Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
-
Нейральная индукция. Гены, участвующие в раннем паттернинге нервной ткани 10
-
Генетический контроль ранней спецификации теленцефалона 12
-
Формирование слоев коры головного мозга 14
-
Типы миграций в дорзальнои части теленцефалона 16
-
Гены и их взаимодействия, лежащие в основе региональной спецификации теленцефалона 20
-
Современные модели детерминации региональной клеточной судьбы в коре головного мозга 23
-
Морфогены в определение клеточной судьбы в дорзальнои части теленцефалона 24
-
Гены етх2 и рахб - два градиента экспрессии в спецификации фенотипа клеток коры головного мозга....28
-
Гены- молекулярные маркеры дорзального теленцефалона 30
-
Нарушение развития коры головного мозга и болезни коры головного мозга 31
-
Ген Sipl и нарушения, вызванные мутацией этого
гена 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1. Материалы и оборудование 36
-
Лабораторные животные 36
-
Оборудование 37
-
Реактивы 37
2.1.4 Буферные растворы 39
2.1.5. Микробиологические среды 41
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Получение библиотек кДНК 42
2.2.2. Дифференциальный скрининг библиотек
кДНК 44
2.2.3. Подтверждение дифференциальности фрагментов,
отобранных в результате дифференциального
скрининга 46
-
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 46
-
Клонирование 5'-концевых частей генов 46
-
Подготовка биологического материала 46
2.2.7. Анализ распределения РНК в ткани методом
гибридизации in situ на парафиновых секциях 47
2.2.8. Анализ распределения белка SIP1 в
эмбриональной ткани мозга мыши 48
2.2.9. Анализ морфологии посредством окрашивания
секций ткани мозга мыши по протоколу Nissl 49
2.2.10. Анализ уровня запрограмированной клеточной
смерти в эмбриональной ткани мозга мыши, полученной
при инактивации гена Sipl в коре головного мозга 50
2.2.11. Анализ пролиферативной клеточной активности
методом встраивания и последующей иммунодетекции
BrdU 50
2.2.12. Анализ распределения мРНК в ткани методом
гибридизации in situ на «замороженных» секциях 51
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 53
ЗЛ Применение вычитающей гибридизации на модели коры
головного мозга мыши 53
3.2. Анализ генов, полученных в результате вычитающей
гибридизации 56
-
Клонирование гена празЗ, нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS домен... 56
-
Анализ экспрессии гена npas3 в эмбриогенезе мыши 59
-
Доменная организация белка Npas3 60
-
Клонирование фактора транскрипции Sipl 61
3.2.5. Паттерн экспрессии гена Sipl в период
эмбрионального развития 62
3.2.6. Анализ паттерна экспрессии Sipl в конечном
мозге 64
3.2.7. Экспрессия SIP1 в Reeler мутанте 67
-
Анализ функции гена SIP1 в развитии конечного мозга 67
-
Тканеспецифическая инактивация гена Sipl 68
2.10. Анализ морфологии мозга мышей, полученных при
инактивации гена SIP1 в базальном ганглии 70
3.2.11. Фенотипический анализ мутантов, полученных
при инактивации гена SIP1 в коре головного мозга 72
ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 79
ВЫВОДЫ 80
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81
БЛАГОДАРНОСТИ 92
Введение к работе
Актуальность работы. В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно- биологической и молекулярно- генетической техники. Понятно, что особое внимание уделяется при этом тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения в первую очередь теленцефалону.
Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (pallium) (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (subpallium) (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональных структур, таких как таламус, гипоталамус, обонятельный эпителий и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.
Теленцефалон человека- это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности.
Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных и основные элементы его организации теленцефалона в эволюции в ряду позвоночных, несмотря на высокую морфологическую вариабельность.
Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.
До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением морфологии и анатомии. И в этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно- биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Определенный прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона, был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.
Цель и задачи исследования. Цель данного исследования -идентификация генов, вовлеченных в регуляцию развития коры головного мозга. Задачи исследования предусматривают: 1) разработку методики поиска и отбора генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга; 2) клонирование и определение первичной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов; 3) анализ экспрессии; 4) функциональный анализ.
Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода вычитающей гибридизации нам удалось клонировать ряд транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга. Был проведен анализ паттернов экспрессии выявленных генов в эмбриональной коре головного мозга. Выявленные в ходе данной работы гены являются молекулярными маркерами различных слоев коры и могут быть использование как инструмент для изучения развития коры головного мозга.
Один из генов, Sipl был подвергнут функциональному анализу с использованием метода ткане-специфической инактивации белкового продукта гена. Было показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.
Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы.
Апробация результатов. Результаты работы были представлены на двух международных конференциях (Annual meeting of German genetic society, AMGGS, Kassel, 2003; Neural Stem Cell Conference (NSCC), Melbourn, 2003), а также на семинаре лаборатории «неирогенетики и генетики развития», института биологии гена (февраль 2006).
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на « 92 » страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (95 источников). Содержит 21 рисунок.
