Введение к работе
Актуальность проблемы. Тейхоевые кислоты - анионные полимеры клеточных стенок, обязательным структурным элементом которых являются полиолфосфаты. Тейхоевые кислоты (ТК) широко распространены среди грамположительных бактерий и составляют до 60% от веса клеточной стенки содержащих их бактерий. Ковалентно связанные с пептидогликаном (ПГ), ТК представляют неотъемлемую часть клеточной стенки и, таким образом, находятся в тесной связи со всеми процессами, происходящими при ее участии. Среди них -рост и деление, связывание и резервирование катионов, необходимых для функционирования мембранных ферментов, процессы межклеточного узнавания, рецепция фагов и патогенность.
Тейхоевые кислоты и другие анионные соединения, связанные с ПГ по всей толще клеточной стенки, вносят существенный вклад в формирование структуры полиэлектролитного геля и определяют механические свойства стенки. Отталкивание одноименных зарядов поддерживает ПГ в растянутом состоянии, способствует его пористости [Archibald et al., 1990].
Проблема изучения ТК имеет несколько аспектов. Фундаментальный аспект включает изучение структурного разнообразия биополимеров. Полученная информация о строении полимеров важна для понимания их свойств, функций в микробной клетке, выяснения механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой. Изучение ТК в значительной степени расширяет наши представления о биоразнообразии природных соединений.
ТК в последние десятилетия являются объектами медицинских исследований Исследование клеточных стенок патогенных микроорганизмов привело к пониманию таких важных явлений как адгезия, вирулентность, образование биопленок на имплантированных материалах [Rijnaarts et al., 1995; Hussain et al., 2001], а также природы некоторых аутоимунных заболеваний человека [Дерябин и Каральник, 1983]. Тейхоевые кислоты наряду с другими компонентами клеточных стенок ответственны за чувствительность клетки к ряду антибиотиков и
ГОС. НАЦИОНАЛЬНА* .
БИБЛИОТЕКА I
1 ^1
иммуномодуляторные свойства бактерий [Wicken and Knox, 1975; Archibald, 1980; Glark et al , 2000].
Исследование анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий представляет интерес также с точки зрения таксономии микроорганизмов Возможность использования тейхоевых кислот в таксономии обсуждается с момента их открытия. Для ряда таксонов порядка Actinomycetales была продемонстрирована возможность использования тейхоевых кислот в качестве хемотаксономических признаков Признак "наличие ТК" дифференцирует таксоны высших порядков, таких как подпорядок и семейство [Евтушенко, 2003], в то время как структура ТК может служить маркером для дифференциации актиномицетов на у ровне вида [Naumova et al, 2001]. В связи со всем вышесказанным представляется актуальным изучение структур тейхоевых кислот - представителей как можно большего числа родов порядка Actinomycetales.
Состояние вопроса. Проблеме изучения стеночных тейхоевых кислот около пятидесяти лет ТК, открытые впервые в клеточных стенках лактобацил и стафилококков, представляли собой глицерин- и рибитфосфатные полимеры, несущие в качестве гликозильных заместителей глюкозу или аминосахар [Armstrong et al., 1958]. Почти в это же время ТК были обнаружены проф. Наумовой И.Б. и акад. Белозерским А.Н. [Наумова и др., 1962] в клеточных стенках актиномицетов. С тех пор эти полимеры успешно изучают на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ. За прошедшее время были исследованы около 250 штаммов, принадлежащих различным семействам и родам порядка Actinomycetales, в том числе и выделенным и описанным недавно. Изучение актиномицетов позволило открыть принципиально новые структуры, структурные типы и структурные элементы ТК.
Со временем представления о составе ТК расширялись: были открыты маннит-и арабитсодержащие полимеры, рибиттейхоевые кислоты с 3,5-типом фосфодиэфирной связи и тейхоевые кислоты, содержащие в интегральной цепи углеводный компонент. Во многом эти достижения стали возможными благодаря применению новьр?методов-йзучени'яуглеродсодержащих биополимеров- с конца
' ,. ' 2
1970-х годов структуры ТК начали исследовать методами ЯМР-спектроскопии [De Boer et al, 1976, 1978; Shashkov et al., 1979].
Анализ экспериментальных данных по структурам тейхоевых кислот, описанных в литературе, позволил выделить 4 структурных типа этих полимеров на основании природы фосфодиэфирных связей в интегральной цепи: поли(полиолфосфаты) (I тип), поли(гликозилполиолфосфаты) (И тип) и полимеры смешанной структуры (III и IV типы) [Наумова и Шашков, 1997]. В зависимости от природы полиола и положения фосфоэфирной связи, объединяющей элементы интегральной цепи, выделяют подтипы тейхоевых кислот [Naumova et al , 2001].
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучение структурного разнообразия тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов (не исследованных ранее или перспективных в плане поиска новых структур), а также сравнительный анализ структур ТК для решения ряда таксономических задач.
В задачи исследования входило:
изучение распространения ТК клеточных стенок представителей родов Actinomadura (24 штамма), Nonomuraea (12 штаммов), Brevibacterium (12 штаммов) и некоторых других организмов (4 штамма, 3 вида);
установление структур ТК ряда актиномицетов, представляющих интерес, как в структурном, так и в таксономическом отношении;
анализ возможностей использования данных по структуре тейхоевых кислот в целях классификации и идентификации представителей родов Actinomadura, Nonomuraea и Brevibacterium.
Научная новизна и значимость работы. Впервые в клеточных стенках представителей родов Actinomadura, Nonomuraea и Glycomyces обнаружены ТК и установлены их структуры.
Установлено 11 новых структур тейхоевых кислот, в том числе уникальная структура тейхоевой кислоты, содержащей в качестве полиола эритрит. Впервые обнаружены ТК, несущие остатки а-галактозамина, З-О-метилгалактозы
(мадурозы), 3-<9-метилрамнозы, глутаминовой и ортофосфорной кислот. На основании данных этой работы выделены два новых подтипа ТК.
Впервые проведено широкое сравнительное исследование структур и состава анионных полимеров клеточных стенок штаммов p. Brevibacterium, в том числе и гетерогенной группы организмов, причисляемых к виду Brevibacterium linens в соответствии с фенотипическими характеристиками. С использованием полифазного подхода и, в значительной степени, на основании различий в составе дифференцирующих Сахаров и полиолов ТК были описаны три новых вида. Установлено, что клеточные стенки бревибактерий наряду с ТК могут содержать анионные полимеры другой природы, сахар-1-фосфатной, мало исследованные в настоящее время, а также тейхуроновые кислоты.
Результаты работы, которая является первым исследованием тейхоевых кислот актиномадур, нономурий и гликомицетов углубляют наши представления о распространении ТК в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales, а исследованные ТК, сахар-1-фосфатные полимеры и тейхуроновая кислота - о строении бактериальной клетки.
Практическая ценность. С использованием полученных данных о составе Сахаров и полиолов ТК разработана система идентификации бактерий рода Brevibacterium, представители которой используются в сыроделии. Результаты о распространении и структуре ТК могут служить для усовершенствования системы идентификации актиномицетов родов Actinomadura и Nonomuraea, продуцентов антибиотиков и других биологически активных веществ, а также - в практике идентификации других возможных продуцентов новых антибиотиков или иных организмов, представляющих интерес при решении биотехнологических задач.
Данные ЯМР-спектроскопии по химическим сдвигам ,3С атомов ряда ТК пополнили базу данных по спектрам ЯМР и могут быть полезны при анализе структур близких полимеров другими исследователями.
Данные работы о строении и распространении ТК входят в магистерский курс "Полифазная таксономия и идентификация микроорганизмов" в ПущГУ и могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии и микробиологии на
биологических факультетах университетов или институтов. Ряд результатов, представленных в работе, вошел в современные обзоры, монографии и главу международного руководства по микробиологии (Neuhaus and Baddiley, Microbiol. Mol.Biol.Rev. 2003. 67(4):686-72; "The Bacterial Cell wall" [Seltmann and Hoist, 2002], The Family Nocardiopsaceae. In: "Prokaryotes" [Kropenstedt and Evtushenko, 2002, (www. )] и др.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 работы, из них 21 экспериментальных статей, 1 обзор и тезисы 12 докладов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" (Ленинград, 1984); 8-ой Всесоюзной конференции «Химия и биохимия углеводов» (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); Конференция «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 1995); 2-ом Съезде биохимического общества РАН «Хемотаксономические перспективы» (Пущино, 1997); Симпозиуме ИНТАС «Микробные и клеточные системы в фармакологии, биотехнологии, медицине и окружающей среде» (Москва, 1999); Международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000); 10-ом Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002); 2-ой Германо-Польско-Российской углеводной конференции (Москва, 2002), 1-ом конгрессе FEMS европейских микробиологов (Любляна, 2003); 2-ом Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме, посвященном 120-летию со дня рождения академика В.Н. Шапошникова «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (6 глав), материалов и методов, их обсуждения, результатов исследования (3 главы), обсуждения результатов, заключения, семи выводов и списка цитируемой литературы.
