Содержание к диссертации
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯГЛАВА
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика микоплазм
1.1.1. Классификация, строение и физиология микоплазм
1.1.2. Адгезия микоплазм на клетки хозяина
1.1.3. Особенности взаимодействия микоплазм с клеткой хозяина и его иммунной системой
1.2. Транскрипционный фактор NF-kB и его роль в реализации различных клеточных функций
1.2.1. Строение и функции транскрипционного фактора NF-kB
1.2.2. Пути активации транскрипционного фактора NF-kB
1.2.3. Апоптоз. Роль NF-kB в регуляции апоптоза
1.2.3.1. Апоптоз. Механизм реализации
1.2.3.2. Роль NF-kB в регуляции апоптоза
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма DH5a
2.2.2. Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма DH5a
2.2.3. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.4. Выделение тотальной ДНК
2.2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.6. Рестрикционный анализ ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2.8. Выделение, наращивание и видовая идентификация микоплазм
2.2.9. Выделение фракции липид-ассоциированных мембранных белков микоплазм
2.2.10. Экспериментальное заражение культур клеток микоплазмой
2.2.11. Полимеразная цепная реакция
2.2.12. ПНР в режиме реального времени
2.2.13. Измерение активности ферментов микоплазмы в культуральной среде
2.2.14. Измерение активности {З-галактозидазы
2.2.15. Иммуноблотинг
2.2.16. Метод окраски клеток метиленовым голубым
2.2.17. Определение количества живых клеток по реакции с субстратом
2.2.18. Получение лентивируса методом котрансфекции
2.2.19. Выделение тотальной РНК из культуры клеток
2.2.20. Реакция обратной транскрипции
2.2.21. Измерение активности каспаз-3/
2.2.22. Измерение уровня митохондриального трансмембранного потенциала (A\j/m)
2.2.23. Измерение концентрации цитокинов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Экспериментальное заражение и идентификация микоплазм в культурах клеток
3.2. Анализ способности различных видов микоплазм активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействия с Толлподобными рецепторами
3.2.1. Различные виды микоплазм приводят к активации NF-kB в клетках при взаимодействии с Толл-рецептором
3.2.2 Определение возможных сочетаний Толл-подобных рецепторов, вызывающих активацию транскрипционного фактора NF-kB после взаимодействия M.arginini или ее структурными компонентами
3.3. Микоплазмы и их липид-ассоциированные мембранные белки повышают выживаемость клеток линии 293, экспрессирующих Толлподобные рецепторы 2/6, при действии химиотерапевтических препаратов
3.4. Блокирование функциональной активности NF-kB в клетках, инфицированных микоплазмой, приводит к отмене их устойчивости к химиотерапевтическим препаратам
3.5. Анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов и в различных опухолевых линиях клеток
3.6. M.arginini и ее структурные компоненты подавляют апоптоз в опухолевых клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2/6, при действии химиотерапевтических препаратов
3.7. Изучение кинетики роста опухолевых клеток WEHI-3B при инфекции M.arginini или добавлении ее структурных компонентов в эксперименте in vitro
3.8. Влияние микоплазменной инфекции клеток WEHI-3B на прогрессию мышиной миеломоноцитарной лейкемии в экспериментах in vivo
3.9. Влияние диациллипопептида M.arginini на пролиферацию и резистентность к химиотерапевтическим препаратам опухолевых клеток WEHI-3B в экспериментах in vivo
3.10. Изучение влияния структурного компонента M.arginini (R-Pam2) на продукцию факторов, стимулирующих пролиферацию клеток мышиной миеломоноцитарнои лейкемии WEHI-3B in vivo
ГЛАВА
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ АК - аминокислота БСА - бычий сывороточный альбумин ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагалъный колоние-стимулирующий фактор ДАТ - диацилглицерин ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат ИЛ - интерлейкин кДа - килодальтон КОЕ - колониеобразующая единица ЛАМБ - липид-ассоциированные мембранные белки ЛПС - липополисахарид мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-у1)-2,5-дифенил тетранатрий бромид ПАМС - патоген-ассоциированные молекулярные структуры ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК — рибонуклеиновая кислота рРНК — рибосомальная рибонуклеиновая кислота ТМ - трансмембранный домен тРНК — транспортная рибонуклеиновая кислота тыс.н.п. — тысяч нуклеотидных пар УФ - ультрафиолет ФНО - фактор некроза опухоли ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ANK - анкириновые повторы API - активаторный белок APAFl - фактор, активирующий апоптозную протеазу В АХ - белок X, ассоциированный с Вс Bel - белок В-клеточной лимфомы ВН - BCL-2-гомологичный домен CARD — домен, привлекающий каспазу c-IAPl - белок, ингибитор апоптоза СК2 - казеин-киназой-П CMV - цитомегаловирус DD - «домен смерти» DD - регион, гомологичный домену смерти DISC — сигнальный комплекс, индуцирующий смерть ELKS23 - белок богатый глютамином (Е), лейцином (L), лизином (К) и сериуом (S) FADD - ФНО-ассоциированный «домен смерти» HBV - вирус гепатита В НСС - злокачественная гепатома HCV - вирус гепатита С HLH — домен типа «спираль-петля спираль»
IkB - ингибитор «каппа-би»
IKK - IkB киназа
IRAK - киназа, ассоциированная с рецептором ИЛ- JNK - киназа Януса LMP1 - латентный мембранный белокMALP - макрофаг-активирующий липопептид микоплазм МСР-1 - моноцитарный хемоатрактантный белок MIP-1 - макрофагальный воспалительный белок MLOs - микоплазма-подобные организмы MnSOD - марганец супероксиддисмутазы MyD88 - белок первичного ответа миелоидной дифференциации NBD - NEMO-связывающий домен NEMO - эссенциальный модулятор NF-kB NES - сигнал ядерного экспорта NF-kB — ядерный фактор «каппа-би» NGF - фактор роста нервов NIK - NF-kB-индуцирующая киназа NLS - сигнал ядерной локализации OD - оптическая плотность ONPG - О-нитрофенил-Ь-О-галактопиранозидаза PEST - пролин (Р), глутамин (Е), серии (S) богатый домен РКС - протеинкиназа С RHD - REL гомологичный домен ROS - активные формы кислорода SDS - натрия додецилсульфат SOD - супероксиддисмутазы ТАВ1 - ТАК 1-связывающий белок ТАЕ — трис-ацетатный буфер ТАК1 - трансформирующий ростовой фактор -Р-активируемая киназа TCR - Т-клеточный рецептор TD - трансактивационный домен TLR - Толл-подобный рецептор TNF - фактор некроза опухоли TRADD - белок, ассоциированный с «доменом смерти» рецептора ФНО TRAF - фактор, ассоциированный с рецептором ФНО TRAIL - лиганд, вызывающий апоптоз, связанный с ФНО XIAP - Х-связанный ингибитор белков апоптоза ZF - домен типа «цинковый палец»
Введение к работе
1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Микоплазмы (класс Mollicutes) - мельчайшие патогенные бактерии, характерной особенностью которых является отсутствие клеточной стенки, что обуславливает специфику таких их морфологических и физиологических свойств, как полиморфизм, пластичность, осмотическая неустойчивость к воздействию детергентов и т.д. Представители данного семейства являются причиной различных инфекций животных и человека: острых и хронических заболеваний суставов, инфекций респираторного и урогенитального тракта. Многие виды микоплазм (М. arginini, M.bovis, M.fermentans и др.) характеризуются широким тропизмом, в связи с чем, способны вызывать инфекции, поражая различные органы и ткани [6].
Главными особенностями микоплазм является их способность персистировать in vivo и in vitro в течение длительного периода без какихлибо клинических проявлений. Такая способность микоплазм обусловлена рядом особенностей,, которые позволяют им эффективно «ускользать» от иммунной системы хозяина. К таким особенностям относятся: молекулярная мимикрия и фенотипическая пластичность, которые приводят к тому, что микоплазмы не полностью или не эффективно распознается иммунной системой хозяина. Наличие таких механизмов изменчивости позволяют микоплазмам персистировать в организме хозяина в течение длительного периода, часто переходя в хроническую форму [16], [149], [152].
В работах различных отечественных и зарубежных авторов было показано, что различные бактериальные и вирусные патогены, способные вызывать хронические инфекции, ассоциированы с опухолевой прогрессией.
Так, было показано, что вирус папилломы человека, вирус гепатита В (HBV) и гепатита С (HCV), а также вирус Эпштейна-Барр являются факторами риска при злокачественных образованиях, таких как рак шейки матки, злокачественная гепатома (НСС) и лимфопролиферативные заболевания, соответственно, a Helicobacter pylori участвует в прогрессии рака желудка, являющегося вторым по распространенности опухолевым заболеванием в мире [36], [159].
Наряду с перечисленными патогенами, в различных исследованиях, выполненных в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством Г.Я. Каган, И.В. Раковской, а также рядом зарубежных авторов было показано, что микоплазмы также способны стимулировать опухолевую прогрессию. В частности было установлено, что при совместном инфицировании с вирусом саркомы Раушера микоплазма индуцирует лейкозы у 30% мышей, резистентных к данному вирусу; белок р37 M.hyorhinis повышает инвазивность клеток опухоли простаты РС-3, DU-145 в экспериментах in vitro; M.fermentans способна усиливать прогрессию рака почки [3], [141], Однако механизмы, которые обусловливают это свойство микоплазм, остаются невыясненными. В связи с чем, получение новых данных, связанных с изучением влияния микоплазм на рост клеток опухоли и прогрессию опухолевого заболевания, имеет существенное значение для выяснения молекулярных механизмов взаимодействия бактериальных патогенов с клетками хозяина, а также для выяснения роли хронических бактериальных инфекции в прогрессии опухолевых заболеваний. Поэтому изучение описанных свойств микоплазм в настоящее время представляет научный и практический интерес.
Недавние исследования показали, что микоплазма способна в результате взаимодействия с Толл-подобными рецепторами на поверхности клетки приводить к активации транскрипционного фактора NF-kB. NF-kB (nuclear factor «kappa-B») является главным регулятором воспаления и наряду с регуляцией экспрессии генов врожденного и приобретенного иммунитета, является мощным ингибитором апоптоза, индуцирующим экспрессию различных анти-апоптотических факторов (антиапоптотические белки, такие как c-FLIP, c-IAPl, C-IAP2, XIAP, Bcl-XL, Bfl-1/Al и р53), а также участвует в регуляции клеточной пролиферации (например, циклины, с-тус) [118].
Описанные свойства транскрипционного фактора NF-kB обусловливают его роль в стимуляции канцерогенеза. Известно, что конститутивная активация NF-kB наблюдается более чем в 90% опухолей, среди которых болезнь Ходжкина [177], острый лимфобластозный лейкоз [147], [191], [53], множественная миелома [12], рак молочной железы [34], рак толстой кишки [166], рак легкого [184], рак яичников, рак простаты, различные виды лимфом [216], [212], рак печени [196], меланома [205] и др.
В настоящее время не показана способность микоплазм в результате активации транскрипционного фактора NF-kB при взаимодействии с Толлподобными рецепторами оказывать влияние на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток и тем самым усиливать опухолевую прогрессию. Изучение указанного свойства микоплазм дает основания полагать, что определенные закономерности, выявленные в этом исследовании, могут иметь не только теоретический интерес, но могут оказаться полезными и для практической онкологии. В целом исследование молекулярных механизмов взаимоотношения микоплазм с клетками хозяина даст возможность адекватно оценить значение микоплазм при многих патологических процессах.
2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение влияния микоплазм и их липид-ассоциированных мембранных белков на выживаемость и пролиферацию опухолевых клеток в результате активации в них транскрипционного фактора NF-kB.
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи.
1. Отработать условия экспериментального заражения культур клеток различными видами микоплазм с последующей идентификацией и количественной оценкой микоплазм в инфицированных клетках.
2. Провести анализ способности микоплазм и их липидассоциированных мембранных белков активировать транскрипционный фактор NF-kB в клетках в результате взаимодействия с Толл-подобными рецепторами 2 и 6 в экспериментах in vitro.
3. Изучить влияние Толл-рецептор-зависимой активации NF-kB при микоплазменной инфекции или добавлении липид-ассоциированных мембранных белков микоплазм к клеткам линии 293 на их выживаемость при обработке химиотерапевтическими препаратами.
4. Провести анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов 2 и 6, участвующих в распознавании липопептидов микоплазм, в различных опухолевых линиях клеток.
5. На модели опухолевой линии клеток, экспрессирующей Толлподобные рецепторы 2 и 6, изучить влияние микоплазмы и ее липидассоциированных мембранных белков на скорость пролиферации и подавление апоптоза в клетках при генотоксических стрессах в экспериментах in vitro.
6. Изучить влияние микоплазмы на пролиферацию и резистентность к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6, в экспериментах in vivo.
3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В результате проведенной работы впервые были идентифицированы сочетания Толл-подобных рецепторов, являющихся специфическими для M.arginini, а также впервые для данного вида микоплазмы и ее структурных компонентов была показана способность активации транскрипционного фактора NF-kB при взаимодействии с Толл-подобными рецепторами на поверхности клетки. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизма распознавания врожденной иммунной системой хозяина клеток M.arginini.
Впервые была показана способность микоплазм и их липидассоциированных мембранных белков в результате Толл-рецепторзависимой активации транскрипционного фактора NF-kB приводить к подавлению апоптоза в опухолевых клетках при действии химиотерапевтических препаратов.
На модели мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в эксперименте in vivo впервые была показана способность M.arginini и ее структурных компонентов (диациллипопептидов) повышать пролиферацию и устойчивость к действию химиотерапевтических препаратов опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6.
Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое применение. Результаты, полученные в данной работе, показывают, что антигены микоплазмы, которые как известно, способны к длительной циркуляции в организме могут негативно влиять на рост и устойчивость к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6. Полученные результаты показывают необходимость проведения дополнительных диагностических и профилактических мероприятий, направленных на идентификацию и лечение микоплазменных инфекций у больных при проведении курса химиотерапии опухоли.
