Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Живые иммобилизованные клетки как полиферментные биокатализатры трансформации и биосинтеза органических соединений .7
1.1. Метода иммобилизации клеток микроорганизмов 9
1.1.1. Адсорбция 9
1.1.2. Ковалентное и поперечное связывание 13
1.1.3. Включение и инкапсулирование 15
1.2. Преимущества использования иммобилизованных клеток 17
ГЛАВА 2 . Биосинтетические процессы, осуществляемые швыми микроорганизмами, иммобилизованными включением 19
2.1. Использование иммобилизации клеток для стабилизации активности ферментов 19
2.2. Иммобилизованные шютки, осуществляющие реакции биосинтеза в полноценных питательных средах 21
2.3. Процессы, осуществляемые живыми иммобилизованными включением клетками микроорганизмов в средах, лишенных азота 26
2.4. Получение органических кислот с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов 28
ГЛАВА 3. Эндогенный метаболизм и физиология голодающих бактерий 32
3.1, Особенности инкубирования живых иммобилизованных клеток бактерий .32
3.2. Эндогенный метаболизм и выживание голодающих бактерий 33
3.3. Экскреция внутриклеточных метаболитов микроорганизмами при стрессовых воздействиях 38
ГЛАВА 4. Пути повышения активности и стабильности работы биокатализаторов 41
4.1. Повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток путем изменения условий инкубирования 41
4.2. Возможные пути реактивации биокатализаторов с живыми иммобилизованными клетками 43
ГЛАВА 5. Материалы и методы исследования результаты и их обсуждение
ГЛАВА 6. Условия образования органических кислот иммобилизованными клетками 58
6.1. Динамика кислотообразования иммобилизованными в ПААГ клетками Propionibacterium shermanii 58
6.2. Влияние компонентов иммобилизирующей смеси на активность биокатализатора 59
6.3. Значение функциональной целостности иммобилизованных клеток для осуществления ими полиферментативного процесса 63
ГЛАВА 7 . Оптимизация работы биокатализатора. увеличение стабильности и активности 68
7.1. Оптимизация основных условий работы иммобилизованных клеток Propionibacterium shermanii 68
7.2. Влияние факторов инкубирования на активность и стабильность биокатализатора 70
7.2.1. Влияние частоты смены инкубационного раствора на стабильность кислотообразования 70
7.2.2. Влияние температуры на стабильность биокатализатора.71
7.2.3. Влияние концентрации K/Na-фосфатного буфера не стабильность работы биокатализатора 73
7.2.4. Влияние ионов железа на стабильность работы иммобилизованных клеток Pr.shermanii 75
7.2.5. Влияние источника углерода и энергии на стабильность и активность работы биокатализатора 75
7.3. Возможности регуляции соотношения кислот (пропионовая: уксусная) в получаемом продукте 77
7.3.1. Влияние температуры на соотношение кислот 77
7.3.2. Влияние углеродных субстратов на соотношение кислот в получаемом продукте 79
7.4. Образование органических кислот иммобилизованными в ПААГ клетками Pr.shermanii при проточном инкуби ровании 79
ГЛАВА 8. Реактиващн иммобилизованных клеток Pr.shermanii 84
ГЛАВА 9 . Вцщение буклеотидов и их производных иммобилизованными в пааг клетками бактерии 95
9.1. Состав и динамика выделения дериватов нуклеиновых кислот иммобилизованными в ПААГ клетками Pr.shermanii 95
9.2. Условия выделения дериватов нуклеиновых кислот и белков иммобилизованными клетками Pr.shermanii 99
9.3. Рибосомальная РНК - основной источник выделяемых нуклеотидов и их производных 101
ГЛАВА 10 . Электронномикроскопические исследования биоката лизатора в процессе его длительного функциониро вания и реактивации 108
Заключение 125
Выводы 133
Список литературы 134
- Адсорбция
- Использование иммобилизации клеток для стабилизации активности ферментов
- Особенности инкубирования живых иммобилизованных клеток бактерий
- Повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток путем изменения условий инкубирования
Введение к работе
Новым направлением в биотехнологии является использование иммобилизованных клеток микроорганизмов как биокатализаторов различных реакций трансформации и биосинтеза органических веществ, необходимых человеку. Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для получения в промышленном масштабе аминокислот, углеводов, стероидов, антибиотиков, кофакторов. Их применяют также для очистки сточных вод и в аналитических целях. В ближайшей перспективе возможно промышленное применение десятков процессов на основе таких биокатализаторов. Интерес к иммобилизованным клеткам определяется их технологическими и биологическими преимуществами: легкостью автоматизации процессов, возможностью регуляции активности биокатализаторов, большей стабильностью и удешевлением производства.
Активность и стабильность биокатализаторов на основе живых иммобилизованных клеток является самым существенным вопросом их практического применения. Поэтому разработка методов стабилизации и увеличения активности биокатализаторов является важной задачей в этой области. Решение этих задач невозможно без изучения основных физиолого-биохимических и популяционных особенностей живых микробных клеток в иммобилизованном состоянии.
Органические кислоты широко используют в производстве полимеров, в фармацевтике, текстильной промышленности и в других областях народного хозяйства. Большую часть органических кислот в настоящее время получают путем органического синтеза. Однако для пищевой и фармацевтической промышленности их получают микробиологическим путем. Пропионовая кислота находит применение как консервант влажного зерна (witting, 1981), пищевых продуктов, в силосовании кормов, обогащении соков растений (Рамниеце и др., 1981). Ею можно пропитывать упаковочные материалы с целью предо-
твращения развития микрофлоры на пищевых продуктах при хранении.
Большое значение приобретает использование в пищевой и фармацевтической промышленности различных б'-мононуклеотидов, нук-леозидов и их производных (Федоров, 1979). Они усиливают аромат и вкус пищевых продуктов и используются как антиоксиданты. Наряду с собственно микробиологическим синтезом нуклеотидов и их производных, важное значение при их получении могут иметь микробиологические трансформации нуклеотидов и энзиматическое расщепление нуклеиновых кислот с последующим фракционированием полученных продуктов гидролиза (Безбородов, 1982). Поэтому внутриклеточная деградация нуклеиновых кислот и условия ее проведения представляют большой интерес.
Настоящая работа посвящена изучению физиолого-биохимических особенностей живых иммобилизованных в полиакриламидный гель
(ПААГ) клеток Propionibacterium shermanii С целью ВОЗМОЖНОГО
получения с помощью биокатализатора органических кислот, нуклеотидов и их производных.
Адсорбция
В настоящем обзоре дан не просто анализ технологических процессов, а предпринята попытка выяснить физиологические и биохимические особенности живых иммобилизованных клеток. Знание этих особенностей позволит выяснить дополнительные требования при подборе носителей, необходимых для иммобилизации клеток. Как известно из литературы (Kolot, 1981; Komel, 1982), в настоящий момент тре бования к носителям обусловлены в основном технологическими потребностями.
Под физиологическими изменениями, видимо, следует понимать "ответ" клеток на существование их в иммобилизованном состоянии, которое является принципиально иным, чем при обычных методах культивирования. В начале этой главы мы отмечали, что культивирование иммобилизованных клеток - метод вполне естественный. Действитель- , но, существование микроорганизмов в природных условиях: в почве, на листьях растений, в кишечном тракте животных и т.д. весьма напоминает иммобилизованное состояние. В этих условиях микроорганизмы часто находятся и в голодающем состоянии, и в избытке энергетических субстратов, и в условиях "затрудненного массообмена", и даже ингибирования при существовании в замкнутом микрообъеме. При культивировании клеток в иммобилизованном состоянии создаются весьма похожие условия: избыток или недостаток субстрата, голодание, непрерывная или импульсная подача субстрата, локальное скопление продуктов обмена или непрерывное их удаление (Ghommilh et al., 1982) . Но все-таки следует достаточно осторожно сравнивать физиологические особенности микробных клеток в иммобилизованном состоянии и в природных условиях.
Физиологические изменения у иммобилизованных клеток отмечают многие авторы (Ohlson et al., 1979; Wada et al., 1979; Koshche-enko et al,, 1983) . В результате иммобилизации адсорбцией прежде всего отмечают снижение скорости роста в полноценной питательной среде. Например, у иммобилизованных клеток Saccharomyces avarum на керамических гранулах время удвоения снижается вдвое по сравнению со свободными и при этом 80 % вымываемых клеток, получившихся в результате деления были более мелких размеров. Так же установлено, что происходит синхронизация ростового цикла (Navarro, Durand, 1981). Уменьшение времени генерации адсорбированных клеток E.coli о параллельным снижением биохимической активности показали Хаттори с сотрудниками (Hattori, 1972; Hattori et al.f 1972), Отмечено снижение содержания РНК в клетках. Но для адсорбированных клеток Sacch. cerevisiae отмечено уменьшение удельной скорости роста и одновременное возрастание удельной скорости продуктивности по этанолу, т.е. возрастает биохимическая активность (Tyagi, Gho-se, 1982). Наварро и Даренд установили, что адсорбция клеток Sacch, carlbergensis на кварцевых шариках в 5 раз активирует метаболизм клеток (выделение С02, поглощение глюкозы) и на 7 % увеличивает выход этанола. Авторы отмечают также, что ковалентное связывание снижает активность метаболизма, хотя на выход этанола почти не оказывает влияния (Navarro, Durand, 1977). Многие авторы отмечают размножение клеток на носителе в первое время после иммобилизации, а далее наступление динамического равновесия между количеством закрепленных и вымываемых клеток (Ghose, Bandyopandyey, 1980; Gainer et al», 1980; Rhouxhet et al«, 1981). ВОЗМОЖНО, ЧТО возрастание количества биомассы на носителе до определенного предела за счет размножения связано с самоустанавливающимся процессом, связывающим скорость протока, скорость размножения и уровень образуемого продукта, способного ингибировать процесс. Иммобилизованные клетки Acetobacter асeti постоянно образуют уксусную кислоту. Но при изменении скорости разведения наблюдаются затухающие колебания в концентрации уксусной кислоты. Т.е. происходит переход системы на новый уровень стационарного состояния, когда количество активних клеток поддерживает концентрацию продукта на уровне, ингибиругащем дальнейшее накопление биомассы (Gommiih et al., 1982). Аналогичную картину наблюдали другие авторы (Theo-dorou et al., 1981) для продуцента целлюлаз - гриба Trichoderma reesei в колонке со стеклянными бусами и целлюлозой. В данном случае количество биомассы было ниже, чем при инкубации обычным способом, как и количество редуцирующих Сахаров, которые ингиби-руют синтез ферментов, уровень которых был достаточно высоким. Такие закономерности в "поведении" иммобилизованных микроорганизмов весьма напоминают авторегуляцию в природных сообществах. Отмечено, что в адсорбированных условиях микроорганизмы сдвигают оптимум рН, а иногда и температуры. При этом температурный оптимум повышается, но часто процессы более стабильны при более низких температурах (Кощеенко и др., 1979). Возможно, что температурная устойчивость и сдвиг оптимумов рН связаны с модификацией клеточной стенки в процессе иммобилизации. Так как процесс обычно оптимизируют по выходу продукта, то система клеточная стенка-фермент из-за модификации клеточной стенки может переходить в другой интервал оптимальных значений рН или температуры без значительного нарушения функциональной целостности. Таким образом, исследования иммобилизованных адсорбцией клеток проводятся довольно широко. Их применение рационально при очистке сточных вод, получении биогаза и осуществлении процессов выращивания микроорганизмов.
Использование иммобилизации клеток для стабилизации активности ферментов
Стабилизация ферментной активности была одной из первых используемых функций иммобилизованных клеток. Для этого используют как убитые клетки (Chibata, 1980; Зуева и др., 1982), так и живые (Гулая и др., 1979). іулая с сотрудниками (1979) установили взаимозависимость стероидтрансформирующей активности иммобилизованных в ПААГ клеток Sacch.cerevisiae от жизнеспособности и дыхательной активности. Отмечено, что увеличение температуры инкубирования выше 28 снижало стероидгидрогеназную активность. Ионы мп+2 и стабилизировали процесс.
При иммобилизации в ПААГ клеток Mycobacterium giobiforme была также установлена взаимосвязь между стероидтранеформирующей активностью и потреблением кислорода (Кощеенко и др., 1977; Koshcheenko et al., 1981). Авторы установили, что 20-оксиредуктаза проявляет 100 % активность за счет эндогенного кофактора НАДН2 в течение 3 суток, а при добавлении экзогенного НАДН2 - еще в течение 7 суток. Далее наступает процесс необратимой инактивации фермента. Тот факт, что экзогенный НАДН2 не "работал" более длительный срок, можно объяснить нарушением гомеостаза иммобилизованных клеток. При этом необходимо учесть, что инкубирование биокатализатора проводили в отсутствие питательной среды. Электронномикроскопическими методами показано возникновение лизированных клеток. Яковлевой (1978) показано, что клетки E.coli выполняют защитную, стабилизирующую функцию при стереоспецифическом образовании аминокислот, несмотря на присутствие всех ферментов других метаболических процессов.
Другим интересным способом является использование иммобилизованных клеток для синтеза веществ из предшественников в присутствии источника энергии. Мурата с сотрудниками (Murata etal.,1978) сообщили о синтезе иммобилизованными в ПААГ клетками Saceh.cerevi-siae глутатиона из глутамата, цистеина и глицина в присутствии глюкозы. Авторы подчеркивают, что в отсутствии глюкозы синтеза не происходит. Гликолиз, осуществляемый дрожжами обеспечивает регенерацию АТФ, необходимого для синтеза глутатиона. В отличие от свободных, у иммобилизованных клеток глутатион выделялся в среду. Процесс прекращался из-за вымывания НАД, добавление которого увеличивает время функционирования биокатализатора. Снижение активности биокатализатора на половину происходит через 26дней. Этими же авторами была проведена иммобилизация клеток Е.со 21li в в каррагинан. Клетки E.coli в обладают глутатионсинтетаз-ной и ацетаткиназной активностями. При инкубировании иммобилизованных клеток Е.соїі в в среде, содержащей кроме предшественников глутатиона, ацетилфосфат и АТФ наблюдали образование глутати-она (Murata et al.f 1980).
В другой работе этими авторами (Muraa et al., 1981) показана также возможность совмещения двух ферментативных процессов в одной матрице, а именно, синтеза глутатиона и процесса регенерации АТФ, катализируемого ферментами глико-литического пути иммобилизованных в ШАГ клеток Sacch.cerevisiae. Поэтому в среду кроме предшественников глутатиона включена глюкоза.
Интерес представляет система непрерывного получения водорода из малата иммобилизованными в агар-агар клетками Rodospirillum rubrum. Этот процесс осуществлялся с помощью восстановленного НАДФН. В свою очередь, рециклическое восстановление экзогенного НАДФ проводили иммобилизованные в агар-агар клетки Anacystis ni-duians. в данном случае было проведено разделение функций между двумя организмами (Weetal, Krampitz, 1980). Известны случаи (Sommerville, Mason, 1979; Гулая и др., 1979), когда наряду с лизисом иммобилизованных клеток наблюдали и их размножение. Но все-таки большинство клеток находилось в нерасту-щем состоянии. Необходимо отметить, что энергопотребляющие процессы трансформации и биосинтеза всегда происходят в физиологических пределах рН и температуры для используемых микроорганизмов. Как правило, необходимо присутствие тех или иных ионов.
Особенности инкубирования живых иммобилизованных клеток бактерий
Все методы иммобилизации оказывают существенное влияние на физиологию клеток. При исследовании иммобилизованных клеток важно отличать подлинные изменения в физиологии клеток от изменений, вызывающих сходный эффект, таких как перенос массы, коэффициент теплового переноса. Из литературы известно, что лишь немногие работы были проведены с учетом этих соображений (Som-merville, Mason, 1979). В большинстве работ преследовались технологические цели и авторы изучали лишь некоторые стороны физиологии иммобилизованных клеток. Несомненно, потребность в изучении физиологии и биохимии иммобилизованных клеток стало необходимостью в связи с все более широким применением живых иммобилизованных клеток микроорганизмов для трансформации и биосинтеза. Сейчас можно выделить группы процессов, основанных на разной степени использования метаболических и физиологических функций живых иммобилизованных клеток. 1. Трансформация органических соединений одним или двумя ферментами. Живые клетки используются как стабилизаторы этих ферментов, защищая их от неблагоприятных воздействий. 2. Трансформация органических соединений ферментами, требующих кофакторов. Живые клетки кроме протекторной функции обеспечивают регенерацию используемых кофакторов за счет окисления эндогенных и экзогенных источников энергии. 3. Многостадийные синтетические процессы, взаимосвязанные со всем метаболизмом клетки. 4. Получаемое вещество является конечным продуктом основных энергопоставляющих путей. Соответственно этому применяются разные инкубационные растворы: - превращаемый субстрат в буфере, превращаемый субстрат вместе с источником энергии в буфере, - богатая или лимитированная полноценная среда с превращаемым субстратом или без него, - превращаемый субстрат одновременно являющийся источником энергии в буфере или безазотистой голодной среде. Из вышесказанного следует, что живые иммобилизованные клетки микроорганизмов, осуществляя реакции трансформации и биосинтеза органических веществ, по условиям инкубирования часто находятся в состоянии голодания или лимитирования различными компонентами питательной среды. На наш взгляд, в физиологии голодающих и части иммобилизованных клеток много общего: их активность обусловлена, большей частью, функционированием эндогенного метаболизма. Отсутствие источника азота или его недостаток лимитирует размножение иммобилизованных клеток, изменяется их биосинтетическая активность. Кроме этого, иммобилизованные клетки испытывают стрессовые воздействия непосредственно в процессе иммобилизации.
В предыдущей главе показано, что жизнеспособность иммобилизованных клеток обусловливает их ферментативную активность, даже если это один фермент. А способность оставаться живыми в голодных условиях существования в значительной степени определяется свойствами эндогенного метаболизма,
Многие микроорганизмы способны выживать при длительных периодах голодания. Например, Arthrobacter crystallopoietes за 30 дней голодания сохраняет 100 % жизнеспособность (Boylen, Enzygn, 1970). Голоданием обычно называют жизнедеятельность микроорганизмов в отсутствие экзогенных питательных веществ и элементов. Основной вид жизнедеятельности клеток в голодающем состоянии -функционирование эндогенного метаболизма, обеспечивающего клетки энергией поддержания и частичный ресинтез конститутивных клеточных компонентов, необходимых для выживания. Дэвис и Риббонс определяют эндогенный метаболизм клетки как совокупность метаболических реакций и их]интенсивность, которые имеют место, когда бактериальные клетки лишены питательных веществ и элементов, могущих служить экзогенными субстратами. Существование такого метаболизма не обязательно связано с наличием специальных эндогенных источников углерода, азота и энергии. Клетки могут разлагать белки, РНК, липиды, содержание которых зависит от состава среды, на которой микроорганизмы предварительно выращивались (Dawes, Ribbons, 1962). Эндогенный метаболизм выполняет в отсутствие экзогенных субстратов ряд функций. 1. Он поставляет энергию. 2. Поставляет углеродные субстраты для ресинтеза деградированных клеточных компонентов. 3. Выполняет специальные функции, например, поставляя восстановительные эквиваленты. Клетке требуется энергия для поддержания внутриклеточных процессов и физиологического гомеостаза. Энергия расходуется на осмотическую регуляцию, поддержание внутриклеточного рН, кругооборот макромолекул и споруляцию (Dawes, Ribbons, 1962). В отсутствие экзогенных субстратов эта энергия должна черпаться из эндогенных источников. Перт определяет энергию поддержания как энергию, потребляемую клеткой для иных функций, чем синтез нового клеточного материала (Pirt, 1965). Очевидно, что энергия под 35 держания необходима как во время голодания, так и во время роста бактерий. Выживаемость голодающих бактерий зависит от вида организма, фазы роста, скорости роста, состава среды выращивания и среды, используемой для определения жизнеспособности. Кроме этого имеют значение плотность популяции и химическая природа компонентов голодной среды. Оценку выживаемости затрудняют явления критического роста и субстратускоренной смерти (Postgate, Hunter, 1962). Интенсивность эндогенного-метаболизма заметно влияет на выживаемость. Эндогенный метаболизм, образующий больше энергии, чем нужно для поддержания, обусловливает более быструю смерть голодающих бактерий. Степень эндогенного метаболизма, соизмеримая с потребностями в поддержании, значительно увеличивает выживаемость бактерий при голодании (Dawes, 1976). Вилсон с сотрудниками измеряли дыхательную активность и жизнеспособность клеток Sacch.cerevisiae, выращенных в разных условиях. Более низкую жизнеспособность клеток, выросших анаэробно, авторы связывают не с эффективностью дыхания, а с истощением эндогенных субстратов и невозможностью поддержания энергетического обмена на уровне, достаточном для обеспечения репарационных процессов (Wilson et al., 1977).
Повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток путем изменения условий инкубирования
Ферментативная активность живых иммобилизованных клеток зависит от типа носителя, его концентрации, длительности контакта с мономерными компонентами носителей, температурного режима иммобилизации и количества включенной биомассы. Применение нетоксичных носителей типа каррагинана или коллагена значительно повышает активность иммобилизованных клеток. Например, образование 1-яблочной кислоты клетками Brevibacterium flarum иммобилизованными в каррагинан была в 5.2 раза выше, чем в ПААГ (Takata et al., 1980). Снижение концентрации акриламида с 10 % до 5 % и снижение температуры полимеризации геля существенно повышало жизнеспособность иммобилизованных клеток E.coli (Старостина и др., 1982). Низкая температура и быстрая полимеризация необходимы для пропионовокислых бактерий, осуществляющих брожение (Воробьева и др., 1977; Иордан и др., 1979).
Оптимизацию процессов, осуществляемых живыми иммобилизованными клетками проводят также, как для свободных клеток. Подбирают оптимальные для данного процесса рН среды, концентрацию субстрата и биомассы, режим аэрации и интенсивность массообмена. Но при использовании иммобилизованных клеток оптимальные для активности условия не всегда являются наилучшими. При оптимизации необходимо учитывать такой параметр как стабильность: значения факторов, оптимальные для активности могут не совпадать с таковыми в отношении стабильности. После иммобилизации многие авторы отмечают расширение температурного оптимума и изменение температурной стабильности. Гмударствеина БИБЛИОТЕКА СССР мм, В. И. /;say»?. Клетки Corynebacterium dismutans, иммобилизованные в ПААГ синтезировали больше аланина при 37 (оптимальная температура роста 25) и были при этом более стабильны, чем свободные (Sarkar, Mayandon, 1983). У иммобилизованных клеток отмечают незначительные изменения оптимальных значений рН по сравнению со свободными клетками. Большое влияние на активность оказывают концентрация субстрата и продукта. Например, повышение концентрации глюкозы с 10 % до 25 % снижает на 60 % образование этанола иммобилизованными в каррагинан клетками Sacch.cerevisiae (Wada et al., 1981). Иммобилизованные в ПААГ клетки Propionobacterium shermanii увеличивали скорость образования кислот при повышении концентрации глюкозы в среде с 2 % до 8 % (Воробьева и др., 1977). Конечные продукты могут оказывать ингибирующее действие на ферментативную активность или жизнеспособность. Рост клеток Acetobacter aceti, иммобилизованных на кордиерите, ингибировался образуемой уксусной кислотой, что приводило к снижению активности биокатализатора (Ghommilh et al,, 1982). В то же время для иммобилизованных в ПААГ дрожжей показана более высокая стабильность по сравнению со свободными в присутствии высоких концентраций спирта (Pines, Freeman, 1982). Поэтому при подборе скорости протока субстрата через колонку или его концентрации исследователи должны учитывать такие параметры как полнота превращения субстрата, ингибирование продуктом и стабильность процесса. На ферментативную активность иммобилизованных клеток существенное влияние оказывают размеры гранул. Как правило, увеличение размеров гранул снижает ферментативную активность, так как становится затруднительным доступ субстрата, кислорода и отток продукта от клеток (Vieelken, Раре, 1982)«Транспорт кислорода лимитировал окисление глюкозы в глюконовую кислоту клетками Gluconobacter oxidans, иммобилизованных в Са-альгинатный гель (Tramper et al., 1983). Если для иммобилизации использовали анаэробные микроорганизмы и кислород не был нужен, размер гранул достигал 4 мм (Havarro et al., 1983), для аэробных микроорганизмов требовались гранулы размером до I мм (Sawada et al,, 1981). Электронно-микроскопическими исследованиями показано, что в процессе длительной работы иммобилизованных клеток происходит своего рода "перераспределение" популяции клеток в объеме гранулы. Клетки, находящиеся в центре гранул лизируются, и в результате вторичного (криптического) роста за счет материала лизированных клеток образуются новые клетки в приповерхностном слое гранул (Кощеенко, I98I6; Lee et al#, 1983). Такое "перераспределение" обусловлено, видимо, лучшими условиями массообмена и аэрации вблизи поверхности гранул или на них. Имеются сведения, что в некоторых случаях размножение может происходить по всей толщине гранул (ІУлая и др., 1979). Такая картина распределения клеток внутри гранул при длительной работе биокатализатора должна бы наблюдаться всегда в условиях анаэробного инкубирования, так как отсутствует основной лимитирующий фактор - кислород. Но в этом случае сказывается затрудненный транспорт субстрата к живым иммобилизованным клеткам в центре гранул и рост также может наблюдаться в приповерхностном слое геля.
