Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Род Photorhabdus семейства Enterobacteriaceae включает три вида подвижных биолюминесцентных почвенных грамотрицательных бактерий: Photorhab- dus temperata, Photorhabdus luminescens и Photorhabdus asymbiotica. Бактерии всех трех видов - симбионты энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae, вместе с которыми вызывают гибель личинок широкого круга насекомых, что способствовало использованию P. luminescens в качестве биоинсектицида (Forst S. et al., 1997). Бактерии P. asymbiotica, в отличие от P. temperata и P. luminescens, патогенны для людей. К настоящему времени в клинической практике зафиксировано 18 случаев инфицирования людей (шесть в США и 12 в Австралии) бактериями P. asymbiotica (Gerrard J.G. et al., 2011). Не исключено, что благодаря трудностям при идентификации патогена число заболевших людей значительно выше, чем это отражено в научных публикациях (Gerrard J. et al., 2004). В ряде случаев бактерии P. asymbiotica, выделенные из клинических образцов, расценивали как вторичную микрофлору раневых поверхностей, но не этиологический агент заболевания. Изучение патогенности Photorhabdus spp. до настоящего времени фокусировалось на использовании в качестве экспериментальной модели насекомых (Hallem E.A. et al, 2007; Khush R.S., Lemaitre B., 2000; Tzou P. et al, 2002; Vodo- var N. et al., 2004), поэтому для изучения фоторабдоза человека необходим подбор адекватных теплокровных модельных лабораторных животных.
Известно, что одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), а его структура определяет исход взаимодействия патогена с факторами врожденного иммунитета хозяина (Morrison D.C., Ryan J.L., 1987; Raetz C.R., Whitfield C., 2002; Montminy S.W., et al. 2006). Способность представителей рода Photorhabdus эффективно преодолевать врожденный иммунитет у насекомых, а в случае P. asymbiotica - и у людей, напоминает таковую у бактерий рода Yersinia - Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica - также патогенных и для насекомых, и для млекопитающих (Heermann R., Fuchs T.M., 2008). В то же время установлено, что образование наиболее вирулентного вида рода Yersinia - Y. pestis - сопровождалось существенным изменением структуры ЛПС, в том числе утратой способности синтезировать ЛПС с О-полисахаридной цепью (Skurnik M. et al., 2000). P. Wilkinson et al. (2009) высказали предположение о том, что в ходе инфекции у людей может модифицироваться структура ЛПС P. asymbiotica, как это происходит у других грамотрицательных патогенов, способных уклоняться от распознавания иммунной системой млекопитающего. Показано, что представители рода Photor- habdus синтезируют ЛПС в S-форме (Bennett H.P.J., Clarke D.J., 2005), включающий О-полисахарид (О-антиген), олигосахаридную часть (кор) и липид А, однако его структура до настоящей работы не была определена ни у одного из видов, входящих в этот род.
Систематическое структурное исследование ЛПС и изучение биологических свойств бактерий рода Photorhabdus, отличающихся по патогенности для человека, необходимы для выяснения механизмов избирательной вирулентности представителей различных видов Photorhabdus для теплокровного хозяина.
Цель исследования - получение новых сведений о структурной организации липополисахаридов и биологических свойствах бактерий рода Photorhabdus., связанных с патогенностью для человека.
Задачи исследования
-
Создать и охарактеризовать представительную коллекцию штаммов Pho- torhabdus spp.
-
Определить структуру ЛПС представителей различных видов и подвидов рода Photorhabdus и оценить характер влияния температуры выращивания штаммов Photorhabdus spp. на структуру ЛПС.
-
Сравнить биологические свойства штаммов Photorhabdus spp., отличающихся по патогенности для человека (вирулентность для мышей, устойчивость к катионным антимикробным пептидам и комплементу сыворотки крови, эндоток- сическую активность ЛПС).
Научная новизна
Впервые установлены структуры О-полисахаридов рода Photorhabdus. В их составе обнаружены редко встречающиеся компоненты: D-глицеро-Б-манно- гептоза и 3,6-дидезокси-3-формамидо-Б-глюкоза в P. Iuminescens, 2-ацетамидо- 4-амино-2,4,6-тридезокси-Б-галактоза и 2-аминоэтилфосфатное производное N- ацетил-Б-галактозамина в P. temperata. Особенностью О-полисахаридов P. asymbiotica является присутствие необычного N-ацильного заместителя 2,4- диамино-2,4,6-тридезоксиглюкозы (Qui4N) - N-формилглицила, который ранее не был обнаружен в бактериальных полисахаридах.
Впервые определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС представителей трех видов рода Photorhabdus и обнаружено влияние температуры культивирования бактерий на содержание D-глицеро-Б-манно-гептозы и степень фосфорилирования кора. Получены первые данные о степени ацилирования ли- пида А Photorhabdus spp., позволившие обосновать одинаковую эндотоксическую активность in vivo препаратов ЛПС P. asymbiotica и P. luminescens с одной стороны и Y. pestis с другой стороны.
Впервые показано, что штаммы P. asymbiotica и P. luminescens, в отличие от штаммов P. temperata, патогенны для лабораторных мышей, и определены величины LD5O для мышей BALB/c представителей двух подвидов - P. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis. Выявлена гетерогенность представителей трех видов Photorhabdus spp. по устойчивости к антимикробным катионным пептидам и комплементу нормальной человеческой сыворотки.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные фундаментальные сведения о тонком строении ЛПС Photorhabdus spp. открывают путь для функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов их биосинтеза. Обнаруженное структурное разнообразие О- полисахаридов Photorhabdus spp. при низком разнообразии структур P. asymbiotica на уровне подвидов имеют значение для уточнения таксономического положения изученных бактерий. Выявленное сходство О-полисахаридов P. asymbiotica и таксо- номически отдаленных микроорганизмов, включая Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio anguillarum, Francisella tularensis и
Francisella novicida, проливает свет на эволюционную историю О-антигенов гра- мотрицательных бактерий. Продемонстрированное на мышиной модели соответствие P. asymbiotica третьему и четвертому постулатам Генле-Коха (Koch R., 1882) окончательно доказывает этиологическую роль этих бактерий в развитии фотораб- доза теплокровных животных.
Создана и охарактеризована коллекция из 23 штаммов Photorhabdus spp., включающая штаммы, относящиеся к различным внутривидовым группам P. asymbiotica - возбудителя нового инфекционного заболевания человека - фо- торабдоза. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск, Московская обл.) депонировано 23 штамма Photorhabdus spp. (федеральный уровень внедрения).
В базе данных Bacterial Carbohydrate Structure DataBase version 3 DELTA () депонировано 3 структуры молекул ЛПС Photorhabdus spp. Номера доступа к структурам (Structure IDs): 26852, 26853, 26854 (международный уровень внедрения). (4 цитирования по данным Web of Science на 13.07.2013 г.).
Выявленные структурные особенности O-полисахаридных цепей ЛПС бактерий Photorhabdus spp. могут послужить основой для серологического типирова- ния этих бактерий. Выделенные из штаммов Photorhabdus spp. препараты ЛПС в настоящее время применяются в иммунологических исследованиях в отделе им- мунобиохимии патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ (п. Оболенск, Московская обл.).
Разработанная мышиная модель фоторабдоза может быть использована для изучения формирования и течения экспериментальной фоторабдозной инфекции, а также создания эффективных схем антимикробной терапии заболевания.
Материалы диссертации используются в лекциях для аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ.
Методология и методы исследования
В исследовании использовались экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, методы аналитической химии углеводов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
-
Установленные структуры О-полисахаридов (O-антигенов) энтеробактерий рода Photorhabdus и идентифицированные в их составе компоненты, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, являются потенциальной основой для разработки схемы серотипирования бактерий этого рода.
-
P. asymbiotica соответствует всем четырем постулатам Генле-Коха и является этиологической причиной развития фоторабдоза теплокровных животных, а мыши линии BALB/c - адекватная модель для воспроизведения фоторабдоза человека.
-
Бактерии P. luminescens subsp. laumondii при подкожном введении в высокой дозе способны воспроизводить клиническую картину фоторабдоза, не вызывая гибели мышей линии BALB/c.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.
Основные положения диссертационной работы представлены на II Научно- практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно- исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.); 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (19-22 сентября 2010 г., Финляндия); III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (28-30 марта 2011 г., Москва); III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспот- ребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (31 мая-2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.); 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2-6 сентября 2012 г., Суздаль).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 28 января 2010 г. (протокол № 1, приказ № 14 от 04 февраля 2010 г.) с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 15 марта 2013 г. (протокол № 3). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 29 от 29 апреля 2013 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе три статьи в рецензируемых изданиях (из них одна - в отечественном, две - в международном) и пять работ - в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Структура липополисахаридов и избирательная вирулентность возбудителей фоторабдоза
-
