Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Аминоацил-тРНК-синтетазы: краткий обзор функций 12
1.2. Аминоацил-тРНК-синтетазы: два класса, семь подклассов 14
1.3. Аминоацилирование: активация тРНК 19
1.4. Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК 22
1.5. Ингибиторы аминоацил-тРНК-синтетаз: потенциальные эффективные антибиотики 25
1.6. Аминоацил-тРНК-синтетазы: происхождение и эволюция 27
1.7. Фенилаланил-тРНК-синтетаза 32
1.7.1. Структура и свойства 32
1.7.2. Неканонические функции 36
1.7.3. Комплекс с TPHKPhe 37
1.7.4. Комплексы с Phe и PheOH-AMP 41
2. Экспериментальная часть 44
2.1. Материалы и методы 44
2.1.1. Выделение и очистка фенилаланил-тРНК-синтетазы 45
2.1.2. Кристаллизация фенилаланил-тРНК-синтетазы 47
2.1.3. Получение комплекса PheRS-Phe-AMP 48
2.1.4. Получение данных рентгеновской дифракции 48
2.2. Обработка результатов 49
2.2.1. Первичная обработка данных рентгеновской дифракции 49
2.2.2. Построение и уточнение пространственной модели 51
3. Результаты исследования 54
3.1. Выделение, очистка и кристаллизация гомогенного фермента 54
3.2. Реакция аминоацилирования в присутствии дивалентных ионов... 54
3.3. Обзор структуры функционального комплекса 57
3.4. Связывание и распознавание фенилаланин-аденилата 60
3.5. Распознавание фенилаланина в ряду ароматических аминокислот..68
3.6. Ион металла в области взаимодействия а- и В-субъединиц гетеродимера 73
3.7. Ион сульфата на поверхности ДНК-связывающего домена 74
4. Обсуждение результатов 76
Выводы 83
Литература 85
- Аминоацил-тРНК-синтетазы: краткий обзор функций
- Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК
- Выделение и очистка фенилаланил-тРНК-синтетазы
- Выделение, очистка и кристаллизация гомогенного фермента
Введение к работе
Актуальность темы. Трансляция генетического кода является одним из определяющих свойств живых систем, и эта функция во многом базируется на небольшом семействе ферментов - аминоацил-тРНК-синтетаз. Более того, современные исследования продемонстрировали способность рибосомальной РНК самостоятельно проводить целый ряд химических реакций, которые прежде считались прерогативой белков, в том числе включение аминокислот в аминоацил-тРНК и гидролиз ее аналогов (Noller et al., 1992), что еще более подчеркивает важную роль этих ферментов. После образования молекулы аминоацил-тРНК (иначе называемого «активацией тРНК»), специфичность белкового синтеза во многом зависит от комплементарных взаимодействий между парами оснований, и дальнейший химический катализ может быть осуществлен представителями «мира РНК» (Carter С, 1993). Однако специфичность самого синтеза аминоацил-тРНК требует участия белков. Эта специфичность настолько высока, что примерно на 10 000 верных реакций аминоацилирования происходит лишь одна ошибочная (Yamane & Hopfield, 1977). Реакция, на самом деле, базируется на стереоспецифическом узнавании между синтетазой, аминокислотой и тРНК в ходе двухстадийного процесса аминоацилирования: aaRS + аа + АТР <-> aaRS(aa-AMP) + РРі aaRS(aa-AMP) + tRNA <-> aaRS + aa-tRNA + AMP
Таким образом, понимание структуры и механизма функционирования этих ферментов может дать ответы на многие из важных вопросов, стоящих перед молекулярной биологией. А благодаря центральной роли aaRS в трансляции генетического кода, эволюцию синтетаз и их тРНК необходимо рассматривать в тесной связи с проблемой происхождения жизни (Schimmel Р., 1991; Moras D., 1992).
Каждый белок специфичен для одной определенной аминокислоты и одной или нескольких изоакцепторных тРНК (см. обзоры Delarue, 1995; Cusack, 1995, 1997; Arnez & Moras, 1997). В настоящее время четко определены основные взаимосвязи внутри семейства аминоацил-тРНК-синтетаз. Сравнение структур на различных уровнях - от первичной до третичной - позволяет разделить семейство синтетаз на два класса (Eriani et al., 1990), внутри которых различают 7 подклассов. Важнейшим различием ферментов двух классов является конечная точка аминоацилирования на 3'-концевом аденозине тРНК: синтетазы класса I производят присоединение по 2'-гидроксильной группе рибозы, тогда как синтетазы класса П переносят аминоацил-аденилат на З'-гидроксил (Freist W., 1988). Разделение на два класса подтверждается и результатами кристаллографических исследований, показавших две различных архитектуры активных сайтов, которая остается постоянной среди практически всех членов одного класса. Более того, в активных сайтах синтетаз обнаружены высоко консервативные аминокислотные последовательности (Perona etal., 1991), и их важность подтверждена кинетическими исследованиями мутантных ферментов (Wilkinson et al, 1983).
Механизм аминоацилирования является столь сложным, поскольку специфичное узнавание родственной тРНК, по-видимому, включает в себя конформационные перестройки как самой синтетазы, так и тРНК, происходящие в ходе связывания и переноса аминоацил-аденилата. Хотя большинство из определенных на настоящий день структур показывают важность взаимодействия с антикодоновым триплетом тРНК для точного ее узнавания, различные aaRS вовлекают во взаимодействие и иные сайты тРНК, изменяющиеся от фермента к ферменту (Carter С, 1993). Видимо, тРНК-связывающие домены были более подвержены эволюционным изменениям, нежели каталитические. То есть, две каталитические функции синтетаз - активация аминокислоты и перенос аминоацил-аденилата на молекулу тРНК - эволюционировали и развивались в значительной мере независимо друг от друга.
Фенилаланил-тРНК-синтетаза - наиболее крупный и сложный фермент группы, принадлежащий ко II классу и обычно выделяемый в отдельный подкласс d. Его субъединичная организация (оф)2 была установлена для белка, выделенного из Thermus thermophilus НВ8 (Mosyak et al., 1995). Каталитический домен, характерный для синтетаз II класса, входит в состав а-субъединицы (350 аминокислотных остатков), а более крупная Р-субъединица (785 аминокислотных остатков) включает, помимо прочих, домен, структурно весьма схожий с каталитическим, но не обладающий каталитической активностью. Наряду с этим, Р-субъединица включает и другие элементы, в том числе олигонуклеотид-связывающий домен и рибонуклеопротеидный домен. Структура PheRS в комплексе с тРНК е установлена при низком разрешении (Goldgur etal., 1997). В ходе анализа этих структурных данных был продемонстрирован необычный способ связывания тРНК, в котором принимают участие одновременно оба гетеродимера белка.
Вообще, три аспекта изучения аминоацил-тРНК-синтетаз представляют особый интерес. Это - механизмы специфического узнавания и активации соответствующей аминокислоты, узнавание и аминоацилирование тРНК и, наконец, эволюция и дивергенция 20 молекул-синтетаз от древних предшественников. Ответы на эти вопросы способна дать атомная структура как самих синтетаз, так и их комплексов с функциональными субстратами.
Цель и задачи: Цель исследования - установить пространственную структуру фенилаланил-тРНК-синтетазы в комплексе с функциональным лигандом - фенилаланил-аденилатом - и выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе распознавания субстратов и прохождения первого этапа реакции аминоацилирования.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Найти способ преодоления невозможности протекания реакции аминоацилирования в кристаллах нативной фенилаланил-тРНК-синтетазы, что связано с присутствием в маточном буфере высокой концентрации соли аммония, с одной стороны необходимого для стабилизации кристаллов, а с другой - ингибирующего строго необходимое для реакции взаимодействие с ионами магния.
Проведя первую стадию реакции в кристаллах нативной фенилаланил-тРНК-синтетазы, установить пространственную структуру образовавшегося комплекса при возможно большем разрешении.
На основе полученных данных, а также результатов предыдущих исследований установить молекулярные механизмы, лежащие в основе первой фазы катализируемой реакции, объяснить роль в них катионов Mg , а также обосновать высокую специфичность распознавания субстратов первой фазы реакции - молекул АТФ и фенилаланина.
Научная новизна. В ходе работы доказана возможность успешного прохождения реакции аминоацилирования в присутствии ионов Mn2+, а также установлена структура фенилаланил-тРНК-синтетазы в комплексе с фенилаланил-аденилатом, продуктом первой стадии катализируемой этим ферментом реакции. Структура получена при высоком разрешении 2.6 А, что позволило установить механизмы, лежащие в основе высокоспецифического распознавания белком субстратов - АТФ и фенилаланина.
Выявлено присутствие в структуре катионов Мп и анионов S04 ", выдвинута гипотеза об их роли в функционировании фенилаланиловой системы, стабилизации пространственной структуры гетеродимерного белка и, возможно, специфическом связывании с ДНК.
На основе структурных данных установлена молекулярная схема прохождения первой стадии реакции аминоацилирования.
Практическая значимость. Большой практической значимостью обладают исследования механизмов всех этапов синтеза белка, а также структуры и молекулярных принципов функционирования вовлеченных в этот процесс ферментов. Результаты подобных работ не только способствуют более глубокому пониманию одного из наиболее фундаментальных жизненных процессов, но и помогают модулировать его, создавать антибиотики, специфически ингибирующие белковый синтез. Многообразие функций аминоацил-тРНК-синтетаз - в том числе, регуляторных, - позволяет говорить и о возможности использования их в решении самых разнообразных задач, связанных с необходимостью регуляции внутриклеточного метаболизма. С другой стороны, отсутствие четких знаний о структуре, механизмах регуляции и функционирования этих ферментов не позволяют пока активно использовать эти возможности в медицинских целях.
Особый интерес при этом представляет собой фенилаланил-тРНК-синтетаза, один из наиболее крупных и сложных ферментов данного класса, для которого продемонстрировано специфическое связывание с определенными участками ДНК, расположенными в районе 5'-конца гена pheST, кодирующего этот белок (Lechler & Kreutzer, 1998), осуществляя авторегуляцию транскрипции. Некоторые данные говорят и в пользу возможности участия этого белка в раковых процессах, что еще более повышает значение детального изучения механизмов, лежащих в основе функционирования этого фермента.
В связи с этим, целью настоящей работы явилось установление пространственной структуры комплекса фенилаланил-тРНК-синтетазы с продуктом первой стадии катализируемой ею реакции - фенилаланил-аденилатом. На основе полученных результатов мы показали наиболее вероятный механизм специфического распознавания субстратов, АТФ и фенилаланина, а также прохождения первого этапа реакции аминоацилирования.
Место выполнения работы. Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета. Ряд экспериментальных исследований (выделение фенилаланил-тРНК-синтетазы, получение кристаллов белка и комплекса) выполнены на кафедре структурной биологии Института Вайцмана (г. Реховот, Израиль).
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на II и IV научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2001, 2003), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на отчетных научно-практических конференциях кафедры Структурной биологии университета Вайцмана (Реховот, Израиль, 2000, 2001).
Публикации. По теме настоящей диссертации опубликованы 4 научные работы. Из них 1 - в центральной зарубежной печати, 2 представлены в сборнике тезисов докладов российских конференций и 1 - в сборнике тезисов о научно-практических результатах работы лабораторий синхротрона NSLS (США).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 14 рисунков, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, их результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Список литературы содержит 135 источников, из них 132 зарубежных.
Аминоацил-тРНК-синтетазы: краткий обзор функций
Биологический синтез белка в клетке протекает в два основных этапа. На первом - подготовительном - происходит «активация», аминоацилирование тРНК, в ходе которого аминокислота ковалентно связывается с молекулой родственной тРНК. Реакция эта катализируется соответствующим ферментом, одним из двадцати аминоацил-тРНК-синтетаз. В ходе второго этапа белкового синтеза аминокислоты из комплекса аминоацил-тРНК объединяются в полипептидную цепочку, высвобождая свободные тРНК. Этот процесс опосредуется структурными элементами клетки - рибосомами, и входящими в их состав белками и молекулами РНК. Ввиду того, что формирование полипептида происходит на основе последовательности матричной РНК, с которой взаимодействует антикодоновая петля тРНК, специфичность всего процесса синтеза белка почти полностью зависит от точности, с которой аминокислота присоединяется к родственной тРНК. Это - еще один довод в пользу важности изучения ферментов, катализирующих «активацию» тРНК, аминоацил-тРНК-синтетаз.
В настоящее время известно, что, помимо основной своей функции -аминоацилирования тРНК - aaRS участвуют в целом ряде других внутриклеточных процессов: биосинтезе гистидина; аминоацилировании фрагментов вирусной РНК, схожей с 3 -концом тРНК; сплайсинге митохондриальной РНК; регулировании трансляции и транскрипции. Аминоацил-тРНК-синтетазы могут также обладать цитокинной активностью, способностью связываться со специфическими последовательностями на ДНК. Даже ошибочное прохождение реакции аминоацилирования, как это описано ниже, может играть важную биологическую роль (см. обзор Martinis et al., 1999). К примеру, синтез человеческой триптофанил-тРНК-синтетазы индуцируется гамма-интерфероном, что может служить косвенным доказательством существования у этого фермента дополнительных функций, помимо участия в биосинтезе белка. Гамма-интерферон индуцирует синтез продукта альтернативного сплайсинга мРНК, «миниrpRS», в которой отсутствуют 47 N-терминальных аминокислотных остатка. Так как гамма-интерферон является специфическим индуктором экспрессии целого ряда регуляторов ангиогенеза (процесса формирования новых кровеносных сосудов), было высказано мнение о том, что «миниrpRS» может выполнять сходные функции, и последующие эксперименты подтвердили эту гипотезу (Otani et al., 2002). Действительно, было показано, что эта «усеченная» форма человеческой синтетазы TrpRS обладает дозозависимым ингибирующим действием на процесс ангиогенеза, и притом полностью неспособна к выполнению основной функции - аминоацилированию тРНКТгр (Wakasugi et al., 2002). Существование двух «альтернативных» форм одного фермента, выполняющих кардинально различные функции - в одном случае это участие в синтезе белка, а в другом - подавление формирования сосудов, возможно, является свидетельством участия триптофаниловой синтетазы в формировании апоптозного ответа (Ibba, 2002).
В течение довольно долгого времени считалось, что лишь немногие из аминоацил-тРНК-синтетаз участвуют в регуляции транскрипции (Putzer et al., 1995). Было показано, что в В. subtilis экспрессия ее aaRS регулируется «классическим» способом ингибирования терминации транскрипции, и основным регулятором выступает неаминоацилированная тРНК (Henkin, 1994; Condon et al., 1996). В то же время, в Е. сої і регулирование экспрессии кодирующих aaRS генов ведется широким набором разнообразных механизмов, и в некоторых случаях синтетазы принимают непосредственное участие в этом процессе. К примеру, треониновая синтетаза регулирует уровень собственной экспрессии на уровне трансляции, связываясь с двумя шпильками мРНК, структурно близкими к антикодоновой петле тРНК , с которыми синтетаза взаимодействует в ходе реакции аминоацилирования (Romby etal., 1996). Таким образом, ThrRS препятствует закреплению рибосомы на мРНК. В той же Е. coli аланиновая синтетаза связывается непосредственно с ДНК в районе палиндромной последовательности в районе промотера своего гена, alaS, и, как продемонстрировали опыты in vitro, ингибирует его транскрипцию (Putney & Schimmel, 1981). Специфическое связывание с ДНК было показано и для фенилаланин-тРНК-синтетазы из Th. thermophilic (Lechler & Kreutzer, 1998), хотя функциональное значение этого взаимодействия до сих пор остается невыясненным.
Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК
Каждая из двадцати синтетаз взаимодействует эффективно с собственной тРНК и неэффективно со всеми остальными тРНК. Помня о чрезвычайно высокой идентичности вторичной и третичной структур всех двадцати видов тРНК, присутствующих в клетке, становится особенно интересным и важным понять структурные основы сверхспецифического их узнавания и аминоацилирования, проводимого синтетазами (как уже упоминалось выше, специфичность катализируемой этими ферментами реакции столь высока, что 1 неверно присоединенная аминокислота приходится примерно на 10 000 корректных соединений). Понимание это зависит от ответа на два принципиальных вопроса: какие свойства «своей» тРНК распознает белок, и какие элементы белка участвуют в этом процессе?
Одним из наиболее удобных подходов к ответу на первый вопрос является создание искусственных мутантных тРНК и последующая оценка их активности в реакции аминоацилирования. Удобным решением стал сайт-направленный мутагенез, в ходе которого устанавливается минимальное число замен оснований, которое оказывается достаточным для изменения «личности» тРНК (Cusack S., 1993) и ошибочного распознавания ее синтетазой.
Как это было показано, в подавляющем большинстве случаев (17 из 20) узнавание тРНК-синтетазами происходит посредством антикодоновой петли (Cusack S., 1997), которая является основным элементом идентификации тРНК. При этом стоит заметить, что некоторые другие области структуры тРНК, например акцепторный стебель, также содержат дополнительные важные элементы, участвующие в узнавании (Saks et al., 1994). Значительно реже бывает, что антикодоновая петля вообще не является критической для процесса идентификации тРНК, как, например, в случаях SerRS и AlaRS (Cusack et al., 1997). Тогда на первое место выходят иные структурные элементы - вариабельная петля у TPHKSer или пара 3-Gua:Uri-70 в тРНК 3.
Сайт-направленный мутагенез также может быть использован для поиска и изучения областей самих аминоацил-тРНК-синтетаз, участвующих в контакте с тРНК. При этом контролем, демонстрирующим, что надлежащая пространственная структура не разрушена полностью, может служить сохранение остаточной активности в реакции аминоацилирования. Работы, проведенные на Е. coli и дрожжах (Cusack S., 1993), показывают, что в случае метиониновои синтетазы мутации в эквивалентных консервативных аминокислотных остатках (Asn391, Arg395 для Е. coli и Asn584, Arg588 для дрожжей) имеют сильнейший ингибирующий эффект на ход реакции как in vivo, так и in vitro, при этом не влияя на взаимодействие синтетазы с АТФ и метионином. Эти остатки расположены поблизости от С-терминального домена, т.е. довольно удаленно от активного сайта, также как и Тгр461 (Е. соїї), участвующий во взаимодействии с антикодоновой петлей тРНКМе1. Расстояние между Тгр461 и Arg395 в структуре MetRS из Е. coli составляет 20 А, однако, учитывая индуцированную связыванием аминокислоты перестройку белка и (или) антикодоновой петли, оба остатка аминокислот способны вступать во взаимодействие с тРНК.
В обоих классах синтетаз способность связывания тРНК обеспечивается РНК-связывающими модулями, которые, судя по их широкой структурной вариабельности, появились лишь на сравнительно поздних этапах эволюции. Анализ первичной и третичной структур этих белков показал, что подклассы синтетаз обладают гомологичными тРНК-связывающими модулями (Cusack S., 1995).
Фенилаланил-тРНК-синтетаза осуществляет узнавание тРНКр е по антикодоновому участку, однако в этом процессе не участвует классический олигонуклеотид-связывающий домен (Goldgur et al., 1997), как это происходит у большинства синтетаз II класса. Вместо этого, PheRS вовлекает в связывание тРНК рибонуклеопротеидный домен, таким образом представляя третий вариант связывания антикодоновой петли тРНК, присутствующий в синтетазах II класса. Кроме того, в отличие от остальных ферментов II класса, которые осуществляют взаимодействие с тРНК со стороны ее большого желобка (Cusack et al., 1996; Cavarelli et al., 1993), рибонуклеопротеидный домен PheRS приближается к антикодоновой петле со стороны малого желобка и, следовательно, связывание тРНК может происходить без искажения структуры самой петли.
Выделение и очистка фенилаланил-тРНК-синтетазы
Клетки отделяли центрифугированием; получившуюся биомассу хранили при -80 С. Выделение фенилаланил-тРНК-синтетазы из ТИ. thermophilus НВ8 проводили по Chernaya etal., 1987, с применением гель-фильтрации, ионообменной и гидрофобной хроматографии. Фермент обнаруживали в реакции аминоацилирования тРНК с использованием радиоактивно меченого фенилаланина (Phe [14C]) по следующей методике.
В приготовленную реакционную смесь (см. ниже) добавляли раствор PheRS. Реакцию останавливали переносом на фильтровальную бумагу, пропитанную трихлоруксусной кислотой ("Merck"). Непрореагировавшую аминокислоту затем удаляли, промывая бумагу последовательно в 5 % и 10 % растворах трихлоруксусной кислоты ("Merck"). Бумагу высушивали и помещали в сцинтилляторный раствор (1 часть толуола ("Frutarom") и 3 части сцинтиллятора LUMAX ("Lumac")). Радиоактивность измеряли на счетчике сцинтилляции TRI-CARB 1500 ("Packard"). Состав реакционной смеси: 50гпМ Tris-HCl рН 8,5 ("Merck") 9mMMgCl2 ("Merck") 5mM ATP ("Sigma") 10-5MPhe ("Sigma") 2 мг/мл суммарной тРНК из Е. coli
Полученный фермент (концентрация раствора ок. 16,2 мг/мл) хранили при -20 С в сохраняющем растворе следующего состава: 50mM Tris-HCl рН 8,5 ("Merck") 9mMMgC12("BDH") 25 % глицерин ("Frutarom")
Кристаллизация фенилаланил-тРНК-синтетазы
Предварительно белок диализовали при 4 С в течение ночи против кристаллизационного буфера: 20тМ Imidazole-HCl рН 7,8 ("BDH") 1тМ MgC12 ("Merck") lmMNaN3("BDH")
Раствор белка собирали и осаждали в течение 8 часов при 4 С в 80 % нас. сульфате аммония ("BDH"). Для отделения сохраняющего раствора от осевшего фермента центрифугировали 45 минут (-20 000 g, 4 С). Удаляли супернатант, белковый осадок растворяли в минимальном объеме кристаллизационного буфера и снова диализовали в течение ночи при 4 С против кристаллизационного буфера (см. выше) с 10 % сульфата аммония.
Собранный раствор центрифугировали (10 000 g, 4 С, 5 мин) для удаления микрочастиц. Раствор собирали в чистую пробирку.
Процедуру кристаллизации проводили методом «висячей капли», уравновешенной против 27 % (по насыщению) раствора сульфата аммония в кристаллизационном буфере, по Cheraaya etal., 1987. В качестве модификаций использовали также методы внесения микро- и макрозародышевых центров, подплавления кристаллов в 20 % растворе (NH4)2S04 и смены температурных условий (вынесения на комнатную температуру на несколько часов). Форму и размеры кристаллов оценивали визуально, под световым микроскопом с использованием набора поляризационных фильтров.
Для получения кристаллов функционального комплекса белка с промежуточным продуктом реакции - фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) -кристаллы фенилаланил-тРНК-синтетазы вымачивали в течение 30 минут в комплексообразующем растворе следующего состава: 20 mM Imidazole HCl (рН 7,8) ("BDH") 2,5тМ ATP ("Sigma") 2,5mM Phe ("Sigma") lmMNaN3("BDH") 2,5mMMnS04("BDH") 38 % нас. (NH4)2S04 ("Merck") Вымачивание проводили непосредственно перед помещением кристаллов в пучок рентгеновских лучей.
Выделение, очистка и кристаллизация гомогенного фермента
Как известно, стандартной методикой получения кристаллических белок-субстратных комплексов является вымачивание кристаллов нативного белка в растворе субстрата. Однако в случае фенилаланил-тРНК-синтетазы прямой подход оказывается непродуктивным. Основной проблемой в получении кристаллов функционального комплекса синтетазы с Phe-AMP является обязательная строгая необходимость присутствия в реакционной среде иона металла (Mg2+), стабилизирующего положение АТФ в активном центре. Но связывание иона магния в активном центре белка ингибируется сульфатом аммония, присутствующим в среде в качестве преципитанта, и понижение концентрации которого неизбежно привело бы к растворению кристаллов белка, а значит, и к невозможности собрать дифракционные данные. Ингибирование оказывается практически полным, что приводит к невозможности связывания АТФ и, следовательно, отсутствию образования комплекса (Reshtnikova et al., 1999). Несколько проведенных ранее попыток по замене преципитанта на различные органические агенты (MPD, PEG) оказались неудачными.
Ранее было показано, что SerRS и HisRS - кстати, также, как и PheRS, относящихся к синтетазам второго класса - проводят реакцию даже при 42 % сульфата аммония (по насыщению). Для кристаллов серил-тРНК-синтетазы замена в маточном буфере сульфата аммония на 56%-ный раствор цитрата натрия (Belrhali etal., 1995) приводила к тому, что первая стадия реакции аминоацилирования в присутствии Mg2+ успешно завершалась формированием в активном центре Ser-AMP, который ясно наблюдался на карте электронной плотности. Все эти данные ясно свидетельствуют о том, что анионы сульфата препятствуют эффективному связыванию катионов магния в районе активного сайта - возможно, размещаясь непосредственно в активном центре, они препятствуют взаимодействию белка с субстратом, таким образом уже на первой стадии ингибируя реакцию аминоацилирования. Это утверждение верно как минимум для нескольких синтетаз.
Для того чтобы убедиться, что марганец может эффективно заменять магний в реакции аминоацилирования, катализируемой PheRS из Th. thermophihis, исследовалась каталитическая активность фермента. Для этого измерялся уровень аминоацилирования тотальной tRNAphe, выделенной из Escherichia coli (по Ankilova etal., 1988), Ь-[14С]-фенилаланином в присутствии АТФ и марганца, а также магния в качестве контрольного варианта. Такая тРНК является эффективным субстратом для проведения реакции и синтетазами, выделенными из термофильных микроорганизмов (см., например, Goldgur et al., 1997). Результаты, приведенные на рисунке 6, демонстрируют, что фенилаланил-тРНК-синтетаза способна эффективно проводить аминоацилирование в присутствии ионов Мп Несмотря на более низкую, по сравнению с магнием, активность этих катионов, на ход реакции практически не влияет присутствие сульфата в реакционной смеси.
Показана зависимость скорости аминоацилирования тотальной тРНК из К coli фенилаланил-тРНК-синтетазой из Th. thermophilus, от природы катиона металла и присутствия в реакционной смеси сульфата аммония. Измерения проводились при 25+2 С по Ankilova et al., 1988. Состав реакционной смеси описан в разделе «Материалы и методы». А - 9mM MgCl2; А - 9тМ MgCl2, 35 % (нас.) (NH SC ; - 9тМ МпС12; 9тМ МпСЬ, 35 % (нас.) (NEUfcSO Таким образом, стало возможным проведение первого этапа реакции аминоацилирования на кристаллах PheRS. Успешное завершение этой реакции позволило получить функциональный комплекс PheRS-PheAMP в кристаллическом виде, и собрать рентгеноструктурные данные для установления его пространственной структуры.
Пространственная структура фенилаланил-тРНК-синтетазы в комплексе с продуктом первой стадии реакции аминоацилирования, фенилаланил-аденилатом, была установлена до разрешения 2.6 А. Разностная карта Фурье, построенная исходя из амплитуд и фаз, рассчитанных на основе уточненной модели нативного белка, ясно продемонстрировала область положительной электронной плотности, которая может быть отнесена к молекуле аденилата, Phe-AMP, связанной в активном сайте синтетазы (см. Рис. 7). Эти данные также дополнительно свидетельствуют о том, что PheRS проявляет функциональную активность в кристаллах и в присутствии Mn .
N-терминальная область а-субъединицы (домен АО, аминокислотные остатки 1-85), который при связывании тРНКр1їе формирует двухспиральную "coiled coil" структуру (Goldgur et al., 1997), практически полностью разупорядочен даже при криогенных условиях (100 К), в которых проводилась съемка. Эта область выглядит разупорядоченно и на карте электронной плотности, так же, как это было показано ранее для нативной PheRS при комнатной температуре (Mosyak etal., 1995). Таким образом, аминокислоты 1-85 были исключены из расчетной модели.
Средний В-фактор, рассчитанный для модели комплекса PheRS-Phe-АМР, составил примерно 45 А, тогда как для комплекса PheRS-Phe он достигал 69A (Reshetnikova etal., 1999). При этом большинство атомов с высокими значениями В-факторов расположены в домене В8 (З-субъединицы, поблизости от ее С-терминальной области, или входят в состав гибких петель (это, прежде всего, петли, включающие аминокислотные остатки 97-102, 599-602 и 676-691). Видимо, это стало причиной того, что пространственное положение аминокислот С-терминальной области Р-субъединицы (антикодон-связывающего домена В8) удалось установить однозначно и с высокой точностью. При этом боковые цепи шести терминальных аминокислот имели В-факторы более 95 А и на карте электронной плотности практически не наблюдались.
