Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структурно-функциональная организация генома растений
1.1. Уникальные последовательности генома растений
1.2. Характеристика основных семейств генов растительного генома
1.2.1. Семейство генов устойчивости растений
1.2.2. Семейство MADS-box генов
1.2.3. Семейство генов протеинкиназ растений
1.3. Повторяющиеся последовательности генома растений
1.3.1. Фракция высокоповторяющейся ДНК
1.3.2. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: гены рРНК и их спейсерные участки
1.3.3. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы генома растений
1.4. Молекулярные методы анализа растительного генома
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 62
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 81
3.1. Анализ геномного полиморфизма представителей трех родов сем. Solanaceae 81
3.1.1. Молекулярное маркирование генома методами AFLP-, RAPD- и ISSR анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов и сортов рода Solanum L $2
3.1.1.1. Анализ межвидового и внутри видового полиморфизма представителей рода Solanum методом AFLP g2
3.1.1.2. Анализ межвидового и внутривидового полиморфизма представителей рода Solanum методом RAPD 85
3.1.1.4. Анализ генома представителей рода Solanum методом ISSR маркирования межмикросателлитных последовательностей
3.1.1.5. Определение филогенетических отношений представителей рода Solanum 91
3.1.1.6. Выявление межсортового полиморфизма у представителей Solanum: AFLP-, RAPD- и ISSR-маркирование сортов картофеля (S. tuberosum) и RAPD анализ сортов баклажана (S. melongena) 95
3.1.1.7. Молекулярный анализ фрагментов RAPD-спектра генома картофеля 10°
3.1.1.7. Влияние одиночной замены в праймере на перекрываемость спектров RAPD- фрагментов
3.1.7.2. Анализ молекулярной природы полученных RAPD фрагментов 106
3.1.2. Молекулярное маркирование генома методами RAPD-, AFLP- и ISSR-анализа, выявление уровней геномного полиморфизма и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Lycopersicon (Tourn.)Mill. 108
3.1.2.1. Опре деления генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом RAPD 111
3.1.2.2. RAPD-анализ сортов культивируемого томата Lycopersicon esculentum 112
3.1.2.3. Опре деление генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon. методом ISSR 118
3.1.2.4. Определение генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Lycopersicon методом AFLP
3.1.2.5. Таксономические и филогенетические взаимоотношения у дикорастущих и культивируемых видов Lycopersicon, выявляемые при использовании RAPD-, AFLP- и ISSR- маркирования генома 120
3.1.3. Молекулярное маркирование генома RAPD-, AFLP- и ISSR- методами и определение филогенетических связей у видов, разновидностей и сортов рода Capsicum L.
3.1.3.1. Анализ межвидового полиморфизма видов и сортов рода Capsicum методом AFLP 124
3.1.3.2. Анализ внутривидового полиморфизма у Capsicum, выявляемого методом AFLP 130
3.1.3.3. Использование AFLP-системы молекулярного маркирования для определения филогении видов рода Capsicum. 133
3.1.3.4. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum RAPD-методом 1 ^
3.1.3.5. RAPD-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении рода Capsicum 1 „
3.1.3.6. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum методом ISSR- маркирования межмикросателлитных последовательностей 1
3.1.3.7. ISSR-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении видов рода Capsicum -
3.1.3.8. Использование систем молекулярного маркирования для определения таксономически спорных образцов генетических коллекций Capsicum 149
3.1.3.9. Комплексный анализ генетического разнообразия видов Capsicum chinense и Capsicum frutescens с использованием AFLP-, RAPD-, ISSR- систем молекулярного маркирования 1, т
3.1.3.10. Комплексный анализ генома рода Capsicum с использованием AFLP-, RAPD- и ISSR-систем молекулярного маркирования. 158
3.2. Молекулярный анализ основных адаптивно значимых семейств генов (генов резистентности, MADS-box генов и генов, кодирующих протеинкиназы) у представителей сем. Solanaceae 166
3.2.1. Разработка метода DDP-маркирования генома. 167
3.2.1.1. NBS-маркирование семейства генов резистентности (R-генов и RGAs) 174
3.2.1.2. MADS- маркирование семейства гомеозисных генов и РК- маркирование семейства генов серин-треониновых протеинкиназ. 176
3.2.2. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Solanum
3.2.2.1. Определение полиморфизма семейства генов резистентности у 445 сортов картофеля европейской и отечественной селекции 1 Q 182
3.2.3. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода apsicum
3.2.3.1. Общая характеристика полиморфизма RGA-фрагментов видов перца, выявленного при использовании метода NBS- маркирования 182
3.2.3.2. Использование метода NBS-маркирования для определения филогении RGA-семейства последовательностей у Capsicum 184
3.2.3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных RGA-фрагментов генома Capsicum 186
3.2.4. Молекулярный анализ семейства MADS-box генов и их аналогов у представителей рода Capsicum 187
3.2.4.1. Использование метода MADS-маркирования для определения филогении семейства MADS-содержащих последовательностей генома Capsicum 190
Молекулярный анализ семейства генов, кодирующих серин- треониновые протеинкиназы у представителей рода Capsicum
3.2.5.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных РК- фрагментов 192
3.3. Разработка метода TAIL PCR для маркирования фланкирующих геномных последовательностей при транспозон-опосредованном Ac\Ds инсерционном мутагенезе 198
3.3.1. Использование метода TAIL PCR для анализа эмбрио-дефектной летальной мутации, вызванной инсерцией мобильного элемента 208
3.4. Исследование нуклеотидного полиморфизма гена ранскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК у представителей сем. Solanaceae
3.4.1. Анализ последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных последовательностей рибосомной ДНК у видов рода Solatium и Lycopersicon 208
3.4.2. Анализ последовательности ITS1-5.8S-ITS2 рибосомной ДНК у видов рода Capsicum 213
3.5. Детекция SNP в генах Lycopersicon esculentum и Soliumт tuberosum и SNP-маркирование генома сортов картофеля 226
3.5.1. Выявление SNP в генах томата, картофеля и перца 2?7
3.5.2. Использование SNP для маркирования сортов S. tuberosum генома и определения аллельного статуса методом пиросеквенирования 229
3.6. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома Solanaceae 235
246
3.6.1. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов картофеля 235
3.6.2. Полиморфизм SSR локусов ядерного генома видов и сортов перца. 250
3.7. Молекулярный анализ хлоропластного генома представителей родов Solanum, Lycopersicon и Capsicum
3.7.1. Рестрикционный анализ хлоропластной ДНК сортов картофеля 250
3.7.2. Анализ микросателлитных локусов хлоропластной ДНК сортов картофеля 256
3.7.3. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома представителей родов Capsicum и Lycopersicon 260
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 267
ВЫВОДЫ 273
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 276
Введение к работе
Семейство Solanaceae является одним из самых представительных семейств двудольных растений и, кроме того, включает виды, являющиеся основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель, томат и перец, относящиеся к трем основньш родам семейства Solatium, Lycopersicon и Capsicum.
Род Solanum является самым многочисленным из родов семейства Solanaceae. Картофель (Solanum tuberosum) и родственные ему дикорастущие и культивируемые клубнеобразующие виды Solanum объединены в подсекцию Potatoe, которая, была подразделена на 19-25 серий (Юзепчук, 1938, Букасов, 1955, 1980, Жуковский 1964, Букасов, Камераз, 1972, Hawkes, 1990, 1994). Такая классификация основывалась прежде всего на морфо-физиологических данных и / или географии распространения видов, а также подразумевала наличие филогенетических отношений между видами, составляющими одну серию. Проводимая в последнее время ревизия и значительное расширение коллекций образцов видов Solanum выявили существенные проблемы, связанные с определением уровней биоразнообразия и филогенетических связей, а также установлением границ для видов и серий видов (Spooner, Castillo, 1997, Spooner, Hijmans, 2001, van der Berg et al, 2002). Для выявления спорных таксономических вопросов и более полной характеристики вида и серии видов рекомендовалось использовать молекулярные методы маркирования генома. Использование методов молекулярного анализа хлоропластной и ядерной ДНК картофеля показало часто встречающееся объединение в одну серию неродственных видов (Hosaka, 1996, Spooner, Castillo, 1997, Kardulos et al., 1998, Brayen et al., 1999, van der Berg et al., 2001). До настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне ясным, также не были проведены оценки межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений между сериями видов.
Несмотря на небольшое количество видов, составляющих род Lycopersicon (9-11), классификация томатов до сих пор окончательно не разработана. Исходно таксономия рода Lycopersicon базировалась на морфологических (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999), цитологических (Rick, Yoder, 1988), а так же биохимических (Rick, 1983, Rick, Yoder, 1988) характеристиках, на основании которых было предложено несколько классификаций рода (Muller, 1940, Брежнев, 1958, Rick, 1976, Храпалова, 1999). Однако также как и в случае с родом Solanum, до настоящего момента статус некоторых таксонов внутри рода остается не вполне определенным.
Перец (род Capsicum) наряду с томатом и картофелем, является одной из основных овощных культур, однако, в отличие от последних представляет собой один из наименее исследованных родов этого семейства. Несмотря на то, что пять из двадцати семи, выделяемых на сегодняшний день, видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum изучены весьма скудно как в генетическом, так и молекулярном плане.
Данные по систематике рода Capsicum также весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980; Walsh, Hoot, 2001). Некоторые систематики описывали свыше 100 видов, в то время как другие выделяли лишь несколько видов, составляющих этот род (Eshbaugh, 1980). При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды имеют перекрьшающуюся морфологию, в результате чего идентификация, основывающаяся на морфологическом анализе, часто бывает весьма затруднительна. Исследование запасных белков семян (Panda et al., 1986) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей рода Capsicum (Jensen et al., 1979) нередко показывает невозможность выделить отдельные виды. Схожие трудности в идентификации возникают и при использовании цитологического анализа (Pickersgill, 1979). Все это указывает на необходимость использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешающих систем молекулярного маркирования.
Также крайне актуальны вопросы, связанные с оценкой и анализом геномного полиморфизма основных родов и видов, составляющих семейство Solanaceae. Большая часть биохимических и молекулярных исследований были сфокусированы в основном на анализе только культивируемых видов, таких как Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum и Capsicum annuum (Prince et al, 1992, Paran et al, 1998, Rodriguez et al, 1999), в то время как потенциал биоразнообразия остальных как культивируемых, так и дикорастущих видов упускался из виду. Между тем не исключено, что именно они могут стать донорами важных агрономических признаков, и в первую очередь устойчивости к фитопатогенам и вредителям (Pickersgill, 1980; Тимина, Балашова, 1983; Мамедов, Пивоваров, 2002).
Исходя из выше изложенного, целью данного исследования было проведение комплексного мультилокусного молекулярного анализа ядерного и хлоропластного генома Solanaceae, который позволил бы охарактеризовать различные его участки; выявление уровней межвидового и внутривидового геномного полиморфизма, в том числе и последовательностей семейств адаптивно-значимых генов, у представителей трех родов сем. Solanaceae. Также особый интерес представляло определение филогении взятых в анализ культурных и дикорастущих видов Solarium, Lycopersicon и Capsicum и подтверждение таксономические статусы каждого образца, а также в ряде случаев определение таксономических границ вида. Для достижения поставленных были целей сформулированы следующие задачи:
1. Использование методов молекулярного мультилокусного анализа (AFLP, RAPD, ISSR), маркирующие как уникальные, так и повторяющиеся участки генома, для определения уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности у представителей Solanaceae. Определение молекулярной природы амплифицированных RAPD фрагментов. Выявление уровней полиморфизма и степени родства у сортов картофеля, томата и перца.
2. На основе комплексного молекулярного маркирования генома перца установление филогенетические связи между видами родов семейства.
3.Использование метода анализа микросателлитных локусов ядерного и хлропластного генома для определения уровней полиморфизма этих локусов и маркирования генома представителей Solanaceae.
4. Разработка метода маркирования полиморфизма последовательностей основных адаптивно-значимых семейств растительных генов (семейства генов устойчивости, гомеозисных генов и генов протеинкиназ), и определение потенциала биоразнообразия этих генов у представителей Solanaceae. Анализ представленности генов устойчивости в геноме и определения возможности генетической эрозии у современных сортов картофеля.
5. Создание коллекции SNP маркеров и применение ее для анализа и идентификации геномов сортов томата и картофеля.
6. Определение и характеристика последовательности внутренних транскрибируемых спейсерных участков (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК и гена 5.8S рРНК у видов рода Solatium и Capsicum Исследование нуклеотидного полиморфизма данных последовательностей.
