Содержание к диссертации
Список сокращений 7
Введение 9
Обзор литературы. Тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок
грамположительных бактерий: структурное разнообразие,
распространение и некоторые функции, экологические аспекты 18
Глава I. Тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточной поверхности
грамположительных бактерий 19
Клеточная стенка грамположительных бактерий 20
Пептидогликан 23
Химическая структура пептидогликана 23
Пространственная структура пептидогликана 26
1.3. Тейхоевые и тейхуроновые кислоты 30
1.3.1. Тейхоевые кислоты 31
1.3.1.1. Разнообразие структур тейхоевых кислот 33
1.3.2. Тейхуроновые кислоты 39
1.3.2.1. Распространение тейхуроновых кислот у различных
грамположительных организмов 40
1.4. Сахар-1 -фосфатные полимеры 42
1.4.1. Распространение сахар-1-фосфатных полимеров у
грамположительных бактерий 43
Анионные полисахариды 43
Биологическая роль связанных с клеточной стенкой анионных
углеводсодержащих полимеров 47
1.6.1. Тейхоевая кислота является необходимым стеночным полимером
функционально отличным от тейхуроновой кислоты 51
1.7. Краткое заключение 53
Глава II. Современная классификация актиномицетов 54
2.1. Актиномицеты - микроорганизмы, способные к биосинтезу многих
биологически активных веществ 55
2.2. Современная система классификации актинобактерий
базируется на полифазном принципе 57
2.2.1. Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические
признаки как основной критерий выделения родов актиномицетов
на начальном этапе развития их классификации 57
Развитие хемотаксономии позволило усовершенствовать ранее принятую систематику актиномицетов 59
Геномные характеристики штаммов и видов 66
2.3. Краткое заключение 72
Глава III. Стрептомицеты - возбудители парши обыкновенной у картофеля и
корнеплодов 73
Экономический урон 73
Роль поверхностных структур клеточной стенки в фитопатогенности 74
Общие свойства, характерные для фитопатогенных микроорганизмов 74
Адгезия зависит от свойств клеточной поверхности 75
3.3. Парша обыкновенная у картофеля, вызываемая различными видами
стрептомицетов 76
Симптомы, вызываемые фитопатогеном и формы парши обыкновенной 76
Как происходит процесс инфекции 78
3.3.3. Факторы патогенности 79
3.3.3.1. Токсины 79
3.3.3.2. Другие факторы патогенности 82
3.3.4. "Остров патогенности" у стрептомицетов 84
3.4. Фитопатогенные виды стрептомицетов 85
Филогения фитопатогенных стрептомицетов 86
Некоторые представители фитопатогенных стрептомицетов 86
3.5. Краткое заключение 89
Экспериментальная часть.
Глава IV. Материалы и методы, использованные в работе 90
Объекты исследования и накопление биомассы актиномицетов 90
Методы исследования 92
Получение клеточных стенок 92
Получение пептидогликана 92
Получение препаратов теихоевых кислот и гликополимеров 93
Получение препаратов тейховых кислот из целого мицелия 93
Получение препаратов теихоевых кислот и гликополимеров из
клеточных стенок 93
4.2.3.3. Очистка и разделение теихоевых кислот и гликополимеров 93
4.2.4. Общие методы анализа 94
Нисходящая хроматография и электрофорез на бумаге 94
Количественные аналитические методы 96
Определение форм фосфора 96
Определение моносахаридов 98
Определение глицерина, рибита, формальдегида 98
Определение аминосахаридов 99
Определение пировиноградной кислоты 99
4.2.5. Химические методы изучения первичной структуры теихоевых
кислот и гликополимеров 100
Кислотный гидролиз 100
Щелочной гидролиз 101
Ферментативный гидролиз и определение длины цепи
тейхоевой кислоты 101
Периодатное окисление 102
Определение 0-ацильных групп 102
Нингидриновое окисление 103
Определение молекулярной массы теихоевых кислот 104
Идентификация фосфолипидов 104
Определение абсолютной конфигурации некоторых заместителей
в молекулах теихоевых кислот и гликополимеров 105
4.2.6. Инструментальные методы изучения первичной структуры теихоевых
кислот и гликополимеров 106
4.2.6.1. ЯМР-Спектроскопические методы исследования теихоевых кислот
и гликополимеров 106
4.2.6.2. Масспектроскопия MALDI-TOF 107
4.3. Изучение морфологических и культуральных признаков исследуемых
актиномицетов 107
Методы определения фитопатогенных свойств актиномицетов 107
Молекулярно-генетические методы исследования и их компьютерная
обработка 107
4.6. Обсуждение методов, используемых в работе 108
Получение клеточных стенок актиномицетов 109
Выделение теихоевых кислот и гликополимеров 109
Разделение и очистка тейхоевых кислот и гликополимеров 111
Методы установления первичной структуры тейхоевых кислот и
гликополимеров 112
4.6.4.1. Химические (деструктивные) методы 113
ЯМР-спектроскопия 116
Масс-спектроскопия MALDI TOF 119
Глава V. Разнообразие структур тейхоевых кислот и других гликополимеров
клеточных стенок актиномицетов 120
5.1. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок представителей видов и
подвидов рода Nocardiopsis 120
5.1.1. Тейхоевая кислота клеточной стенки Nocardiopsis dassonvillei
ssp. dassonvillei и Nocardiopsis dassonvillei ssp. antarcticus 120
5.1.2. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Nocardiopsis
synnemataformans Ас-2518 128
5.1.3. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Nocardiopsis
halotolerans Ас-2519т 133
5.1.4. Тейхоевые кислоты клеточных стенок Nocardiopsis alba ВКМ
Ас-1883т,ВКМАс-1879иВКМАс-1884 135
5.1.5. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Nocardiopsisprasina
ВКМАс-1880т 143
5.1.6. Тейхоевая кислота клеточной стенки Nocardiopsis composta
ВКМ Ас-2520 и Nocardiopsis compos ta ВКМ Ас-2521т 145
5.1.7. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Nocardiopsis me tallica
ВКМАс-2522т 148
5.1.8. Тейхоевая кислота клеточной стенки Nocardiopsis trehalosi
ВКМАс-942 149
5.2. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок представителей видов
рода Glycomyces 150
5.2.1. Структура тейхоевой кислоты клеточной стенки Gycornyces
rutgersensisW3AAc-\2A% 150
5.2.2. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок Gycomyces
harbinensis ВКМ Ас-1247, G. harbinensisNRRL 16897 и
G.harbinensisWO 14487т 152
5.3. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок представителей видов
рода Nocardioides 155
5.3.1. Тейхоевая кислота клеточной стенки Nocardioides albus
ВКМАс-805т 155
5.3.2. Тейхоевая кислота клеточной стенки Nocardioides lutens
ВКМ Ас-1246 и 12 других штаммов этого вида 160
5.3.3. Тейхоевая кислота клеточной стенки «N albus» ВКМ Ас-806 165
5.4. Структуры анионных полимеров клеточных стенок представителей
некоторых видов рода Streptomyces 166
5.4.1. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Streptomyces castelarensis
ВКМ Ас-832т (ранее S. rutgersensis ssp. castelarensis) 166
5.4.2. Тейхоевые кислоты и кислый полисахарид клеточной стенки
Streptomyces melanosporofaciens ВКМ Ас-1864 171
5.4.3. Тейхоевые кислоты и кислый полимер клеточных стенок Streptomyces
hygroscopicus ВКМ Ас-831т, S. violaceusniger ВКМ Ас-583т,
S. endusBYM Ас-1331т, а также S. endusВКМ Ас-129 174
5.4.4. Тейхоевые кислоты клеточной стенки Streptomyces sparsogenes
ВКМАс-1744т 175
5.4.5. Тейхоевые кислоты и анионный олигомер клеточной стенки
Streptomyces sp. BKM Ac-2274 (МБ-8) 180
5.4.6. Тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточной стенки
Streptomyces s$. МБ-2, МБ-5, МБ-6, МБ-7, МБ-10 188
5.4.7. Тейхоевая и тейхуроновая кислоты клеточной стенки
Streptomyces sp. BKM Ас-2534 192
5.5. Тейхоевая кислота и нейтральный полисахарид клеточной стенки
Kineosporia aurantiaca BKM Ас-702т 200
5.6. Краткое заключение 206
Глава VI. Тейхоевые кислоты клеточных стенок как видоспецифический маркер
актиномицетов 207
6.1. Структуры и набор тейхоевых кислот клеточных стенок как
видоспецифические маркеры видов и подвидов рода Nocardiopsis 207
6.1.1. Тейхоевые кислоты клеточных стенок видов и подвидов рода
Nocardiopsis 209
Виды и подвиды JV. dassonvillei 209
Видовая группа N. alba 212
Другие изученные видовые группы рода Nocardiopsis 215
6.1.2. Использование сочетания (набора) тейхоевых кислот в таксономии
рода Nocardiopsis 216
6.1.2.1. Структура тейхоевых кислот клеточных стенок и их набор
являются хемотаксономическими характеристиками видов
и подвидов 216
6.1.2.2. Дифференцирующие характеристики видов и подвидов рода
Nocardiopsis, основанные на сравнении продуктов химической
деградации их клеточных стенок 218
6.1.3. Спектры 13С ЯМР как внутривидовой указатель для рода
Nocardiopsis 222
6.1.3.1. 13С ЯМР спектры тейхоевых кислот группы N. dassonvillei 222
6.1.3.2.13С-ЯМР спектр тейхоевой кислоты клеточной стенки
N. trehalosei 225
6.1.3.3.13С-ЯМР спектр тейхоевой кислоты клеточной стенки
N. tropica 225
6.1.3.4.13С-ЯМР спектр тейхоевых кислот клеточных стенок
представителей группы N. alba 225
6.2. Хемотаксономическая специфичность тейхоевых кислот клеточных
стенок актиномицетов рода Glycomyces
Тейхоевые кислоты клеточных стенок видов рода Glycomyces 226
Использование структуры и набора тейхоевых кислот в таксономии
рода Glycomyces 227
6.2.3. Дифференцирующие характеристики видов рода Glycomyces,
основанные на сравнении продуктов химической деградации
их клеточных стенок 229
6.2.4. Спектры 13С ЯМР как внутривидовой указатель для рода Glycomyces 231
6.2.4.1.13С-ЯМР Спектр тейхоевой кислоты из клеточной стенки G. tenuis 231
6.2.4.2. Сравнение спектров 13С-ЯМР препаратов тейхоевых кислот
клеточных стенок G. rutgersensis и G. harbinensis 231
6.3. Хемотаксономическая специфичность тейхоевых кислот клеточных
стенок актиномицетов рода Nocardioides 233
6.3.1. Тейхоевые кислоты клеточных стенок видов рода Nocardioides 234
6.3.2. Структура тейхоевой кислоты клеточной стенки является
хемотаксономическим маркером образующих мицелий видов рода
Nocardioides 235
6.3.2.1. Структура тейхоевой кислоты дифференцирует два образующих
мицелий вида рода Nocardioides и служит уточнению диагноза
видов Nocardioides albus и Nocardioides hiteiis 235
6.3.2.2. Структура тейхоевой кислоты клеточной стенки служит
основанием для лредложения нового вида рода Nocardioides 238
6.4. Тейхоевые кислоты клеточных стенок как хемотаксономический маркер
кластер-вида "Streptomyces violaceusniger " 242
6.4.1 Тейхоевые кислоты клеточных стенок представителей фенокластера
"S. violaceusniger " 242
6.4.2. Использование сочетания (набора) тейхоевых кислот для
дифференциации представителей фенокластера "S. violaceusniger " 244
6.4.3. Спектры 13С ЯМР как внутривидовой указатель для фенокластера "S.
violaceusniger " 247
6.5. Краткое заключение 250
Глава VII. Распространение тейхоевых кислот и моносахариды клеточных стенок у
представителей порядка Actinomycetales 251
7.1. Распространение тейхоевых кислот в клеточных стенках некоторых
представителей порядка Actinomycetales 251
7.1.1. Наличие тейхоевых кислот в клеточных стенках
дифференцирует роды Nocardiopsis и Saccharothrix 254
Моносахариды в клеточных стенках изученных актиномицетов 257
Краткое заключение 260
Глава VIII. Экологические аспекты изучения анионных углеводсодержащих
полимеров клеточных стенок актиномицетов 261
Видовой состав изученных стрептомицетов 261
Структуры тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок стрептомицетов, вызывающих паршу обыкновенную у картофеля и проростков редиса 263
8.2.1. Тейхоевые кислоты, обнаруженные в клеточных стенках изучаемых
фитопатогенных стрептомицетов 263
8.2.2. Тейхуроновые кислоты, обнаруженные в клеточных стенках
изучаемых фитопатогенных стрептомицетов 266
8.2.3. Новый кислый полисахарид в клеточных стенках изучаемых
фитопатогенных стрептомицетов 266
8.3. Фитопатогенные свойства изучаемых стрептомицетов 267
8.4. Тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточных стенок служат для
дифференциации фитопатогенных стрептомицетов, вызывающих паршу
обыкновенную 268
8.5. Краткое заключение 272
Глава IX. Обсуждение результатов 273
9.1. Изучение структур тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок актиномицетов вносит определённый
вклад в химическую микробиологию 273
9.1.1. Тейхоевые кислоты 273
9.1.1.1. Полиолы и заместители в структурах описанных тейхоевых
кислот 278
9.1.1.2. Новое в классификации тейхоевых
кислот 280
9.1.1.3. Структурная микрогетерогенность в молекулах тейхоевых
кислот и гетерогенность цепей тейхоевых кислот в клеточных
стенках 282
Тейхуроновые кислоты 284
Нейтральные полисахариды 285
Кислые полисахариды 286
9.2. Изучение распространения тейхоевых кислот у представителей порядка
Actinomycetales, а также знание структур этих полимеров, позволяет
использовать их как один из фенотипических признаков для уточнения
диагноза вида и идентификации филогенетически близких
актиномицетов внутри кластеров 287
9.2.1. Распространение тейхоевых кислот у представителей прорядка
Actinomycetales 288
9.2.2. Тейхоевые кислоты клеточных стенок как видоспецифический маркер
актиномицетов 290
9.2.2 А. Род Nocardiopsis 290
?ORGlycomyces 292
Род Nocardioides 293
9.2.2 A.VojxStreptomyces 293
Представители других исследованных родов порядка Actinomycetales 298
Моносахаридный состав клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales 301
9.3. Исследование структур тейхоевых кислот и гликополимеров раскрывает
особенности клеточной поверхности фитопатогенных стрептомицетов,
вызывающих паршу обыкновенную у картофеля 302
Заключение 305
Выводы 307
Цитированная литература 309
Приложения 345
Список сокращений
НО >2С<4 Н
3сн2о-ро3н2
Методы ЯМР-спектроскопии
APT (Attached Proton Test) - тест на присоединённые протоны
COSY (Correlation Spectroscopy) - корреляционная спектроскопия
TOCSY (TOtal Correlation Spectroscopy) - тотальная корреляционная спектроскопия
NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта
Оверхаузера ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта
Оверхаузера во вращающейся системе координат HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) - гетероядерная моноквантовая когеренция НМВС (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) - гетероядерная корреляция через несколько
связей HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) — гетероядерная мультиквантовая
когеренция RCT (Relay Coherence Transfer) - релейный когерентный перенос HETCOR (Heteronuclear Correlation Spectroscopy) - гетероядерная корреляционная
спектроскопия
Остальные сокращения, используемые в работе, являются общепринятыми.
Введение к работе
Клеточная оболочка бактерий представляет собой сложную структуру, отделяющую внутреннее содержимое клетки от внешней среды, защищающую и в то же время осуществляющую взаимодействие самой клетки с окружающей внешней средой и обеспечивающую как обмен веществ, так и обмен информацией бактериальной клетки с окружающим миром. Знания, касающиеся архитектуры клеточной стенки бактерий, биохимических процессов, протекающих в ней, химических структур компонентов клеточной стенки и процессов их биосинтеза, важны и актуальны, поскольку способствуют пониманию значения бактериальной клеточной стенки для существования самого микроорганизма, пониманию химизма жизненных процессов, происходящих в клетке, а также могут быть применены для нужд микробиологии и иммунологии, способствуют развитию современной клеточной биологии, вносят определенный вклад в понимание многих экологических процессов на Земле.
На поверхности бактериальной клетки экспонированы углеводные остатки, входящие в состав биополимеров клеточной стенки (Shibaev, 1987; Sutcliffe, 1994; Наумова и Шашков, 1997; Weidenmaier and Peschel, 2008). Эти полимеры часто имеют весьма сложную структуру и играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизма. Нейтральные и кислые полисахариды, тейхуроновые кислоты, у которых углеводные остатки соединены между собой ковалентными связями, являются типичными представителями гликополимеров клеточных стенок. Моносахаридные остатки присутствуют в основном гликополимере бактериальной клеточной стенки — пептидогликане, а также в уникальных соединениях, характерных только для клеточных стенок грамположительных бактерий — тейхоевых кислотах и сахар-1-фосфатных полимерах, мономерные звенья которых объединены фосфодиэфирными связями.
Среди этих соединений нельзя не отметить липотейхоевые кислоты, амфифилы, заякоренные гидрофобной частью молекулы в цитоплазматической мембране, и имеющие гидрофильную углеводную часть, расположенную в толще пептидогликана. Однако последние не являлись объектом наших исследований.
Исследование структур тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок важно как в фундаментальном, так и научно-прикладном аспектах. Выявление и описание новых структур представляет интерес в связи с оценкой разнообразия биополимеров, пониманием их функций в микробной клетке и путей их биосинтеза, а также распространения у различных микроорганизмов в связи с вопросами эволюции. Исследование структур поверхностных полимеров способствует также пониманию механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой, в том числе- с высшими
10 организмами. Весьма актуальны исследования этих биополимеров микроорганизмов в медицинском аспекте. Их углеводная составляющая отвечает за биологическое распознавание поступающих извне веществ (например, лекарств), а также определяет самые разнообразные процессы клеточного узнавания, в том числе, имеющих ключевое значение при развитии многих заболеваний человека и животных, включая бактериальные и вирусные инфекции, рак, воспаления и др. (Дмитриева и др., 2007; Нифантьев, 2008; Weidenmaier and Peschel, 2008). Исследование клеточных стенок патогенных микроорганизмов привело к пониманию таких важных явлений как адгезия, вирулентность, образование биопленок на имплантированных материалах (Rijnaarts et al., 1995; Hussain et al., 2001), а также природы некоторых аутоимунных заболеваний человека (Дерябин и Каральник, 1983). Гликополимеры клеточных стенок ответственны за чувствительность клетки к ряду антибиотиков и иммуномодуляторные свойства бактерий (Wicken and Knox, 1975; Clark et al., 2000). Одним из направлений исследований тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок бактерий, получившим развитие в последние годы, является так называемое "хемотаксономическое" - изучение распространения и структур полимеров в связи с фундаментальными задачами развития естественной системы микроорганизмов и решения практичесих задач идентификации.
К началу наших исследований среди вышеупомянутых полимеров наиболее изученными были тейхоевые кислоты. С момента их открытия у лактобацилл в 50-е годы XX века в лаборатории профессора Джеймса Бэддили (Baddiley and Matias, 1954; Baddiley et al., 1956) проводились работы, связанные с изучением структурного разнообразия, путей биосинтеза и функций тейхоевых кислот у бактерий. Эти работы в основном были выполнены на представителях родов Bacillus*, Lactobacillus и Staphylococcus (Baddiley et al., 1962 a,b; Baddiley, 1972; Karamata et al., 1972; 1987; Archibald, 1974; Doyle et al., 1975; Hancock and Baddiley, 1976; Rodgers and Taylor, 1978; Yokoyama et al., 1987; Mauel et al., 1989 и др.). Было также обнаружено, что организмы разных видов содержат различные по структуре тейхоевые кислоты (Baddiley et al., 1961; Davison and Baddiley, 1963; Archibald et al., 1968; Baird-Parker, 1970), и была высказана идея о возможности использования данных полимеров в таксономических целях (Fiedler et al., 1981; Schleifer and Stackebrandt, 1983).
Огромный вклад в изучение разнообразия структур и распространения тейхоевых кислот у представителей различных таксонов порядка Actinomycetales внесли приоритетные работы Заслуженного деятеля науки Российской Федерации, профессора Ирины Борисовны
* - латинские наименования родов, видов и подвидов, а также наименования таксонов более высокого порядка (семейство, порядок, класс и т.д.) приведены согласно правилам журнала «Микробиология», 2008, Т. 77, № 4, стр. 574.
Наумовой с сотрудниками (Наумова, 1964; 1973; 1979; Naumova et al., 1980; Евтушенко и др., 1984; Naumova, 1988; Наумова и Шашков, 1997; Naumova et al., 2001), ведущиеся в течение многих лет на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ в сотрудничестве со специалистами Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН и Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов»).
Представители порядка Actinomycetales (актиномицеты) выделяются среди других прокариот размерами (до 9 млн. п.о.) и организацией генома, особенностями фенотипа, в т.ч., разнообразием морфологии и химических компонентов клетки и клеточной стенки. Актиномицеты также превосходят другие известные группы бактерий по способности синтезировать биологически активные соединения. Они являются продуцентами свыше половины из более 10000 антибиотиков и других соединений, известных к настоящему времени (Goodfellow et al., 1988; Anderson and Wellington, 2001; Watve et al., 2001; Грачева, 2003). Являясь типичными обитателями почвы, они весьма неприхотливы в отношении питания, благодаря чему могут развиваться на субстратах с ничтожным количеством питательных веществ (Теппер, 1976; Linos et al., 1999; Зенова и Звягинцев, 2002). Некоторые актиномицеты ассоциированы с высшими организмами (Kizuka et al., 1994; Zinniel et al., 2002); ряд организмов известны как патогены человека и животных (Mabeza and Macfarlane, 2003; Read, 2005) или растений (Loria et al., 1997; 2006). Все вышесказанное способствовало повышенному интересу к этой группе микроорганизмов со стороны различных специалистов, прежде всего биотехнологов, микробиологов-систематиков и молекулярных биологов, что, в свою очередь, определило более успешное развитие систематики актинобактерий по сравнению с другими группами прокариот.
Создание филогенетической схемы прокариот, и актинобактерий в частности, стало возможным благодаря внедрению в микробиологию молекулярно-генетических методов и определению нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Филогенетические древа, однако, не могут быть использованы непосредственно для построения иерархической системы (Stackebrandt and Swings, 2005; Калакуцкий, 2006). Выделение новых и ревизия ранее описанных таксонов осуществляется с учетом разносторонних согласующихся данных филогенетического и фенотипического характера (принцип полифазной таксономии). Информация о фенотипе особенно важна для обоснования выделения новых таксонов родового и видового уровней и уточнения границ между таксонами.
Изучение хемотаксономических признаков (тип клеточной стенки, тип пептидогликана, состав менахинонов, жирных кислот фосфолипидов) сыграло ключевую роль в развитии системы классификации актиномицетов в «домолекулярную эру». Отличия
12 организмов по хемотаксономическим признакам зачастую являются определяющими при обосновании выделения нового рода или вида актиномицетов и в настоящее время. Вместе с тем, многие полимеры и крупные молекулы клетки не изучены или слабо исследованы в таксономическом аспекте. В этой связи актуальны работы, направленные на поиск и оценку таксономической значимости новых биомолекул и их структурных компонентов - особенно в связи с выделением из природной среды массивов новых микроорганизмов, обособляющихся от известных таксонов на уровне генотипа, но неотличимых от них по традиционно используемым в систематике актиномицетов фенотипическим, в т.ч., хемотаксономическим, признакам.
К настоящему моменту определены структуры тейхоевьгх кислот и показана возможность использования этих полимеров и их структурных компонентов в качестве хемотаксономических маркеров видов ряда родов актиномицетов, например, Agromyces (Гнилозуб, 1994), Actinomadura, Nonomurea, Brevibacterium (Потехина, 2005). Эти и другие работы продемонстрировали также огромное структурное разнообразие тейхоевых кислот и гликополимеров в этой группе бактерий и перспективность дальнейших исследований в данном направлении.
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования - изучение распространения и структурного разнообразия тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок у представителей порядка Actinomycetales и оценка коррелятивных связей между наличием и структурой вышеназванных полимеров, с одной стороны, и таксономическим положением и свойствами организмов, с другой.
Среди основных задач исследования можно выделить следующие:
Изучение распространения тейхоевых кислот и других гликополимеров у представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам, 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales (более 100 штаммов).
Установление структур тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок исследуемых актиномицетов - представителей некоторых видов родов Nocardiopsis (29 штаммов); Glycomyces (4 штамма); Nocardioides (15 штаммов); Streptomyces (14 штаммов), а также Kineosporia aurantiaca.
3. Анализ полученных и имеющихся в литературе данных и оценка возможности
использования вышеназванных полимеров и их структурных элементов в качестве
химических маркеров таксонов.
13 4. Выяснение взаимосвязи между набором тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок стрептомицетов-возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов и их патогенностью.
Научная новизна работы
Впервые изучено распространение тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках, а также моносахаридный состав последних у более 100 штаммов, представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales. Впервые найдены тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок и установлены структуры полимеров у 63 (из 100) штаммов актиномицетов, относящихся к 28 видам, 5-ти родам 5-ти семейств 5-ти подпорядков порядка Actinomycetales. Установлено и описано 14 новых структур упомянутых биополимеров, среди них 10 тейхоевых кислот, 2 кислых полисахарида — полимер и олигомер Kdn (3-дезокси-0-гушг/е/ю-0-гшак7яо-нон-2-улопиранозоновая кислота), тейхуроновая кислота и нейтральный полисахарид. Впервые показана специфичность набора и строения тейхоевых кислот для видов родов Nocardiopsis, Nocardioides, Glycomyces и Streptomyces, что имеет важное значение для усовершенствования системы классификации исследованных групп бактерий. Предложен новый перспективный подход к, ревизии таксономической структуры наиболее многочисленного по видовому составу рода Streptomyces, а именно, использование признака "набор и структура тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки" как критерия границ близких видов. В соответствии с отличиями по составу тейхоевых кислот клеточной стенки и с другими фенотипическими признаками, а также с обособленностью на филогенетическом уровне (анализ 16S рРНК), предложен новый вид Nocardioides prauseri sp. nov. и переописаны виды Nocardioides luteus и Nocardioides albus. Впервые показано, что клеточные стенки стрептомицетов, вызывающих паршу обыкновенную у картофеля и корнеплодов, содержат в клеточных стенках более двух анионных полимеров различных по структуре, среди которых - полимер/олигомер Kdn. Эти полимеры, наряду с фитотоксином такстомином и гидролитическими ферментами, по всей вероятности, могут считаться факторами патогенности, обусловливая специфическую адгезию фитопатогена к растению-хозяину на первых этапах развития инфекции. Выявлен ряд новых фитопатогенных актиномицетов рода Streptomyces, филогенетически и фенотипически отличных от ранее известных возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов.
14 Практическое значение работы
Полученные данные о химическом составе и структурных особенностях тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок фитопатогенных стрептомицетов могут служить основой для будущих исследований молекулярных механизмов взаимодействия фитопатогенов и растения-хозяина и разработки новых методов борьбы с возбудителями заболеваний растений. Полученные данные могут быть использованы для создания более совершенной системы идентификации фитопатогенов. На большом фактическом материале убедительно показано, что признак «наличие/отсутствие тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки», а также таксономическая специфичность ряда структурных элементов, выявляемых методами хроматографии, могут быть успешно применены в повседневной микробиологической практике при идентификации микроорганизмов исследованных групп и решении вопроса о границах таксонов. Подкомитетом по систематике подпорядка Micrococcineae Международного комитета по систематике прокариот рекомендовано определять вышеназванные характеристики при описании новых родов и видов соответствующих групп актинобактерий (Shumann et al., 2009).
Значительно пополнены базы данных спектров ЯМР тейхоевых кислот и других гликополимеров бактериальных клеточных стенок, что внесло определённый вклад в гликологию, химическую микробиологию и может быть использовано при анализе структур близких полимеров в биохимической практике.
Полученные данные о структуре, разнообразии и распространении тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales востребованы и цитируются в ведущих современных обзорах и монографиях (Lazarevic et al., 2002; Seltmann and Hoist, 2002; Neuhaus and Baddiley, 2003; Weidenmaier and Peschel, 2008) и авторитетном международном руководстве по микробиологии — "The Prokaryotes" (Kroppenstedt and Evtushenko, 2006). Кроме того, эти данные могут быть включены в курсы по биохимии и микробиологии на биологических факультетах высших учебных заведений.
Основные защищаемые положения диссертации
тейхоевые кислоты и гликополимеры широко распространены в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales, однако доминируют тейхоевые кислоты;
тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales проявляют широкое структурное разнообразие;
наличие, набор и структура тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales являются таксономически значимой фенотипической характеристикой таксонов разных уровней (от подпорядка до вида);
клеточные стенки фитопатогенных стрептомицетов характеризуются ярко выраженными анионными свойствами, которые обеспечены наличием в них комплекса кислых полимеров гетерогенного состава: тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами с пировиноградной или глутаминовой кислотой в качестве дополнительного кислого компонента, кислыми поли/олигосахаридами;
выявление новых структур гликополимеров клеточной стенки важно, поскольку они могут служить не только маркерами новых видов или подвидов актиномицетов, но и указывать на неизвестные до сего времени экологические функции изучаемых организмов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференция «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Madison, 1991; Москва, 1994); Международной конференции "Микробное разнообразие" (Пермь, 1996); Втором съезде Биохимического общества Российской АН, Москва, 1997); Международном симпозиуме "Современные проблемы биохимии микроорганизмов и биотехнологии" (Пущино, 2000); Втором Германо-Польско-Российском съезде по углеводам бактерий (Москва, 2002); Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002); Первом конгрессе FEMS Европейских микробиологов (Ljubljana, 2003); II Московском международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2003); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004г.); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», (Москва, 2004г.); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005г); Международном конгрессе коллекций культур микроорганизмов (Goslar, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них обзор и 24 экспериментальные статьи в рекомендуемых ВАК'ом изданиях; тезисы 20 докладов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 356 страницах машинописного текста и состоит из введения; 9-ти глав, включающих материалы литературных источников (3 главы обзора литературы); краткой характеристики объектов и методов исследований
(одна глава); изложения результатов собственных исследований (4 главы), а также главы, посвященной обсуждению полученных результатов; общего заключения и вьшодов. Работа содержит 62 таблицы, 49 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 697 ссылок. В Приложении приведён полный список исследованных штаммов актиномицетов с указанием обнаруженных моносахаридов, а также наличия (отсутствия) тейхоевых кислот в их клеточных стенках; таблицы баз данных по ЯМР-спектрам изученных тейхоевых кислот и других гликополимеров.
17 БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую признательность всем российским и зарубежным коллегам — соавторам публикаций, принимавшим участие в представленной работе на различных этапах ее выполнения: сотрудникам биологического факультета МГУ — д.б.н. Н. В. Потехиной, к.б.н. Ю. И. Козловой; сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН - д.х.н. А.С. Шашкову, к.х.н. С.Н. Сенченковой; сотруднику Института новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН - д.б.н. Л.П. Тереховой; сотрудникам ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН - к.б.н. В.Н. Акимову, к.б.н. Е.Ю. Гавриш, к.б.н. В.И. Краузовой, м.н.с. В.В. Таран, к.б.н. О.А. Степной, чл. корр. РАН И.С. Кулаеву; сотруднику Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН — к.х.н. А.А. Стомахину; чл. корреспонденту БелНАН В.Г. Иванюку (Белорусский НИИ картофелеводства БелАН); проф. Э. Стакебрандту (Немецкая коллекция микрооранизмов, Германия).
Автор бесконечно благодарен своим наставникам и учителям: д.б.н.
Ирине Борисовне Наумовой| (биологический факультет, МГУ) и д.б.н.
Ирине Михайловне Грачёвой] (Московский технологический институт пищевой промышленности), а также д.б.н., профессору Дмитрию Григорьевичу Звягинцеву (факультет почвоведения, МГУ) и к.б.н. Галине Матвеевне Стрешинской (биологический факультет, МГУ).
Автор признателен научным консультантам настоящей работы д.б.н. Людмиле Ивановне Евтушенко (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов») за помощь в обсуждении и интерпретации результатов, по чьей инициативе и выполнена данная работа, и д.б.н., профессору Александру Ивановичу Нетрусову (биологический факультет, МГУ, зав. каф. микробиологии) за постоянное внимание и интерес к нашим работам, а также за помощь в обсуждении результатов и оформлении данной работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок
грамположительных бактерий: структурное разнообразие, распространение и некоторые функции, экологические аспекты.
В литературном обзоре представлены сведения, касающиеся строения бактериальной клеточной стенки; разнообразия структурных вариаций, распространения и некоторых функций тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок грамположительных бактерий. Особое внимание уделено названным полимерам клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales. Приведены сведения, касающиеся современной классификации актиномицетов. Отмечена особая значимость хемотаксономических признаков, отражающих химический состав и строение клетки и клеточной стенки и являющихся одной из наиболее значимых групп фенотипических признаков в систематике актиномицетов. Обоснована актуальность и перспективность изучения тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки с целью использования для развития системы классификации актиномицетов. Представлены сведения о фитопатогенных стрептомицетах, их видовом составе, а также данные об известных к настоящему времени возможных факторах патогенности, в числе которых некоторые биополимеры клеточных стенок.
