Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 17
1.1 Исследования, основанные на данных об изменчивости конхиологических признаков 18
1.2 Анализ популяционной структуры моллюсков с использованием изоферментных маркеров 44
1.3 Изучение популяционной структуры моллюсков на основе ДНК-маркеров 60
1.4 Изучение изменчивости в популяциях жука-оленя {Lucanus cervus) 71
1.5 Роль генетического анализа популяций в оптимизации сети особо
охраняемых природных территорий 74
Глава 2 Район исследования: физико-географическое описание и экологическая ситуация 80
2.1 Физико-географическое описание района исследования 80
2.2. Состояние окружающей среды в районе исследования 83
Глава 3 Материал и методы исследования 90
3.1 Объекты исследования и объем используемого материала 90
3.2 Пункты сбора материала 94
3.3 Методика фенетического анализа 106
3.4 Методика хромосомного анализа 108
3.5 Метод электрофореза белков в полиакриламидном геле 108
3.6 Особенности внутривидового разнообразия, выявленные методом электрофореза в ПААГ 113
3.7 Методика выделения ДНК 121
3.8 Методика проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) 122
3.9 Метод щелочного гель электрофореза изолированных клеток (ДНК-комет) 130
3.10. Статистическая обработка данных 131
Глава 4 Оценка состояния популяций с использованием химического и экотоксикологического подходов 136
4.1 Содержание химических элементов в раковинах наземных моллюсков в условиях влияния горно-обогатительных комбинатов 136
4.2 Использование наземных моллюсков в качестве индикаторов для оценки токсичности среды в отношении ДНК живых организмов (на основе метода ДНК-комет) 146
ГЛАВА 5 Морфо-генетическая структура популяций изучаемых видов 151
5.1 Изменчивость конхиологических признаков в популяциях Bradybaena fruticum 151
5. 2 Изменчивость конхиологических признаков Cepaea vindobonensis 168
5.3 Изменчивость конхиологических признаков Helicopsis striata 173
5.4 Изменчивость конхиологических признаков Helix pomatia 177
5.5 Изменчивость конхиологических признаков Chondrula tridens 179
5.6 Морфометрический анализ адвентивных колоний Chondrula tridens 183
5.7 Изменчивость морфометрических показателей в популяциях Lucanus cervus 188
Глава 6 Генетические процессы в популяциях видов-индикаторов антропогенного воздействия в условиях урабнизированных территорий района исследования 193
6.1 Оценка состояния популяционных генофондов Bradybaena fruticum
в условиях юга Среднерусской возвышенности 196
6.1.1 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Bradybaena fruticum с использованием изоферментных маркеров 196
6.1.2 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Bradybaena fruticum с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 214
6.2 Оценка состояния популяционных генофондов Chondrula tridens в условиях юга Среднерусской возвышенности 223
6.2.1 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Chondrula tridens с использованием изоферментных маркеров 223
6.2.2 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Chondrula tridens с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 235
6.2.3 Особенности формирования генофондов адвентивных колоний Chondrula tridens 244
ГЛАВА 7 Генетические процессы в популяциях уязвимых видов 248
7.1 Оценка состояния популяционных генофондов особо охраняемого вида Helicopsis striata 248
7.1.1 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Helicopsis striata с использованием изоферментных маркеров 249
7.1.2 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Helicopsis striata с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 256
7.2 Оценка состояния популяционных генофондов особо охраняемого вида Cepaea vindobonensis 264
7.2.1 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Cepaea vindobonensis с использованием изоферментных маркеров 264
7.2.2 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Cepaea vindobonensis с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 271
7.3 Оценка состояния популяционных генофондов особо охраняемого вида Helix pomatia 278
7.3.1 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Helix pomatia с использованием изоферментных маркеров 278
7.3.2 Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Helix pomatia с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 282
7.4 Оценка состояния популяционных генофондов особо охраняемого вида Lucanus cervus 288
7.4.1 Анализ генетической изменчивости популяций Lucanus cervus с использованием изоферментного локуса эстераз 289
7.4.2 Анализ генетической изменчивости популяций Lucanus cervus с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНК 292
7.4.3 Анализ динамики генетической структуры популяций Lucanus cervus на основе аллозимной изменчивости и ДНК-маркеров 298
Глава 8 Оценка жизнеспособности изучаемых популяций 305
8.1 Эффективная численность и прогноз времени существования изучаемых популяций на территории района исследования 306
8.1.1 Расчет эффективной численности на основе дисперсии индивидуальной плодовитости 307
8.1.2. Расчет эффективной численности на основе соотношения полов 312
8.1.3 Расчет эффективной численности на основе коэффициента инбридинга 315
8.1.4 Вычисление эффективной численности популяций на основе «темпорального» метода 320
8.1.5 Вычисление эффективной численности на основе интегральных оценок подразделенности популяций и уровня потока генов 324
8.2 Временная динамика структуры генофондов популяций на примере Bradybaena fruticum 327
К вопросу о создании региональных красных книг (вместо заключения) 336
Выводы 338
Список литературы
- Изучение популяционной структуры моллюсков на основе ДНК-маркеров
- Методика фенетического анализа
- Изменчивость конхиологических признаков Cepaea vindobonensis
- Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Bradybaena fruticum с использованием изоферментных маркеров
Введение к работе
Актуальность работы. Сокращение популяционно-видового разнообразия, идущее все возрастающими темпами, снижает информационную емкость сообществ и может вызвать в них цепные реакции саморазрушения. Вместе с тем, гомеостатические механизмы естественных популяций, дополняемые разумной природоохранной деятельностью человека, значительно снижают риск подобного сценария развития событий. Поэтому грамотные и здоровьесберегающие подходы к реализации планов повышения экономического потенциала страны необходимо осуществлять с обязательным контролем за качеством среды жизни. Такому контролю, а также сохранению и восстановлению видов, а вместе с ними и экосистем различных уровней иерархии, во многом может способствовать изучение генетических процессов, происходящих в популяциях индикаторных и уязвимых организмов. Причем, в ряде случаев, чувствительность биоиндикационных методов, в том числе, генетических, используемых для оценки комплексного воздействие факторов среды, оказывается выше, чем разрешающая способность химического, радиационного и аэрокосмического анализа, т.к. последние требуют дешифровки на основе реального состояния живых систем.
Цель исследования. На основе изучения состояния популяционных генофондов видов беспозвоночных животных в пространственном и временном аспекте оценить качество среды жизни в условиях урбанизированных ландшафтов юга Среднерусской возвышенности с выявлением микроэволюционных и гомеостатических процессов, протекающих в современных природных популяциях.
Задачи исследования:
Провести оценку уровня накопления химических элементов, включая тяжелые металлы, в раковинах исследуемых видов моллюсков в зоне повышенного антропогенного пресса на предмет выяснения степени химического загрязнения биотопов и его влияния на генетическую структуру популяций.
Оценить степень мутагенной нагрузки на изучаемые популяции в условиях урбанизированного ландшафта с различной степенью нарушения среды.
3. Скорректировать критерии оценки влияния урбанизированных
территорий с учетом полученных данных по экологии и генетике видов-
биоиндикаторов. Провести анализ совместного влияния микроэволюционных
факторов на уровень поддерживаемой генетической изменчивости, с
одновременной оценкой происходящих изменений.
4. Оценить темпы сокращения аллельного разнообразия, вызванного
дрейфом генов, в популяциях изучаемых видов. Выяснить последствия
дробления популяционных ареалов в антропогенно-нарушенных ландшафтах в
разных природных зонах. Осуществить сбор и обработку сведений о влиянии
пространственной структуры популяций на поддержание ее генетической
изменчивости.
5. Использовать различные методы оценки эффективной численности
популяций, связав это с проблемой выживания видов в условиях измененной
среды.
Усовершенствовать систему контроля за популяциями уязвимых видов, с использованием прямых методов изучения генетической изменчивости на основе различных типов признаков, совместно с определением эффективной численности популяций.
Выявить популяционные гомеостатические механизмы, возникающие в условиях антропогенного изменения среды.
Объектом исследования были популяции беспозвоночных животных, являющихся индикаторами различных антропогенных воздействий, а также уязвимых видов, находящихся в охранных списках на федеральном и региональном уровнях.
Предметом исследования были генетико-автоматические и селективные процессы, происходящие в естественных популяциях видов беспозвоночных животных, обитающих в условиях урбанизированных ландшафтов юга Среднерусской возвышенности.
Научная новизна работы:
1. Впервые для интенсивно освоенных ландшафтов была проведена
оценка состояния среды жизни на основе многоуровневого подхода,
включающего химический, экотоксикологический, морфологический,
кариологический и генетический анализы живых объектов.
Впервые для определения степени мутационной нагрузки на биоценозы был применен метод щелочного гель - электрофореза изолированных клеток индикаторных видов наземных моллюсков.
Впервые исследована популяционная структура индикаторных видов наземных моллюсков с использованием различных генетических маркеров (для Chondrula tridens впервые проведен анализ изоферментных и ДНК-маркеров, а для Bradybaena fruticum - ДНК-маркеров).
Впервые проведена оценка жизнеспособности особо охраняемых видов Helicopsis striata, Helix popmatia, Lucanus cervus на основе анализа генетической структуры их популяций с использованием биохимических маркеров. Углублены представления о жизнеспособности популяций уязвимого вида Cepaea vindobonensis.
Впервые для исследуемых видов получены оценки эффективной численности, рассчитанные на основе различных интегральных показателей демографических и генетических данных.
Впервые на основании многолетних исследований используемых модельных видов наземных моллюсков показана устойчивость генетической структуры популяций в условиях урбанизированного ландшафта вопреки прогнозам, созданным на основании математических моделей.
Защищаемые положения:
1. В условиях урбанизированных и техногенных территорий в популяциях беспозвоночных идет отбор особей, у которых более активные репарационные механизмы клеток препятствуют разрушению ДНК.
Объективную оценку состояния среды жизни можно получить только на основании комплексного подхода к анализу живой материи на всех уровнях иерархии. Однокомпонентная экспресс-диагностика сопряжена с большими ошибками наблюдения, перекрывающими возможность ее применения.
Эврибионтные виды, традиционно считающиеся индикаторами в силу своей толерантности, не всегда дают достоверную картину антропогенного воздействия. Стенобионтные и уязвимые виды являются лучшими «контролерами» сукцессионных процессов.
Концепцию уменьшения аллельного разнообразия и усиления инбридинга в популяциях, обитающих во фрагментированном ландшафте, можно рассматривать с негативной точки зрения не для всех видов, т. к. это явление преломляется через различия в их биологии. Активные гомеостатические и компенсаторные реакции генома адаптируют виды к условиям урбанизации.
Составление и ведение Красных книг на всех уровнях должно сопровождаться анализом состояния генофондов, включаемых в них видов, с применением новых ДНК-технологий, позволяющих осуществлять исследования без нарушения целостности изучаемых популяций.
Практическая значимость. Полученные данные использовались для проведения экспертной оценки воздействия горнопромышленных предприятий Старооскольско-Губкинского района на вмещающие ландшафты, растительность и животный мир (хоздоговорная тема № 849/06, 2006 г.), а также для оценки состояния экосистем в рамках инженерно-экологических изысканий, ОВОС, ООС Приоскольского ГОКа (хоздоговор 19/08, 2008 г.). Результаты исследований продемонстрировали, что применяемые методы можно использовать для проведения грамотной экологической экспертизы существующих и строящихся предприятий, что поможет им избежать санкций со стороны природоохранных ведомств.
Результаты исследований были применены в ходе работ по созданию кадастра особо охраняемых природных территорий областного управления Белгородской области (государственные контракты № 37, № 39, 2008 г.), а также для создания Красной книги Белгородской области и для ее ведения. Данные показали, что применяемые методы можно использовать для оптимизации сети особо охраняемых природных территорий на юге Среднерусской возвышенности и в других регионах.
Результаты исследования используются для совершенствования методики подготовки в рамках вуза биологов - популяционистов и специалистов в области природоохранной деятельностью (бакалавров, магистров, аспирантов). Полученные данные используются в учебных курсах «Экология и рациональное природопользование», «Глобальная экология», «Экология животных», «Эволюционное учение», «Генетика популяций», «Адаптации животных к экстремальным условиям», «Генотоксикология».
Работа проводилась в рамках: грантов РФФИ № 03-04-96427, № 06-04-96305, № 09-04-97513; программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (гранты № 8380, № 2.2.3.1/3723, № 2.2.3.1/ 9731); федеральной целевой
программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (государственные контракты №П1050и№П351).
Личный вклад автора. В основу диссертационной работы положены
оригинальные материалы, собранные автором в период с 1996 г. по 2011 г. в
процессе мониторинга популяций беспозвоночных животных на юге
Среднерусской возвышенности и сопредельных территориях.
Экспериментальные исследования проводились лично автором на базе научно-исследовательской лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ «БелГУ». Автором лично выполнена статистическая обработка, анализ и обобщение полученных данных. Суммарно личное участие автора составляет около 80 %.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на: 4-й региональной конференции «Экологические и генетические аспекты флоры и фауны Центральной России» (Белгород, 1996); научно-практической конференции, посвященной 270-летию Белгородской губернии (Белгород, 1997); 5-й международной научно-практической конференции «Региональные проблемы прикладной экологии» (Белгород, 1998); всероссийской конференции «Моллюски. Проблемы систематики, экологии и филогении» (Санкт-Петербург, 1998); всероссийской научной конференции, посвященной памяти Н.В. Тимофеева-Ресовского «Биосфера и человечество» (Екатеринбург, 2000); международном симпозиуме по биоиндикаторам «Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга» (Сыктывкар, 2001); 6-й Пущинской школе конференции молодых ученых (Пущино, 2002); научно-практической конференции, посвященной 75-летию Воронежского государственного природного биосферного заповедника «Роль особо охраняемых территорий центрального Черноземья в сохранении и изучении биоразнообразия лесостепи» (Воронеж, 2002); II Малакологической конференции «Эколого-фаункціоналні та фауністичні аспекти досліжения молюсків, іх роль в біоіндикаціі стану навіколишнього середовища» (Житомир, 2004); International symposium of malacology (Sibiu. 2004); VIII международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород 2004); a symposium on occasion of 80th birthdays of Vojen Lozek «Molluscs, Quaternary, faunal changes and enviromental dynamics» (Prague, 2005); III Международной научной конференции «Биоразнообразие и роль зооценоза в естественных и антропогенных экосистемах» (Днепропетровск, 2005); международной научной конференции «История заповедного дела» (Борисовка, 2005); III малакологической конференции «Зколого-фаункціоналні та фауністичні аспекти досліжения молюсків, іх роль в біоіндикаціі стану навіколишнього середовища» (Житомир, 2006); первой международной научной конференции «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2006); IX международной научно-практической экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород,2006); седьмом (XVI) совещании по изучению моллюсков «Моллюски, морфология, таксономия, филогения, биогеография и экология» (Санкт-Петербург, 2006); II международной научно-практической конференции
«Урбоэкосистемы: проблемы и перспективы развития» (Ишим, 2007); IV Международной научной конференции «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 2007); материалы конференции к 100-летию Государственного Дарвиновского музея «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, 2007); международной научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И. И. Спрыгина «Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранении: материалы» (Пенза, 2008); X всероссийском популяционном семинаре «Современное состояние и пути развития популяционной биологии» (Ижевск, 2008); международной научной конференции посвященной 15-летию природного заповедника «Воронинский» «Биоразнообразие и роль особо охраняемых природных территорий в его сохранении» (Тамбов, 2009); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экология, эволюция и систематика животных» (Рязань, 2009); V Международной научной конференции «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 2009); чтениях памяти проф. М. М. Кожова «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010); XI международной научно-практической конференции «Видовые популяции и сообщества в антропогенно трансформированных ландшафтах: состояние и методы его диагностики» (Белгород, 2010); IV международном симпозиуме «Эволюция жизни на земле» (Томск, 2010); III международной научно-практической конференции «Почва, как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем» (Иркутск, 2011); VIII всероссийской научно-практической конференции «Тобольск научный» (Тобольск, 2011); международной конференции, посвященной памятной дате - 75- летию со дня рождения академика Ю. П. Алтухова «Проблемы популяционной и общей генетики» (Москва, 2011); 3 meeting of the European Stag Beetl Group (Florence, 2011); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 84 работы, в том числе 3 монографии, учебное пособие и 18 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Основной текст изложен на 394 страницах машинописного текста, включающих 122 рисунка и 98 таблиц. Список литературы включает 544 источника, из них 306 на иностранных языках. В приложении содержатся 50 таблиц и 2 рисунка. Общий объем диссертации составляет 473 страницы.
Изучение популяционной структуры моллюсков на основе ДНК-маркеров
В 1918 году, на основе обширных данных впервые был поставлен вопрос о генетической обусловленности признаков раковины у моллюсков (Stelfox, 1918). Эту работу можно считать отправной точкой исследований по этому вопросу, которые продолжаются по настоящее время.
Первые работы по внутрипопуляционной изменчивости среди моллюсков были проведены на улитках из рода Partula на Гавайских островах (Crampton, 1916-1932). Автор считал, что изменчивость этих моллюсков носит индифферентный характер для отбора, и полиморфизм в их популяциях является следствием повторных мутаций и миграций. Позднее, Б. Кларке и Дж. Мюррэй (Clarke, Murray, 1969) в своих работах по этим же видам в том же районе, во многом подтвердили данные X. Е. Крамптона. Авторы отвергают роль биотических и абиотических факторов в формировании полиморфизма, и полагают, что эффект ареала простирается на площадь большую, чем площадь, занятую панмиктической популяцией. Криптичность окраски у Patula исследователи так же отрицают, и указывают на то, что частоты морф (т.е. фенотипов) разные в очень близких участках с одинаковыми условиями. -Partula taeniata, Partula suturalis). Дальнейшие исследования показали генетическую обусловленность полиморфизма по окраске раковины и наличию полос, причем в обоих случаях предполагается контроль над полиморфизмом со стороны одного гена с серией множественных аллелей (Murray, Clarke, 1966, 1976 a, b, 1984).
С середины двадцатого века в Европе началось изучение популяционной структуры модельных видов наземных моллюсков из рода Сераеа, отличающихся значительным полиморфизмом раковинных признаков. Изначально работы проводились на Сераеа nemoralis и С. hortensis, а чуть позже появились публикации по С. vindobonensis. Так в 1953 -1957 годах проводится первая крупная работа по изучению С. nemoralis и С. hortensis в ландшафтах Германии (Schilder, Schilder, 1953, 1957). Авторы, отмечая наследственную природу нескольких признаков раковины (особенно полос), считали, что некоторые морфологические вариететы кодируются аллельными системами. Заслуживает внимания и выдвинутое ими предположение, согласно которому факторы окружающей среды не влияют на распределение морф данных видов по биотопам.
В дальнейшем, в серии работ по этим же видам (Fisher, Diver, 1934; Cain, Sheppard, 1956; Murray, 1963, 1966; Cook, 1967; Cain et al.,1968) с применением скрещивания между парами улиток с четко выраженными признаками было установлено несколько закономерностей в наследовании признаков раковины. Во-первых, было выяснено, что цвет раковины (от бледно-желтого до темно-коричневого) детерминирован системой аллелей, и признак желтого цвета рецессивен по отношению к коричневому. Во-вторых, локус, определяющий полосатость, лежит близко к локусу цвета раковины, и является рецессивным по отношению к бесполосости. В-третьих, ген, определяющий прерывистость полос, является доминантным и тесно сцеплен с супергеном окраски и полосатости. Локус, определяющий гиалиновость полос, по всей видимости, относительно свободен и является сцепленным лишь с аллелем частичной окраски. Сам же аллель частичной окраски доминантен и оказывает репрессирующее влияние на основной цвет. В-четвертых, гены гиалиновых зон проявляются в гомозиготах одновременно с бледным фоном раковины, с ослаблением губы и ослаблением пигментированное полос. В дальнейшем был отмечен эпистатический эффект генов всей системы полос. Так, например, аллель средней полосы оказывает частично ингибирующее действие на проявление других полос. Выявлена так же генетическая обусловленность величины диаметра раковины при высокой коррелятивной зависимости с высотой. Авторами не отрицается так же возможность модифицирующего воздействия внешней среды на пигментацию полос и общий фон раковины.
Далее было проведено большое количество исследований, касающихся сравнения по физиологическим показателям особей с различными генетически детерминированными признаками раковины. Было выяснено, что особи С. hortensis и С. nemoralis с желтой и розовой раковиной отличаются по температурному преферендуму (Sedlmair,1956). В альтернативных парах (полосатых и бесполосых, желтых и розовых особей) зафиксированы отличия в активности в различных условиях освещенности и влажности. Но одновременно отмечалось, что между генетически одинаковыми формами из очень разных биотопов имеются весьма сильные отличия.
Относительные преимущества особей с желтым фоном раковины и уменьшенным числом полос наиболее ярко выражены в суровых условиях обитания. Особенно это заметно во Франции, где наблюдались резкие колебания температуры в сочетании с низкой влажностью (Cain, Сштеу, 1963 а, б, 1968).
В ходе проведенных экспериментов на С. nemoralis (Lamotte, 1959) была установлена степень выживаемости у различных форм при воздействии на них освещения в 40 ватт в течение 45 минут. Оказалось, что смертность возрастает от бесполосых форм к формам с пятью полосами, а смертность розовых выше, чем желтых. Далее, этим же автором была выявлена положительная климатическая корреляция между частотой встречаемости бесполосых улиток и увеличением температуры июля, и между частотой встречаемости желтых улиток и уменьшением температуры января. Э. Майр (1968) приводил следующие данные. В лабораторных условиях желтые без полос улитки предпочитали температуру +20 С, особи с пятью полосами - +17 С, красные особи с тремя полосами - +14 С.
Позднее, в подобных же экспериментах (Wold, 1967), было выяснено, что плодовитость разных морф С. nemoralis различна при разных температурах. По мнению автора, это свидетельствует о скрытых физиологических различиях, которые влияют на жизнеспособность в разных микроклиматических условиях.
В большой серии работ, проведенных в Англии, Франции, Бельгии и Германии, многие исследователи пытались объяснить особенности распределения различных форм С. nemoralis и С. hortensis по биотопам.
А. Дж. Кейн и П. М. Шеппард (Cain, Sheppard, 1952, 1954, 1956, 1961, Sheppard, 1951) пришли к выводу, что существует зависимость между фенотипическими особенностями раковины моллюсков (окраской раковины или степенью выраженности полос) и цветом того фона, на котором живут улитки. В местах, где преобладают цветовые контрасты, чаще встречаются полосатые раковины, тогда как сплошная окраска характерна для местообитаний с однотипной поверхностью. В зелени живых изгородей и в траве преобладают особи с желтой раковиной, а в лесу, где гниющие листья и участки голой земли имеют темную окраску, чаще встречаются коричневые раковины. На основании своих наблюдений авторы формулируют концепцию "визуального отбора". Согласно этой концепции фактором отбора, определяющим тенденцию к сходству особей в сходных местообитаниях и тенденцию к различию в разных экологических условиях, являются хищники, которые находят свою жертву с помощью зрения. Для С. nemoralis и С. hortensis, по мнению авторов, таким контролирующим фактором является в основном певчий дрозд (Turdus philomelos). Действие других животных, таких как серые белки, крысы, кролики, мелкие мышевидные грызуны является незначительным.
Методика фенетического анализа
Несмотря на фундаментальность работ, проведенных с использованием метода электрофореза белков и ферментов (а с его помощью была оценена степень полиморфизма более чем у 2000 видов организмов), применение его имело ряд ограничений. Во-первых, белковые маркеры отражали изменчивость только в кодирующей части генома, которая по разным оценкам составляет около 10 % от общего количества ДНК, а остальная, так называемая «молчащая» ДНК оставалась вне поля зрения. Во-вторых, с помощью электрофореза возможно уловить только часть аминокислотных замен, приводящих к изменению заряда белковых молекул. В-третьих, уровень полиморфизма белковой составляющей у многих видов невысок. В-четвертых, электрофоретический анализ можно проводить только на свежем материале (даже в условиях глубокой и длительной заморозки постепенно происходит деградация белковых молекул), а это значительно ограничивало сбор материала в полевых условиях и создания молекулярных коллекционных фондов. Все эти недостатки были устранены с развитием нового этапа в популяционной генетике.
Этот новый этап начался после изобретения и широкого распространения метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей за короткое время многократно увеличить число копий изучаемых ДНК-фрагментов (Mullis et al., 1986; Premier-directed..., 1988). Попутно развивались методы выделения, клонирования, рестрикции и секвенирования ДНК. Работа с нуклеиновыми кислотами значительно увеличила возможности популяционистов. Дело в том, что молекулы ДНК и РНК могут длительно храниться при температуре -20С и ниже, а также сохраняются в условиях спиртовой консервации. Кроме того, исследователи получили возможность анализировать изменчивость практически всего генома объекта исследования, включая однонуклеотидные замены. Наконец, для анализа можно использовать отмершие части организмов, включая ископаемые останки (так, например, было продемонстрировано использование этого метода для анализа популяционных генофондов особо охраняемого вида жемчужницы Margaritifera margaritifera по фрагментам лигамента на раковинах отмерших моллюсков (Систематическое положение..., 2007).
В настоящем обзоре мы не будем касаться подробного описания современных методов молекулярной диагностики и особенностей их применения в популяционной генетике. Этим вопросам посвящены многочисленные публикации, такие как, например, интернет-статья Г. Е. Сулимовой (2006) и коллективная монография под редакцией Ю. П. Алтухова (Динамика популяционных генофондов..., 2004) и т. д. Рассмотрим только примеры использования этих технологий для популяционно-генетического анализа моллюсков.
Как уже было сказано, новые подходы были с успехом опробованы на уже ставших традиционными объектах, для которых был накоплен обширный материал по фенетике и «аллозимной» генетике.
Например, у гавайских улиток P. taeniata, (напомним, исследования которых было начато в 1918 году) анализ митохондриальных генов проведенный С. Гудакр (Goodacre, 2001), показал, что относительные частоты двух митохондриальных гаплотипов изменяются довольно резко даже у близко расположенных популяций, по-видимому, независимо от окружающей среды. Причем этот переход примерно совпадает с градиентами некоторых морфологических признаков. Вероятно, многие из этих различий накопились, в результате случайного генетического дрейфа и отбора, в то время как популяции были изолированы друг от друга. Изоляция популяций, возможно, произошла в результате демографических изменений, или во время процесса колонизации, когда случайные дальние мигранты основывали новые колонии. Исследователь считает, что текущий генетический дрейф, даже, несмотря на ограниченный обмен генами, может поспособствовать небольшим генетическим перестройкам, хотя вероятно, что внешние фенотипические особенности, такие как цветовые варианты раковин и комбинации полос находятся под влиянием отбора.
В последнее десятилетие появляется много работ, основанных на использовании микросателлитных маркеров ДНК (557? - simple sequence repeat) (Litt, Luty, 1989; Tautz, 1989). В данном методе подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, которые фланкируют микросателлитный повтор. Такие локусы имеют множество вариантов (аллелей), которые отличаются по количеству повторов. Наследование их идет по кодоминантному типу. Сейчас выявлено много микросателлитных последовательностей ДНК у разных организмов, включая моллюсков, для последующего таксономического и популяционного анализа. Принципы выявления микросателлитных аллелей и их номенклатуры, особенности мутационного процесса по микросателлитным локусам рассмотрены в работе Л. А. Животовского (2006).
Так, 5 новых полиморфных микросателлитных локусов (далее 557? локусов) определены у моллюсков Arianta arbustorum (Locher, Baur, 2001). У Lymnaea stagnalis идентифицировано 9 SSR локусов (Knott, Puurtinen, Kaitala, 2003). Для улиток родов Mandarina, Euhadra и Ainohelix, которые полезны для понимания вопросов экологии, видообразования и адаптации, определено 17 557? последовательностей (Davison, Satoshi, Kawata, 2004). У слизней Arion intermedins и Deroceras reticulatum выявлено по 6 557? локусов (Microsatellites..., 2001). Выделены и охарактеризованы 8 полиморфных 557? локусов у исчезающей Гавайской улитки Achatinella sowerbyana (Erickson, Hadfield, 2008). Разработаны и охарактеризованы 10 новых 557? локусов у мидии рода Mytilus (Characterization ..., 2009). У Litorina obtusata протестированы 7 SSR локусов, содержащих 90 аллелей (Козьминский, Фокин, 2007), а у Litorina fabilis - 4 SSR локуса (Фокин, 2007). Охарактеризованы 10 полиморфных SSR локусов у пресноводной улитки Biomphalaria kuhniana, обитающей в Венесуэле (Development..., 2009). Проведен анализ выделенных 8 SSR локусов у наземной улитки Trichia caelata, позволивший выявить редкую разновидность этого вида в горах Швейцарии (Polymorphic..., 2007).
После того как Дэвисон (Davison, 1999) построил геномную библиотеку для С. nemoralis с выделением пяти полиморфных микросаттелитных последовательностей ядерной ДНК имеющих 33 аллеля (метод SSR), началась новая волна исследований популяционной структуры этого вида. Чуть позднее автор исследовал митохондриальный геном С. nemoralis ((Davison, 2000), отметив, что наследование митохондрий у этого моллюска идет только по материнской линии (у других моллюсков, в частности у Mytilus, присутствует двойное наследование - от отца и от матери) (Skibinski, Gallgher, Beynon, 1994).
В Великобритании на основании исследования микросаттелитных локусов митохондриальной ДНК изучена генетическая структура популяций С. nemoralis. Установлена связь между раковинными фенами и митохондриальными гаплотипами. Установлена географическая оригинальность на основе молекулярных маркеров. Определены уровни инбридинга по различным локусам и генетические дистанции. Были выдвинуты предположения о происхождении и эволюции изучаемых групп (Davison, Clarke, 2000). Позднее другие авторы (Goodacre, Thomaz, Davies, 2006) сопоставили предыдущие исследования полиморфизма в пределах двух видов из рода Сераеа (С. nemoralis и С. hortensis) с новыми молекулярными данными на основе митохондриальных генов.
Изменчивость конхиологических признаков Cepaea vindobonensis
Физико-географическая характеристика и состояние окружающей среды района исследования подробно описаны в коллективной монографии (Природные ресурсы..., 2007), а также в других работах (Барановская, 1934; Герасимов, 1941; Берг, 1947; Вильяме, 1947; Мильков, 1956, 1977; Давитая, 1959; Ахтырцев, Соловиченко, 1984; География..., 1996; Атлас природных ресурсов..., 2005). Особенности становления лесостепного ландшафта, состояние флоры и фауны на юге Среднерусской возвышенности, освещаются в серии публикаций (Палимпсетов, 1890; Коржинский, 1891; Танфильев, 1896, 1928; Пачоский, 1910; Козо-Полянский, 1931; Сукачев, 1938; Пьявченко, 1941, 1950; Герасимов, 1941; Арнольди , Арнольди, 1933; Алехин, 1934; Докучаев, 1948, 1953; Зеров, 1950; Кац, 1952; Арнольди, 1965; Кабанов, 1981; Колчанов, 1984, 1996; Присный, Гоголева, 1991, Присный, 1993, 1996, 1999, 2000; Червонный, 1996).
В данном обзоре мы остановимся только на ключевых моментах, необходимых нам для лучшего понимания эколого-генетической структуры популяций изучаемых видов.
Основные наши исследования проходили на юго-западном склоне Среднерусской возвышенности, которая является элементом Восточно-Европейской (Русской) равнины. Район исследования в основном находится в административных границах Белгородской области и, отчасти, охватывает прилегающие территории.
Большую роль в формировании рельефа Среднерусской возвышенности оказало Днепровское оледенение. Хотя возвышенность и не покрывалась ледником (т. к. он обогнул ее по прилегающим низменностям), эта эпоха отразилась на характере расположения речной сети и оказала косвенное влияние на аккумуляцию значительной толщи лессовидных суглинков (Раскатов, 1969; Чендев, 1997).
В настоящее время Среднерусская возвышенность в ее лесостепной и степной части относится к области слабо выраженных положительных движений. Исходная неровность рельефа, наличие почти сплошного покрова делювиальных отложений, бурное снеготаяние и ливневый характер летних осадков создают условия для интенсивного роста эрозийного расчленения поверхности в указанном регионе. Следствием всего этого является обилие оврагов и балок, рассекающих возвышенность, что в общем характерно для широко распространенного здесь склонового (приречного) типа местности. Общая расчлененность рельефа колеблется от 0,2 до 2,0 км/км2. Именно вблизи речных долин наблюдается наиболее энергичное проявление эрозийных процессов. На сглаженных междуречьях в основном протекают суффозионные процессы, в результате которых образуются желобообразные задернованные понижения пологих склонов (Мильков, 1950, 1977). Помимо линейной и плоскостной эрозии в формировании рельефа лесостепи возвышенности принимают участия оползневые процессы (из-за песков, подстилаемых глинами по склонам), а так же карстовые явления, получающие развитие в местах близкого залегания от поверхности известняков и меловых пород.
Территория юга Среднерусской возвышенности включает лесостепную и степную почвенные зоны. Район характеризуется широким распространением почв с высоким содержанием карбонатов, а также выходами мела-рухляка. Господствующее положение здесь занимают черноземы (около 77 %), затем идут серые лесные почвы (15 %). На остальные почвы приходится около 8 %. Среди них выделяют лугово-черноземные, солонцы, солоди, пойменные, песчаные и дерново-намытые почвы. Средний возраст почв колеблется в пределах 5 - 10 тысяч лет (География..., 1996). По району исследования в направлении с северо-востока на юго-запад проходит водораздел между днепровским (Сейм, Псёл, Ворскла) и донским (Северский Донец, Оскол) бассейном. Густота речной сети меняется от 1,2-1,6 км/км2 на западе, до 0,1-0,15 км/км2 на востоке области.
Климат юга лесостепи Среднерусской возвышенности можно охарактеризовать как умеренно-континентальный, переходный от более влажного климата западных районов к засушливому в восточных и юго-восточных районах (География..., 1996). Среднегодовая температура воздуха изменяется от +5,4 С на севере до +6,7 С на юго-востоке района. При этом, в конце XX века температура повсеместно повысилась на 0,2 - 0,6С из-за усиления широтной циркуляции атмосферы, приносящий теплый и влажный воздух с Атлантического океана в зимнее время. Разность температур летом в дневные часы составляет 7,9 С (максимальное значение до +40 С), зимой размах температурных колебаний достигает 16,4 С (минимум до -37С). Количество осадков, выпавших за год, в среднем составляет 540 - 550 мм. Относительная влажность изменяется от 60% в мае, до 86-90% в декабре. Характерной особенность региона являются продолжительные засухи (до месяца) в летний период, которые являются следствием либо поступления континентальных тропических воздушных масс из южных и юго-восточных районов, либо вторжения холодного воздуха с севера, северо-запада или с запада с формированием за холодным фронтом мощного антициклона (Давитая, 1959).
Лесостепная зона Среднерусской возвышенности в целом, и ее южная часть в частности, вследствие разнообразного сочетания элементов ландшафта, отличается чрезвычайной пестротой биоценозов. Среди них выделяют зональные (биоценозы плакорных дубрав и степные биоценозы), интразональные (луговые, водно-болотные, прибрежные и синантропные сообщества) и азональные (арктоальпийские и псаммофильные сообщества) биоценозы. В настоящее время флора юга лесостепи Среднерусской возвышенности насчитывает около 1284 вида (Колчанов, 1984). Характер жизненных форм приближается к биологическому спектру стран умеренно холодной зоны. Причем растительный мир в целом отражает черты лесостепного ландшафта, для которого характерно чередование лесов с луговой степью.
Довольно широким является фитоценотический спектр, включающий в себя лесные фитоценозы, фитоценозы кустарников и опушек, луговые и степные фитоценозы, водно-болотные и прибрежные фитоценозы, а также фитоценозы меловых обнажений. Растительный покров, несмотря на сильную нарушенность, очень тесно связан с геоморфологическими условиями. Особенно это заметно среди лесных формаций. Все лесные массивы непосредственно связаны с развитой на возвышенности долинно-балочной сетью. Среди них выделяют водораздельные, нагорные, байрачные и пойменные дубравы, а так же меловые боры.
Уже упомянутые выше типы биоценозов, существующие в области, характеризуются своеобразным животным населением. Хотя эти типы представлены множеством вариантов, в целом для каждого из них отмечается собственная специфика, особенно в составе беспозвоночных животных. Последних в настоящее время в регионе насчитывается по различным оценкам от 10 до 15 тыс. видов (Присный, Гоголева, 1991; Присный, 1996).
Анализ генетической изменчивости популяций наземного моллюска Bradybaena fruticum с использованием изоферментных маркеров
Собранные моллюски, как правило, обрабатывались в день сбора. Если таковая операция была невозможна в течение нескольких дней после извлечения улиток из природы, то перед вскрытием, особей подкармливали для того, чтобы исследуемые ферменты не потеряли свою активность.
Вскрытие проводилось на холоде, во избежание денатурации белка (для этого использовались специальные холодильные элементы). При необходимости пробы хранили при температуре -80 С, т.к. многие ферменты в таких условиях сохраняют свою активность в течение нескольких месяцев.
Белки экстрагировали у моллюсков из ретракторов ноги (или из мышцы ноги у молодых особей), у жуков-оленей - из грудных мышц. Экстракцию проводили трис-HCL буфером (рН 6,7) разведенным в отношении 1:7. Отношение объема буферного раствора к весу мышцы для ферментов составляет 5:1 или 7:1.
Приготовленную суспензию замораживали в течение суток, затем оттаивали и центрифугировали на холоде в течение 20 мин. при 13000 об/мин.
Используемая нами конструкция камеры для электрофореза в ПААГ позволяла нам одновременно исследовать либо 40 особей (Helicon VE-20) либо 30 особей (Bio-Rad). ПААГ состоял из 2-х слоев: верхнего крупнопорового геля, в котором происходит концентрация водорастворимых белков на одном исходном уровне перед началом разгонки, и из нижнего мелкопорового разделяющего геля, в котором происходит основная разгонка белков.
Обе кюветы камеры на 2/3 заполняли мелкопоровым гелем (10 %), осторожно сверху пипеткой наслаивали дистиллированную воду. Полимеризация нижнего геля шла 20-30 минут. Об окончании реакции полимеризации можно судить по появлению четкой границы между гелем и дистиллированной водой. После чего воду сливали, споласкивали основным буфером и доливали в кювету раствор для получения крупнопорового геля, 112 куда погружали гребенки для формирования лунок в геле. Полимеризация шла на свету 10-15 минут. По окончании полимеризации гребенки осторожно вынимали, и в катодный и анодный отделы камеры заливали охлажденный трис-глициновый буфер (рН 8,3).
В сформированные в геле лунки, под буферный раствор, с помощью одноканальной автоматической пипетки вносили анализируемый материал с добавлением 1-2 капли приготовленного на 60 % сахарозе раствора бромфенолового синего (данный раствор используется в качестве метки, которая позволяет следить за окончанием фореза). Собранную камеру присоединяли к) Режим работы.
В верхнем геле электрофорез идет в течение двадцати минут V = 200 в, I = 80 мА. Когда метка выходила в мелкопоровый гель режим изменяли: V = 400 в, I = 160 мА. Электрофорез проводили при температуре электродного буфера + 4 С. Ширина геля составляла 20 см (для многолокусных ферментов) и 14 см (для однолокусных ферментов). Электрофорез считался законченным после того как метка выходила в буфер. Для более точной идентификации различных локусов использовали повторы некоторых проб в разных блоках.
После окончания электрофореза блоки вынимали и помещали в субстратную смесь для выявления соответствующих ферментов. Схема инкубации представлена в таблице 3.2 (Генетика изоферментов, 1977; Гааль и др. 1982; Нецветаев, 1992; Richardson et. al., 1986). Гели фотографировали и хранили в 7 % уксусной кислоте.
Особенности внутривидового разнообразия, выявленные методом электрофореза в ПААГ В качестве генетических маркеров популяционной структуры исследуемых видов нами использовались локусы аллозимов. Графическое изображение локусов и комбинации аллелей приведены на рисунке 3.12. Оригинальные фотографии электрофореграмм представлены на рисунках 3.13-20.
Неспецифические эстеразы (EST) Буфер 0,1 М Трис НС1, рН 7,4 а-нафтилацетат - 20 мг Р-нафтилацетат - 40 мг Ацетон - 5 мл Прочный красный TR - 5 мг Гели предварительно вымачивали в3 % растворе борной кислоты втечение 20 мин;а-нафтилацетат, р-нафтилацетат ипрочный красный TRпредварительно растворяют вацетоне.Инкубация проводилась в течениеІчаса до проявления коричневыхполос.
Супероксидцис мутаза (SOD) Буфер 0,01 М калий-фосфатный, рН 7,8 Феназин метасульфат-15 мг Нитросиний тетразолий - 15 мг MgCl - 20 мг Инкубация гелей проходит 30 мин в темноте, с периодическим засвечиванием (1-2 мин) до проявления белых полос на темно-синем фоне.
Малатдегидро-геназа (MDH) Буфер 0,1 М Трис НС1, рН 8,4 Феназин метасульфат - 15 мг Нитросиний тетразолий - 15 мг НАД-10 мг Малат натрия - 40 мг Инкубация гелей проходит в темноте 2-3 часа до появления синих полос.
Границы всех локусов определялись проверкой соответствия фактического материала распределения фенотипов ферментов ожидаемому, рассчитанному по уравнению Харди-Вайнберга (сравнение проводилось с использованием критерия у). Наследование всех отмеченных локусов идет по кодоминантному типу.
К pomatia. У данного вида нами было зафиксировано 6 зон активности неспецифических эстераз, из них был интерпретирован один димерный локус с тремя аллелями (EST4) с атипичным проявлением (гетерозиготы 12 и 23 имеют по две зоны активности фермента, а гетерозиготный вариант 13 представлен тремя зонами). Кроме того нами выделено четыре локуса супероксиддисмутазы, из них интерпретирован один димерный локус (SOD2 с двумя аллелями) остальные три являлись мономорфными. Также нами был зафиксирован и диагностирован один локус димерной малатдегидрогеназы (MDH1).
L. cervus. Для анализа использовался один димерный локус неспецифических эстераз с двумя аллелями (EST3). Каждый аллель представлен двумя сцепленными зонами активности. Гетерозиготный вариант имеет три аллелеморфы (центральная зона получается в результате наложения двух полос). При недостаточном времени электрофореза (2 ч. 250 V) данный локус выглядит как мономерный с двумя аллелями из-за нерасхождения сцепленных зон.
