близости от MADS генов I типа. Помимо этого у кукурузы были обнаружены Spm- подобные мобильные элементы, в состав которых входила последовательность MADS-box, вероятно захваченная в процессе транспозиции (Fischer et al., 1995). Кроме того, как было показано, MADS гены I типа у арабидопсиса в основном локализованы на I и V хромосомах (Parenicova et al., 2003; Kofuji et al., 2003), там же, где и преимущественно интегрированы некоторые растительные транспозоны.
Наиболее полно с молекулярно-генетических позиций охарактеризован другой тип MADS генов. К MADS генам II типа относятся большинство охарактеризованных на данный момент MADS генов (Theissen et al., 2000; Ng, Yanofsky, 2001; de Bodt et al., 2003). Тип II объединяет гены, в которых кроме MADS-box, идентифицируются еще ряд доменов, таких как промежуточный (intervening-I), кератин-подобный (keratin like-K) и С-концевой (Cerminal) домены (Purugganan et al., 1995; Theissen et al., 1996). MADS гены, кодирующие эти белковые домены, обозначаются как MADS гены МІСК-типа. I- домен (-30 а\к) располагается в непосредственой близости к MADS домену, он слабо консервативен и отвечает за образование ДНК связывающих димеров (Riechmann, Meyerowitz, 1997). К-домен, который встречается только у растительных генов, характеризуется консервативностью и присутствием гидрофобных остатков, предположительно участвующих в образовании амфипатической спирали, также, вероятно, вовлеченных в димеризацию (Riechmann, Meyerowitz, 1997). Наиболее вариабельным как по длине, так и по составу, является С-домен. Функция этого домена окончательно не определена, однако предполагается, что он отвечает за ДНК-связывание и белковую димеризацию по крайней мере некоторых гомеозисных MADS белков (Zachgo et al., 1995).
В иерархической системе генов, вовлеченных в развитие цветка, MADS-box гены являются не только основополагающими в определении идентичности цветковых органов (organ identity genes), но также вовлечены в переключение с вегетативного на генеративный путь развития, в контроль за временем цветения (late-\early- flowering genes) и идентификацией меристем (meristem identity genes), и в определение границ флоральных органов (cadastrial genes), тем самым определяя количество цветковых кругов (Theissen et al., 2000). Основная модель строения цветка определяется четырьмя различными типами органов, расположенными четырьмя кругами у кончика цветочного побега. Первый круг представлен чашелистиками, второй - обычно окрашенными лепестками венчика, третий образуют тычинки, мужские генеративные органы, продуцирующие пыльцу и, наконец, четвертый- пестик(и), женский генеративный орган, внутри которого находятся яйцеклетка и развиваются семена.
Развитие цветка представляет каскадную реакцию активации генов и начинается с экспрессии под действием окружающей среды (температуры, длины светового дня) генов, определяющих время цветения. Эти гены определяют переключение с вегетативного на генеративный тип развития путем прямой или непрямой активации генов идентификации меристем (LFY {LEAFY), UFO (UNUSUAL FLORAL ORGANS), API, AP2 (APETELA). Так называемые кадастральные гены, такие как LUG (LEUNIG) и SUP (SUPERMAN), устанавливают границы функционирования генов дифференцировки органов.
Влияние одиночной замены в праймере на перекрываемость спектров RAPD- фрагментов
В противоположность всем описанным выше ретротранспозонам маленькие (100-500н.п.) SINEs элементы не обладают кодирующими последовательностями и являются, так же, как и тРНК и snPHK, транскриптами РНК-полимеразы III. SINEs имеют гомологию с LINEs-элементами, особенно сходную специфическую последовательность на 3 -конце, и, скорее всего, используют ферментативный потенциал последних для собственных транспозиций по геному (Borodulina, Kramerov, 2001, Kajikawa and Okada, 2002). Кроме того, SINEs имеют некоторую гомологию с тРНК последовательностями, что, вероятно, связано с участками инициации транскрипции и узнавания общей РНК полимеразой III (Yoshioka et al., 1993). SINE-элементы также составляют значительную часть генома растения. Так, например, SINE TS представлен в геноме табака 50 000 копиями (Yoshioka et al., 1993). Кроме того, к SINEs-типу относятся и одни из самых распространенных в геноме человека Л/и-последовательности, представленные более 1 млн. копий на геном и составляющие около 11% всей ДНК. До сих пор остается неизвестным происхождение этих элементов.
Класс II представлен мобильными элементами, у которых, в отличие от ретротранспозонов, перемещение по геному происходит конкретно от ДНК к ДНК, минуя промежуточную стадию РНК, и транспозиции всегда связаны с вырезанием копии мобильного элемента. Таким образом, в отличие от ретротранспозонов, насыщенность генома мобильными элементами этого класса крайне мала. Однако копийность мобильных элементов класса II может возрастать в том случае, если цепь ДНК, содержащая этот транспозон, будет использоваться в качестве матрицы при репарации двуцепочечной бреши (Engels et al., 1990).
Этот класс мобильных элементов имеет определенные структурные характеристики (рис. 1.2). Концы транспозонов ограничены инвертированными повторами (terminal inverted repeats, TIRs), обычно короткими, длиной 11 н.п. Ac/Ds-эпеиеитов, 13 н.п. - у Spm/dSpm, 10-28 н.п. - у САСТА, и только семейство МиІЖ/Ми-злементов характеризовалось наличием длинных TIR-последовательностей ( 200 н.п.). TIRs фланкируют район, содержащий ряд генов, ответственных за транспозицию мобильного элемента. Так, например, полноразмерые 5р/и-элементы кукурузы кодировали несколько белков, в том числе Тпр А и D- узнающие и стягивающие концевые TIR-последовательности, Тпр В-транспозазу\интегразу, ответственную за вырезание и интеграцию (рис. 1.2) (Raina et al., 1998, Fedoroff, 1999). Сходное строение с Spm имели также и представители других типов этого класса мобильных элементов Ac/Ds- элементов у видов кукурузы, ТатЗ у львиного зева (Antirrhinum majus), САС1 у арабидопсиса, Tdcl у моркови, Tpnl у ипомеи, Candystripel у сорго, Pst у петунии и Ми элементы у кукурузы (Nacken et al., 1991, Benito et al., 1997, Chopra et al., 1999, Bennetzen, 2000, Muira et al., 2001). Также обращает на себя внимание их присутствие в кодирующих областях интронных последовательностей, чего не наблюдалось у ретротранспозонов.
Другой характерной чертой этого класса мобильных элементов является дуплицирование сайтов интеграции. При этом длина дупликации специфична для каждой группы мобильных элементов и, например, для yic/Ds-элементов составляет 5 н.п., а для САСТА- 3 н.п. Наличие таких дуплицированньгх участков прямых повторов определенной длины после эксцизии мобильного элемента является своеобразной меткой его бывшего присутствия в этом районе (Casacuberta et al., 1998, Turcotte et al., 2001).
Большинство мобильных элементов класса II перемещаются по геному с использованием механизма «вырезания-встраивания». При этом белки транспозазы узнают концевые TIR-последовательности, стягивают мобильный элемент по этим концам и точно вырезают его из генома. Далее мобильный элемент, используя все ту же транспозазу, встраивается в другой участок генома. Интересно и то, что для мобильных элементов класса II, в отличие от ретротранспозонов, показаны транспозиции в соседние участки на той же хромосоме и транспозиции в другие хромосомы крайне редки. Эта способность к близкородственным транспозициям лежит в основе современного метода клонирования генов растений с помощью линий с инсерциями мобильных элементов, называемых линии-ловушки генов (enhancerrap lines) (Raina et al., 1998, Fedoroff, 1999,2000). Присутствие специфических консервативных мотивов в гене траспозазы, а также длина мобильного элемента и гомология его TIR районов, позволяет классифицировать эукариотические транспозоны класса II на 7 различных групп (Robertson, 2002). Внутренние делении кодирующих последовательностей транспозонов приводят к образованию огромного количества дефектных элементов, не способных к автономной транспозиции. Однако они могут перемещаться по геному, используя активную транспозазу полноразмерных транспозонов (Fedoroff, 1999, 2000). Таким образом, транспозоны класса II образуют двухкомпонентные системы из полноразмерного функционального и делетированного нефункционального элементов, такие как Ac/Ds, Spm/dSpm, MuDR/Mu (, Fedoroff, 1999, Lisch et al., 1998) Класс III представлен специфическими миниатюрными мобильными элементами с инвертированными повторами (miniature Inverted-repeats transposable elements, MITEs), несодержащими кодирующих последовательностей. MITEs были открыты и описаны значительно позднее других мобильных элементов (Casacuberta et al., 1998). MITEs представляют собой сходные по нуклеотидном последовательностям элементы длиной 400 н.п. с 15-членными инвертироватнными повторами, при этом наблюдается частичная гомология с TIR прследовательностями (рис 1.2). MITEs слишком малы для кодирования функционального белка, и до сих пор не ясны механизмы их транспозиций. Частичная гомология концевых последовательностей может предполагать вовлеченность транспозаз мобильных элементов класса П. Однако в этом случае не совсем объяснимо их огромное количество в геноме. Как было показано, MITEs широко распространены в растительном геноме и, в целом, для риса было показано присутствие в геноме более 100 тысяч копий MITEs (Casacuberta et al., 1998, Turcotte et al., 2001). Большинство представителей семейства MITEs присутствуют в количестве сотен копий различных последовательностей, однако, как в случае mP/F-элемента кукурузы, они могут повторятся в геноме до 6000 раз (Zang et al., 2001). Недавние исследования показали, что MITEs составляют до 50% от всего количества повторяющихся последовательностей ДНК IV хромосомы риса и около 6% всего генома риса. Представитель только одного Stowaway MITEs семейства риса, по всей видимости, составляет 2% всей ДНК риса (Мао et al., 2000, Feng et al., 2002). Следует также отметить, что локализация их в геноме резко отличается от того, что было показано для других классов мобильных элементов. Так, MITEs преимущественно встречаются в эухроматиновых районах, особенно АТ-богатых районах, и могут образовывать нехарактерные для других транспозонов гнездовые структуры, встраиваясь один в другой (Zang et al., 2000, Feng et al., 2002, Feschotte et al., 2002a). Кроме того, MITEs очень часто встречаются в нитронах генов и во фланкирующих гены районах, что также не типично для большинства других транспозонов (Turcotte et al., 2001). MITE инсерции довольно стабильны, и сайты инсерций одинаковы для родственных видов (Wessler, 1998).
Использование систем молекулярного маркирования для определения таксономически спорных образцов генетических коллекций Capsicum
Помимо AFLP, RAPD методов молекулярного анализа геномов,позволяющих исследовать полиморфизм, преимущественно уникальных селективно нейтральных последовательностей ДНК, дополнительный интерес представлял анализ генетического разнообразия рода Solanum методом ISSR. Этот метод позволяет маркировать межмикросателлитные и микросателлитные последовательности ДНК, локализованные, главным образом, в гетрохроматиновых районах генома (Zietkiewicz et al., 1994, Wang et al., 1994, Wu et al., 1994).
ISSR метод основан на использовании в PCR праймеров, представляющих собой ли-, три-, тетра- или пентануклеотидные повторы часто с 2-4 случайными, так называемыми якорными (anchored), нуклеотидами на 3 - конце последовательностей праймеров. Праймеры с такими якорными последовательностями 3 -конца, отжигаясь на гомологичных микросателлитных повторах, приводят к амплификации межмикросателлитных участков, позволяя, таким образом, детектировать генетический полиморфизм этих районов генома (Wu et al., 1994, Zietkiewicz et al., 1994, Nagaoka, Ogihara, 1997, Moreno et al., 1998, Wolfe et al., 1998, Prevost et al., 1999, Joshi et al., 2000).
В ISSR анализ был взят набор 38 образцов ДНК 25 видов Solatium, при этом был расширен набор образцов S. demissum до 5 и S. chacoense до 8 (табл. 2.1). В работе было использовано 8 праймеров, комплементарных микросателлитным повторам, которые приводили к амплификации воспроизводимых полиморфных спектров ISSR фрагментов генома Solanum (табл. 2.8). При использовании этих праймеров на полном наборе ДНК образцов всего было получено 192 полиморфных фрагмента. В результате каждый вид и образец Solanum были охарактеризованы специфическими наборами ISSR фрагментов (рис. 3.1.3).
Статистическая обработка ISSR-спектров исследуемых образцов Solanum, позволила получить матрицы коэффициентов генетических различий. Было показано, что внутривидовая вариабельность исследованных видов соответствует диапазону генетических расстояний равному 0.04-0.13, в то время как межвидовая вариабельность соответствует 0.09-0.54. Как и в случае RAPD и AFLP маркирования наибольшей межвидовой вариабельностью отличались виды серии Tuberosa {S.incamayonese - S.gigantophyllum (0.25)) и Longipedicellata (S. polytrichon- S.papita (0.25)). Серия Acaulia характеризовалась наименьшим уровнем межвидового полимрфорфизма (S. acaule- S. albicans (0.15)).
Интересно отметить, что уровень межвидового и внутривидового разнообразия, детектируемого с помощью метода ISSR, в целом для большинства видов Solanum несколько увеличился, при приблизительно сходных общих диапазонах вариабельности AFLP-, RAPD-, ISSR маркеров (табл. 3.1.2). Аналогичные данные были показаны и при ISSR-анализе генома видов и сортов риса (Nagaoka, Ogihara, 1997).
Например, внутривидовая вариабельность S. demissum, по данным AFLP-и RAPD анализа, составила 0.02 и 0.04 соответственно. Показатель для тех же образцов данного вида по данным ISSR анализа был равен 0.09. Значительное увеличение значений геномного полиморфизма, выявляемого ISSR методом, было показано и для видов S. stoloniferum и S. chacoense, что может быть объяснено специфичностью маркируемых последовательностей.
Помимо выявления уровней полиморфизма генома видов Solanum, определенного с помощью AFLP, RAPD и ISSR маркирования нейтральных последовательностей генома, особый интерес представлял анализ филогенетических отношений у исследовавшихся видов. С этой целью матрицы рассчитанных генетических расстояний (коэффициенты Жаккарда и Нея-Ли) были использованы как входные данные для проведения иерархического кластерного анализа методом UPGMA. В результате были построены AFLP, RAPD и ISSR дендрограммы, отражающие филогенетические связи у анализируемых видов (рис. 3.1.4). Также был проведен PC A (principal component analysis) анализ (рис. 3.1.5).
Дендрограммы, полученные с помощью разных систем молекулярного маркирования, были в целом сходны как по числу, так и составу видовых кластеров и подкластеров.
Дж. Хоукс объединил клубнеобразующие виды Solanum в подсекцию Potatoe, которая в свою очередь была подразделена на 19 серий (Hawkes, 1990). видами, составляющими одну серию. Такая классификация, основанная на данных о морфологии растения и географии произрастания, подразумевала наличие филогенетических связей у видов, составляющих одну серию. Основываясь на аналогичных данных, еще более дробная классификация была предложена С.М.Букасовым и В.В.Юзепчуком (Букасов, 1955, 1971, 1980). Однако результаты, полученные при использовании молекулярных методов анализа генома, не полностью поддерживали дробность классификации рода Solanum. Так согласно анализу хлоропластной ДНК не поддерживалась дробная классификация, и вся секция Petota подразделялась только на четыре группы (Spooner, Castillo, 1997). Проведенный нами молекулярный анализ ядерного генома с использованием AFLP, RAPD и ISSR маркирования с одной стороны согласуется с данными анализа хлДНК, с другой позволяет выявить более детальную филогению видов секции Petota из-за меньшей консервативности ядерной ДНК по сравнению с хлоропластной.
В целом проведенный анализ совпал с классификацией, предложенной Хоуксом (Hawkes, 1990). Так виды, объединенные Дж. Хоуксом в серию Pinnatisecta, по данным молекулярного анализа также кластеризовались вместе. Виды серии Pinnatisecta (S. pinnatisecta, S. jamesii, S. michoacantum) на AFLP, RAPD и ISSR дендрограммах образовывали наиболее удаленный от остальных видов кластер, что также подтверждалось PC А анализом (рис. 3.1.5). Также отдельно располагался представитель серии Bulbocastana S. bulbocostanum (рис. 3.1.4, 3.1.5). Это совпадает с представлениями о сериях Pinnatisecta и Bulbocastana, как наиболее древних таксонах, обладающих более примитивным строением цветка. Виды Pinnatisecta и Bulbocastana имеют звездчатое строение венчика цветка и относятся к суперсерии Stellata, в то время как остальные анализируемые серии видов относятся к суперсерии Rotata с колесовидным типом цветка (Hauwks, 1990, van der Berg, Spooner, 2001).
Проведенный молекулярный анализ также поддержал выделение серий Acaulia (виды 5. acaule, S. albicans) и Longipendicellata (S. papita, S. polytrichon, S. stoloniferum, S. fendleri, S.ajuscoense). Особый интерес представлял гексашюидный вид S.demissum серии Demissa с крайне узким ареалом распространения в южных областях Мексики. Так, согласно нашим данным, геном S. demissum в отличие от исходного морфологического анализа (Букасов, 1955, 1971, Hawkes, 1990) был крайне близок к представителям южноамериканской серии Acaulia, с видами которой образовывал на AFLP, RAPD и ISSR дендрограммах один кластер. Сходство S. demissum и S. albicans было также показано в работе по RFLP анализу ядерного генома видов серии Acaulia (Debener et al., 1990, Kardolus et al., 1998). Тесное родство этих серий географически разобщенных видов также подтвердил более подробный анализ морфологического и экологического сходства (Ochoa, 1990, Spooner et al., 1995, Kardolus et al., 1998).
Использование метода TAIL PCR для анализа эмбрио-дефектной летальной мутации, вызванной инсерцией мобильного элемента
Для видов перца, составляющих генетические комплексы, комплекс baccatum или комплекс аппиит, показатели межвидового полиморфизма находились в пределах от 0.13 до 0.25. Так, например, межвидовые различия С. аппиит, С. chinense и С. frutescens составили 0.13-0.25 {комплекс аппиит). В этот же диапазон попадают различия, выявленные между С. baccatum и С. praetermissum (0.21-0.23) {комплекс baccatum).
При этом показатели геномных различий между видами разных комплексов, как и следовало ожидать, были значительно выше и, например, для пар видов С. аппиит-С. baccatum, С. baccatum-C. pubescens, С. pubescens-C.chacoense в среднем составили 0.29-0.30.
Весьма интересным явился тот факт, что такой отдельно выделяемый дикорастущий вид, как С. tovarii, показал значительное сходство с представителями вида С. baccatum (0.08-0.10). С. tovarii, недавно описанный вид перца (Eshbaugh et al., 1983), представлен в мировых генетических коллекциях всего одним образцом и на сегодняшний день молекулярно практически не изучен. На основании морфофизиологических данных С. tovarii первоначально был отнесен к красноцветковой группе видов С. pubescens, С. eximium и C.cardenasii, включаемых в генетический комплекс pubescens (Eshbaugh et al., 1993). Однако в недавних экспериментах по межвидовой гибридизации и исследованию поведения хромосом в мейозе у гибридных растений [С. baccatum х С. tovarii], [С.praetermissum х С. tovarii] была показана наибольшая степень сходства генома С. tovarii с геномами С.praetermissum и С. baccatum (Tong, Bosland, 1999). Наши данные, полученные в результате AFLP-анализа, также подтверждают родственность этих видов.
В настоящее исследование был включен еще один интересный дикорастущий вид перца - С. chacoense. Величины генетических различий, рассчитанных на основании анализа спектров AFLP фрагментов между С. chacoense и, например, представителями С. baccatum, С. pubescens, С. аппиит, в среднем составили 0.26-0.30, 0.28-0.30, 0.27-0.31, соответственно. Несмотря на несколько большее сходство С. chacoense и С. baccatum, этот вид оказался весьма удаленным от С. baccatum. Согласно морфологическому описанию, С. chacoense также не имеет никаких общих характеристик с видами, представляющими комплекс baccatum (Walsh, Hoot, 2001).
Вместе с тем, при исследовании, например, нуклеотидного полиморфизма хлоропластного гена atpB-rbcL и интрона ядерного гена waxy была показана некоторая родственность геномов видов С. chacoense и С. baccatum. На основании этого вид С. chacoense был отнесен авторами к группе видов комплекса baccatum, хотя и со слабой бутстреп-поддержкой (Walsh, Hoot, 2001). По результатам изозимного анализа, С. chacoense был охарактеризован, как вид равноудаленный от всех комплесообразующих видов перца (McLeod et al., 1983). Кроме того, являясь представителем белоцветковой группы, С. chacoense, по сравнению с другими ее представителями (С.аппиит, С. frutescens, С. chinense, C.baccatum, C.praetermissum), оказался более близок к видам, представляющим красноцветковую группу (С. pubescens, С. eximium, С. cardenasii).
Результаты молекулярного анализа, проведенного нами, в совокупности с морфологическими данными и с данными об ограниченном географическом распространении вида С. chacoense (только Парагвай, Аргентина, Боливия) (McLeod, 1977, 1983, Jensen et al., 1979) позволяют сделать вывод о том, что, по всей видимости, данный вид может являться предком или относительно неизмененным потомком предка, давшего начало и красноцветковой, и белоцветковой группам видов. Таким образом, все эти результаты только подтверждают генетическую отдаленность С. chacoense от остальных исследовавшихся видов рода Capsicum. методом AFLP Для анализа внутривидового полиморфизма наиболее обширная выборка образцов была подобрана для вида С. аппиит. Этот вид был представлен 16 сортами, 2 разновидностями (С. аппиит var conicum, С. аппиит var angulosum), 7 дикорастущими образцами С. аппиит (см. главу Материалы и методы, табл. 2.4). Совершенно неожиданные результаты были получены для группы дикорастущих образцов вида С. аппиит из Гватемалы и Никарагуа (#39, #41, #42, #43). Это заставило нас анализировать внутривидовой полиморфизм С. аппиит как полиморфизм двух различных групп - культивируемого и дикорастущего С. аппиит.
Так, в среднем величины генетических различий между культивируемыми образцами С. аппиит составили 0.05, что вполне согласуется с данными RAPD анализа 34 представителей С. аппиит, полученными Paran et al., (1998). Полиморфизм внутри группы дикорастущих образцов вида С. аппиит (#39, #41, #42, #43) сопоставим с этими результатами (0.05-0.10). Однако при сравнении дикорастущих и культивируемых форм С. аппиит, показатель генетических различий оказался близким к величинам, характеризующим межвидовой полиморфизм (0.16-0.19). Этот показатель также был весьма схож с уровнем межвидового полиморфизма между культивируемыми С. аппиит и другими родственными культивируемыми видами: культивируемым С. аппиит и С. chinense (0.13-0.25), культивируемого С.аппиит и С. frutescens (0.18-0.23), С. chinense и С. frutescens (0.14-0.20). Между группой дикорастущих образцов С. аппиит и образцами видов С. chinense и С. frutescens так же были получены сходные значения генетических различий (0.19-0.21). Таким образом, группа дикорастущих представителей С. аппиит оказалась практически равноудаленной, как от остальных образцов своего вида, так и от двух других родственных видов.
Как упоминалось ранее, по одной из гипотез, три вида- С. аппиит, С. frutescens, С. chinense - составляют единый генетический комплекс, называемый комплекс аппиит. Считается, что все его представители произошли от единого и весьма полиморфного предкового пула генов (McLeod,1977, Pickesgill, 1977, 1979, 1983), наиболее генетически близкими к которому в настоящий момент, вероятно, могут быть дикорастущие формы С. аппиит, не затронутые процессами доместикации.
Таким образом, можно предположить, что исследовавшиеся образцы дикорастущего С. аппиит могут быть более сходны с предковыми формами, давшими начало культивируемым видам комплекса аппиит. В этом случае величина генетических различий между группами образцов дикорастущего и культивируемого С. аппиит должна в какой-то мере отражать степень генетических изменений, вызванных доместикацией.
С другой стороны, такие значительные генетические отличия дикорастущих образцов от остальных исследовавшихся представителей вида С. аппиит, могут быть связаны с процессами нового видообразования. Действительно, Д. Саккорд и Д. Ла Глория (Saccarod, La Gloria, 1982) обнаружили у гибридных образцов, полученных от скрещивания С. аппиит из Колумбии с С. аппиит из Мексики, оберрантное хромосомное спаривание, вызванное несколькими транслокациями, которые отличали колумбийские популяции перца от мексиканских. Очень вероятно, что географическая изоляция популяции стимулировала у данных популяций С. аппиит процессы дивергенции, которые могут привести и к образованию двух различных подвидов\ видов, что также предполагается в ряде других работ (Bosland, Votava, 2000).
Что касается внутривидовой вариабельности остальных исследовавшихся видов перца, то, например, для вида С. chinense этот показатель был наибольший и варьировал в пределах 0.05-0.13. Представители других видов перца С. baccatum, С. praetermissum, С. pubescens характеризовались низкими показателями внутривидовых генетических различий, в пределах 0.04-0.08 что, в первую очередь, может быть связано с ограниченностью выборки образцов, взятых в анализ. Развернутый анализ внутривидового полиморфизма других культивируемых видов С. chinense и С. frutescens был выделен в отдельную задачу, и здесь не рассматривается (см. раздел 3.1.3.4.).
