Содержание к диссертации
Введение 4
Обзор литературы 13
2.1. Моногенные наследственные заболевания нервной системы: спектр мутаций и этиопатогенез
2.1.1. Динамические мутации при наследственных нейродегенеративных заболеваниях
2.1.1.1. Молекулярные механизмы динамических мутаций
2.1.1.2. От экспансии - к фенотипу. Молекулярный патогенез болезней экспансии.
2.1.1.3. Миотоническая дистрофия типа как заболевание с неограниченной экспансией простых повторов.
2.1.1.4. Заболевания с ограниченной экспансией кодирующих повторов: хорея Гентингтона
и спиномозжечковая атаксия типа 1
2.1.2. Точковые и микроделеционные мутации в патогенезе заболеваний нервной системы
2.1.2.1. Дистонические синдромы: ДОФА-зависимая и ДОФА-независимамя торсионная дистония
2.1.2.2. Болезнь Вильсона-Коновалова (гепатолентикулярная дегенерация)
2.1.3. Макроделеции\цупликации как причина развития наследственных нейродегенеративных заболеваний на примере болезни Паркинсона
2.2. От моногенной патологии к мультифакториальным заболеваниям: болезнь двигательного нейрона
2.2.1. Клиническая картина болезни двигательного нейрона 70
2.2.2. Современные представления об этиопатогенезе болезни двигательного нейрона
2.2.3. Моногенные формы болезни двигательного нейрона склероза
2.2.4. Мутации в гене супероксидисмутазы 1 (SOD1) как основная генетическая причина болезни двигального нейрона
2.2.5. Изменение структуры цитоскелета как причина развития БДН
2.2.6. Системы детоксикации в патогенезе БДН 95
2.2.7. Эксайтотоксичность и патогенез БДН 102
2.3. Заключение. Проблема гетерогенности мутаций при наследственных нейродегенеративных заболеваниях. Материалы и методы 108
3.1. Общая характеристика проанализированных групп больных 109
3.2.1. Молекулярно-генетические методы исследования Выделение ДНК из клеток крови человека 109
3.2.2. Методика проведения ПЦР 112
3.2.3. Введение радиоактивной метки в праймеры для ПЦР амплификации
Электрофорез в полиакриламидном геле 112
3.2.4.1. Исходные растворы для проведения электрофореза 112
3.2.4.2. Проведение денатурирующего электрофореза в ПААГ
3.2.4.3. Проведение не денатурирующего электрофореза в ПААГ.
3.2.5. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP анализ).
3.2.6. Денатурирующий градиентный гель электроофрез (DGGE анализ)
3.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
3.2.8. Определение размера экспансии у больных миотонической дистрофией.
3.2.9. Анализ CTG связывающихся белков методом задержки в геле
3.2.10. Рестрикционный анализ мутации D90A в гене SOD1
3.2.11. Анализ полиморфизма генов глутатион-8-трансфераз Ml, и ТІ и PI
3.2.12. Анализ полиморфизма гена тяжелой цепи нейрофиламентов
3.2.13. Анализ гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном SOD1.
3.2.14. Анализ делеций и дупликаций экзонов гена паркина
3.2.15. Определение мутации H1069Q в гене АТР7В при болезни Вильсона-Коновалова
3.3. Статистическая обработка результатов Результаты и обсуждение
4.1 Молекулярная генетика моногенных неврологических болезней
4.1.1. Молекулярно-генетический анализ торзионной дистонии
4.1.2. Миотоническая дистрофия как пример динамической мутации
4.1.3 Полиглутаминовые болезни.
4.1.4. Гепатолентикулярная дегенерация
4.1.5. Аутосомно-рецессивная ювенильная болезнь Паркинсона и спорадический паркинсонизм
4.2. Болезнь двигательного нейрона: от моногенной патологии к мультифакториальным заболеваниям.
Выводы
Список литературы
Введение к работе
Последние годы на рубеже двух столетий ознаменованы стремительным прогрессом в области молекулярной генетики человека. Это связано, прежде всего, с работами по расшифровке генома человека, проведенными в рамках международных и национальных программ «Геном человека». Первый (черновой) вариант первичной структуры генома человека (в котором была приведена информация о первичной структуре 90% генома) был опубликован в 2001 г. (Lander et al, 2001, Venter et al, 2001), и стало очевидно, что многие представления об особенностях организации генома являются неверными. Так, даже это черновое секвенирование генома человека резко снизило оценку числа генов в геноме - с восьмидесяти - ста тысяч (Киселев ЛЛ, 2000, Fields et al, 1994, Liang et al, 2000) до чуть более чем 30000 генов. Дальнейшее развитие работ по секвенированию генома (с публикацией, как считается, окончательного варианта его последовательности) позволило уточнить первичную структуру ряда участков ДНК, но не решило окончательно вопрос о числе белок-кодирующих генов в геноме человека. Сопоставление различных баз данных по первичной структуре ДНК и экспрессирующихся последовательностей генома человека (таких как UCSC, RefSeq, Ensembl) говорит о том, что число белок-кодирующих генов составляет около 30000. Так, в базе данных RefSeq (4 версия) приведена информация о 27000 транскриптах, а в базе данных Ensembl - о 29800 транскриптах. Около 10% транскриптов представлено только в одной из баз данных. Кроме того, необходимо учитывать тот факт, что примерно у половины всех описанных транскриптов в настоящее время не известна функция.
Определение первичной последовательности генома человека послужило основой для развития как структурной геномики (в рамках которой исследуется собственно первичная структура генома), так и новых областей геномики - таких как функциональная геномика, посвященная всем аспектам работы генома - в первую очередь анализу транскриптома (изучение спектра мРНК в разных типах клеток) и протеома (исследование белкового набора в разных тканях). В последнее время все более активно развиваются исследования метаболома - набора клеточных метаболитов. Совместный анализ транскриптома, протеома и метаболома в разных типах тканей и клеток в процессе онтогенеза в норме и при различных заболеваниях - ключевая задача сегодняшнего этапа развития геномики человека.
Структурную и функциональную геномику можно рассматривать как аналог нормальной анатомии и нормальной физиологии в классической медицине. И так же как в медицине нормальная анатомия является основой для изучения патологической анатомии, так и структурная геномика является основой для патологической анатомии генома - изучения роли в патологии человека различных изменений в структуре генома.
В первую очередь патологическая анатомия генома позволила идентифицировать и охарактеризовать гены моногенных наследственных заболеваний. Результатом этих работ стало не только получение громадной по объему информации о вызывающих менделирующие заболевания мутациях, но и разработка новых эффективных технологий типирования ДНК, создание и хранение информационных баз данных, способов обработки больших массивов результатов.
Дальнейшее развитие работ по изучению патологической анатомии генома связано с поиском и анализом генетических факторов, играющих роль в определении сложных и количественных признаков - в том числе с поиском генов предрасположенности к мультифакториальным (многофакторным) заболеваниям. К числу таких заболеваний относятся все наиболее частые заболевания - такие как болезни сердечно-сосудистой системы, астма, сахарный диабет, многие неврологические и нейропсихиатрические заболевания. Таким образом, именно анализ частых заболеваний позволит революционизировать медицину в целом, переведя ее на молекулярный уровень. При этом предлагаемые в рамках молекулярной медицины методы лечения и профилактики частых заболеваний будут максимально учитывать особенности генетической организации каждого конретного человека.
Очевидно, что для решения поставленной задачи необходимо будет объединить получаемые при анализе структурных особенностей генома данные с данными функциональной геномики (анализ влияния тех или изменений структуры генома на экспрессию генов и структуру их белковых продуктов), сравнительной геномики (сопоставление структуры гомологичных генов у различных видов животных), этнической геномики (анализ отличий в структуре ДНК у представителей разных этнических групп), фармакогеномики (изучение роли особенностей организации генома в метаболизме различных ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов).
Разработка столь многочисленных проблем привела к существенному расширению областей интереса молекулярно-генетической науки, а также к распространению ее подходов и методов, как на смежные, так и достаточно отдаленные научные направления. К числу таких направлений в первую очередь относится медицинская генетика и взаимопроникновение этих двух областей науки привело к созданию нового направления исследований - медицинской геномики,
Медицинская геномика занимается определением генных дефектов при наследственных и других болезнях, изучением экспрессии мутантных генов и разработкой новых методов диагностики, лечения и профилактики. В рамках работ по медицинской геномике удалось разработать методы пресимптоматической, пренатальной и преимплантационной диагностики ряда наследственных заболеваний, начать работы по разработке методов генной терапии наследственных и приобретенных заболеваний, заложить основы профилактической геномно- ориентированной медицины.
Особый интерес представляет изучение молекулярно генетических основ наследственных и мультифакториальных неврологических и нейропсихиатрических заболеваний. Это связано с тем, что изучение этой группы болезней позволяет выявить и охарактеризовать новые экспрессирующиеся в нервной системе гены, что существенно расширит генетическую базу, закладывающую основы изучения молекулярных принципов функционирования нервной системы. Так, именно при изучении неврологических заболеваний был обнаружен новый, неизвестный ранее тип мутаций - динамические мутации.
В рамках медицинской геномики неврологических болезней в настоящее время исследования ведутся по двум основным направлениям - анализу моногенных неврологических заболеваний (картирование и клонирование их генов, анализ спектра мутаций, молекулярных механизмов формирования фенотипа) и разработке подходов к анализу так называемых сложных заболеваний, имеющих мультифакториальную природу - то есть зависящих как от генетических факторов, так и от факторов внешней среды (таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз). Их изучение является новым этапом в молекулярной генетике человека, который позволит разработать методы диагностики, лечения и профилактики, учитывающие генетические факторы риска, для группы наиболее распространенных болезней - таких инсульт, сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца. Цель и задачи исследования.
Основной целью работы было исследование молекулярно- генетических основ развития ряда моногенных неврологических болезней (миотоническая дистрофия Россолимо-Куршмана-Штейнерта- Баттена, ДОФА-зависимая и ДОФА-независимая торзионная дистония, болезнь Вильсона-Коновалова, спиномозжечковая атаксия типа 1) и мультифакториальных заболеваний (боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона) и разработка методов молекулярной диагностики и оценки генетических факторов риска возникновения и тяжести течения болезней.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
провести поиск характерных для российской популяции точковых и делеционных мутаций, вызывающих моногенные неврологические заболевания (ДОФА-зависимая и ДОФА-независимая торсионная дистония, болезнь Вильсона-Коновалова) и моногенные формы мультифакториальных заболеваний (ювенильная форма болезни Паркинсона), и разработать методы молекулярной диагностики наиболее распространенных из них;
- разработать методы диагностики динамических мутаций при заболеваниях с экспансией триплетных повторов типа CTG (миотоническая дистрофия Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена) и CAG (спиномозжечковая атаксия, хорея Гентингтона) и провести анализ связи между степенью экспансии и клиническим течением заболевания;
- изучить вклад ряда генетических систем (гены супероксидисмутаз, тяжелой цепи нейрофиламентов, глутатион S- трансфераз) в определение генетического риска развития бокового амиотрофического склероза и характера клинического течения заболевания;
- оценить вклад делеционных мутаций в гене паркина PARK2 в развитие спорадической формы болезни Паркинсона Научная новизна и практическая значимость исследования. В российской популяции впервые исследованы молекулярно-генетические основы развития ряда моногенных неврологических болезней (миотоническая дистрофия Россолимо- Куршмана-Штейнерта-Баттена, ДОФА-зависимая и ДОФА-независимая торзионная дистония, болезнь Вильсона-Коновалова, спиномозжечковая атаксия типа 1) и мультифакториальных заболеваний (боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона), что позволило разработать методы молекулярной диагностики и оценки генетических факторов риска возникновения и тяжести течения болезней. Анализ мутаций в гене ГТФ циклогидролазы І у больных ДОФА-зависимой торзионной дистонией показывает высокую генетическую микрогетерогенность этой болезни в российской популяции. Обнаружено шесть ранее не описанных мутаций, косегрегирующих с развитием заболевания. При ДОФА-зависимой торзионной дистонии основной причиной болезни является трехнуклеотидная делеция в гене торзинаА - она выявлена у 100% обследованных больных из "популяции евреев-ашкеназов и у 66% больных славянского происхождения. Наиболее частой причиной болезни Вильсона-Коновалова в российской популяции является мутация Hisl069Gln и в этой связи разработан метод быстрого типирования данной мутации. Экспансия триплетного повтора CTG в гене миотонин протеин киназы выявлена у 60 из 63 больных с клиническим диагнозом миотоническая дистрофия Россолимо Куршмана-Штейнерта-Баттена. Предложен метод молекулярной диагностики экспансии триплетных повторов в гене миотонин протеин киназы, который может быть использован для дифференциальной диагностики миотонической дистрофии Россолимо-Куршмана Штейнерта-Баттена и клинически близких форм миодистрофий. Изучена экспансия триплетного повтора CAG при спиномозжечковой атаксии типа 1 и болезни Гентингтона. Показана корреляция между числом (CAG)n повторов в генах атаксина 1 и гентингтина и возрастом первых клинических проявлений заболеваний. Для изучения генетических основ болезни Паркинсона разработан полуколичественный ПНР метод анализа делеций и дупликаций отдельных экзонов или групп экзонов в гене паркина PARK2 в гомозиготном и гетерозиготном состоянии. С помощью этого метода проведен анализ спектра делеционных мутаций в гене паркина у больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой и идиопатической формой болезни Паркинсона. У больных спорадической формой болезни двигательного нейрона проведен анализ ряда кандидатных генов заболевания. При этом в кодирующей области гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы SOD1 у 5,7% обследованных больных выявлены миссенс мутации G12R и D90A . Обнаружено, что S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития болезни двигательного нейрона в русской популяции. Генотип SS гена NEFH у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания. Положения, выносимые на защиту
1. Показана высокая генетическая микрогетерогенность ДОФА-зависимой торзионной дистонией в российской популяции. Обнаружено, что при ДОФА-независимой торзионной дистонии основной причиной заболевания является тринуклеотидная делеция GAG в гене торзина А.
2. Наиболее частой причиной болезни Вильсона-Коновалова в российской популяции является мутация Hisl069Gln. Соотношение генотипов по этой мутации различается при разных клинических формах заболевания и гомозиготность по мутации Hisl069Gln не встречается у детей с брюшной формой болезни.
3. Предложен метод молекулярной диагностики экспансии триплетных повторов в гене миотонин протеин киназы и показано, что увеличение размера блока триплетных повтора CTG в гене миотонин протеин киназы является причиной развития заболевания у большинства больных с клиническим диагнозом миотоническая дистрофия Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена, выявленных в России.
4. Экспансия триплетного повтора CAG при спиномозжечковой атаксии типа 1 и болезни Гентингтона обнаруживает корреляцию между числом (CAG)n повторов в генах атаксина 1 и гентингтина и возрастом первых клинических проявлений заболеваний.
5. Проанализирован спектр делеционных мутаций в гене паркина у больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой и идиопатической формой болезни Паркинсона в российской популяции.
При спорадической форме болезни Паркинсона выявлены не описанные ранее случаи делеции последнего 12 экзона гена паркина в гетерозиготном состоянии.
6. Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации D90A в составе «скандинавского гаплотипа» гена SOD1. Обнаружено, что S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза и характер клинического течения заболевания в русской популяции.
