Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы...;... 10
1.1. Цитоскелет немышечных клеток и его связь с плазматической мембраной . 10
1.1.1. Микротрубочки . Ю
1.1.2. Актиновые микрофиламенты . II
1.1.3. Промежуточные микрофиламенты . 12
1.1.4. Микротрабекулы 13
1.1.5. Связь цитоскелета с двигательной активностью немышечных клеток . 14
1.1.6. Связь микрофиламентов и актина с плазматической мембраной 16
1.1.7. Взаимодействие микрофиламентов и микротрубочек 18
1.1.8. Связь микротрубочек с мембраной 19
1.2. Перераспределение поверхно ганд-рецепторных комплексов и связь этого' -процесса с цитоскелетом . 20
1.2.1. Индукция перераспределения 20
1.2.2. Первая стадия (первый тип) перераспределения 23
1.2.3. Вторая стадия (второй тип) перераспределения -
- формирование "шапочек11 ; . 25
1.2.4. Роль микрофиламентов в процессе формирования "шапочек" 31
1.2.5. Роль микротрубочек в процессе формирования "шапочек" 35
1.2.6. Перераспределение поверхностных лиганд-рецепторных комплексов у культивируемых клеток 37
1.2.7. Возможные механизмы и биологическая роль поляраного движения лиганд-рецепторных комплексов 42
Задачи исследования.. 45
Материалы и методы 47
11.1. Обьеш исследования .47
11.1.1. Клетки культивируемых линий 47
11.1.2. Нормальные лимфоциты мыши и человека 48
11.2. Специфические лигандо и антисыворотки 49
11.2.1. Антитела к поверхностным антигенам 49
11.2.2. Конканавалин А 50
11.2.3. Антиконканавалиновая сыворотка 50
1172.1. Люминесцирующая сыворотка 51
11.2.1. Антитела к актину 51
11.3. Обработка клеток лигандами 51
11.3.1. Обработка клеток антителами к поверхностным антигенам 51
11.3.2. Обработка клеток конканавалином А 52
11.3.3. Обработка лигандами клеток, распластанных
на субстрате 53
11.4. Обработка клеток агентами разрушающими структуры цитоскелета 53
11.5. Получение синхронных популяций клеток LS и LSM 54 II.5.1. Определение времени генерации и фаз клеточного цикла . 56
11.6. Метол ультраструктурного и биохимического анализа 58
11.6.1. Выявление актиновых микрофиламентов в клетках методой непрямой иммунофлуоресцевции 58
11.6.2. Глицеринизация и обработка клеток тяжелым меромиозином 59
11.6.3. Фиксация клеток для электронной микроскопии. 60
П.6Л. Выделение и биохимический анализ мембранных фракций лимфоцитов и культивируемых клеток. 61
ІІ.7. Статистическая обработка результатов 62
Результаты. 63
III.I. Перераспределение поверхностных лйгандя рецептор-ных комплексов у нормальных лимфоцитов и у клеток культивируемых линий 63
111.1.1. Нормальные лимфоциты 63
111.1.2. Клетки культивируемых линий 67
111.1.3. Влияние агентов, связывающих между собой лиганд-рецепторные комплексы на их перераспределение 73
III.IЛ. Зависимость процесса образования "шапочек" от метаболизма клеток 75
111.1.5. Влияние кондиционированной среды на процесс формирования "шапочек" 77
111.1.6. Перераспределение лиганд-рецепторных комплексов у клеток с различным типом роста 80
111.1.7. Зависимость перераспределения лиганд-рецепторных комплексов у клеток bS и LSM от
фазы цикла 85
111.1.8. Образование "шапочек" у клеток с различной степенью дифференцировки 104
ІІІЛ.9. Деградация сформировавшихся "шапочек" у клеток различного происхождения 106
Ш.2. Состояние цитоскелета и перераспределение лиганд-рецепторных комплексов 115
111.2.1. Организация актина в клетках ЬБМИ L929 П5
111.2.2. Влияние цитохалазина Б на процесс перераспределения лиганд-рецепторных комплексов 116
111.2.3. Влияние винбластина на процесс перераспределения лиганд-рецепторных комплексов 121
111.2.4. Действие цитохалазина Б и винбластина на процесс деградации "шапочек" 128
Ш72.5. Ультраструктура клеток после обработки их
лигандами 131
III.2.6. Биохимический анализ мембранных фракций,
выделенных из клеток с "шапочками" 150
ІУ. Обсуждение результатов... 159
Заключение... .179
Выводы. 182
Список основной использован
Ной литературы
- Промежуточные микрофиламенты
- Возможные механизмы и биологическая роль поляраного движения лиганд-рецепторных комплексов
- Зависимость процесса образования "шапочек" от метаболизма клеток
- Влияние винбластина на процесс перераспределения лиганд-рецепторных комплексов
Промежуточные микрофиламенты
Актиновые микрофиламенты представляют собой двойную спираль, построенную из мономеров глобулярного белка актина с молекулярной массой. 42 кД. Полимеризация, актина или превращение глобулярного актина (Г-актина) в фибриллярный (Ф-актин), индуцируется ионами М или К ", требует присутствия Са " и сопровождается гидролизом АТФ ( Когп ,1981). С помощью метода, основанного на специфическом эквимолярном связывании ДНК-азы I с глобулярным актином, установлено, что в немышечных клетках содержится значительное количество неполимеризованного актина, составляющего от 50$ до 80$ всего актина, в зависимости от типа клетки ( Blik-stad et.al.,I978). Актин мало видоспецифичен,и антитела, полученные к актину одного вида, с успехом применяются для иммунофлуо-ресцентной визуализации актиносодержащих микрофиламентов в клетках самых разных видов животных ( Lazarides and Weber ,1974). Вместе с тем, актин представлен изоформами, различающимися по первичной структуре и специфичными для разных клеток ( Vande-kerckhove and Weber ,1979). При изоэлектрическом; фокусировании изоформы актина занимают положения, соответствующие их изоэлект-рической. точке, согласно которой их подразделяют на , Я и У4--актины. Мышечные клетки позвоночных содержат, в основном, ог А -форму, а немышечные клетки характеризуются присутствием и J -изоформ, ( Кога ,1978). Соотношение сС 3 и // -изо-форм. в немышечных клетках.разных видов варьирует и может, в частности, отличаться у нормальных и трансформированных клеток ( beavrbt et. ai. ,1980). В организации актиновых. микрофиламентов большую роль играют тропомиозин и оС -актинин, которые связаны с определенными участками микрофиламентной сети и, по-видимому, принимают непосредственное участие, в ее формировании и динамических перестройках (Lazarides ,1976). Имеется также весьма гетерогенная группа актинсвязывающих. белков., веделенных из разных клеток и принимающих, по-видимому, участие в образовании пучков микрофиламентов и трехмерной сети цитоскелета. Для некоторых из них показано участие в. образовании пучков микрофиламентов. и трехмерной сети з немышечных клетках ( Шііпеу ,1975; De Rosier and Edds ,1980).
К промежуточным микрофиламентам относят группу филаментов, различающихся по биохимическому составу, но близких по диаметру (около IQ нм). Поскольку они обладают диаметром, промежуточным между актиновыми микрофиламентами (6 нм) и микротрубочками (22 нм), эти филаменты получили название промежуточных. В последнее время выделяют 5 основных классов, промежуточных филаментов. Это: (I) тонофиламенты, которые находят в клетках эпителиального происхождения (М.в. субъединичного белка 40-60 кД); (2) десминовые (или скелетиновые) филаменты, которые в основном локализуются в гладких, сердечных и скелетных мышцах (м.в. субъединиц 50 кД); (3) виметиновые (или декаминовые) филаменты, найденные в клетках мезенхимного происхождения (м.в. субъединиц 57 кД); (4) ней-рофиламенты, обнаруженные в клетках нейронального происхождения (субъединицы с м.в. 68 кД, 150 ,;кД и 200 кД); (5) глиальные филаменты, локализующиеся в глиальных клетках (м.в. субъединиц 51 кД) ( Lazarides ,1980). Показано, что во многих случаях данный тип клеток содержит в дополнение к характерным для него фи-ламентам, второй тип промежуточных филаментов; ( Franke et.al., 1980; Lazarides ,1981). Биохимический, состав: этих филаментов, особенности их формирования in vivo , а также их биологическая роль еще мало изучены. В последние годы промежуточные филаменты широко изучаются в связи с явлениями тканевой и клеточной диффе-ренцировки ( Franke et. al. ,1982; Osborn et. al.,I982).
Возможные механизмы и биологическая роль поляраного движения лиганд-рецепторных комплексов
Анализа данных литературы приводит нас к выводу о том, что явление перераспределения лиганд-рецепторных комплексов на поверхности клеток с образованием "шапочек" может с большим, основанием считаться одним лз проявлений немышечной подвижности. Как и большинство других проявлений двигательной активности немышечного типа, это явление также связано с деятельностью сократительных систем, клетки актин-миозинового типа, чему имеется уже достаточно большое количество подтверждений. Данные о связывании поверхностных антигенов и рецепторов с внутриклеточными актиносодержащими структурами в процессе взаимодействия со специфическими лигандами, заставляют по-новому подходить к оценке активной, роли цитоскелата в процессах межклеточных взаимодействий., гормональной регуляции и дифференцировки, а также в иммунологических процессах.
Несмотря на обилие данных о процессах перераспределения лиганд-рецепторных комплексов, полученных в последние; годы, самые основные вопросы ждут еще своего разрешения. Одним из них. является, по-видимому, вопрос о механизме связывания лиганд-рецепторных комплексов со структурами цитоскелета. До сих пор неясно, в частности, связываются ли поверхностные макромолекулы с микрофиламентами только после взаимодействия с лигандами, или же они связаны с ними исходно. Очень мало пока данных и о том., какие белки могут принимать участие в этом связывании.
Для решения, этих вопросов необходим биохимические и ультра структурные исследования. Традиционный объект изучения, на котором получено большинство из имеющихся данных о перераспределении лиганд-рецепторных комплексов - это нормальные лимфоциты. Лимфоциты - очень мелкие клетки и их сложно получать в количествах, достаточных для биохимических исследований. Кроме того, лимфоциты являются очень гетерогенной популяцией, содержащей, много разных типов клеток, что может служить причиной получения противоречивых результатов-. Хорошим, объектом для такого рода исследовании, могут быть перевиваемые клетки, которые можно поддерживать неограниченно долго в культуре и наращивать в больших количествах. По сравнению с лимфоцитами они являются более гомогенными и в биохимическом плане. Однако, данные литературы о способности, перевиваемых клеток различного происхождения к активному перераспределению поверхностных: лиганд-рецепторных комплексов неполны и зачастую противоречивы. Исходя из этого в настоящей, работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать способность клеток перевиваемых линий различного происхождения к перераспределению поверхностных лиганд-рецепторных комплексов и формированию "шапочек". Разработать оптимальные методы обработки клеток, лигандами для максимальной индукции перераспределения лиганд-рецепторных комплексов с целью дальнейших биохимических исследований, этого явления.
2. Изучить зависимость процесса перераспределения лиганд-рецепторных комплексов, у клеток перевиваемых линий, от условий культивирования, типа роста (в виде монослоя или в виде суспензии) и фазы клеточного цикла.
3. Исследовать связь цитоскелета с перераспределением лиганд-рецепторных: комплексов, у клеток перевиваемых линий. Использовать методы ультраструктурного и биохимического анализа для выяснения динамических аспектов участия цитоскелета в перераспределении лиганд-рецепторных комплексов.
В работе использовали перевиваемые линии различного тканевого происхождения: лимфойдного происхождения - плазмацитомы мыши РЗ/NS I/I-Ag 4-І и PSX63; гибридомы мыши Sp2/0 и Т-лимфо-ма мыши PW -5147; эритроидного происхождения - эритролейкемии мыши М-2 и человека К-562; фибробластного происхождения - суспензионная линия мышиных фибробластов LS и монослойная линия L929; эпителиального происхождения - эпителоидная карцинома шейки матки человека НеЬа.
Кроме перечисленных в работе использовали также и некоторые другие линии клеток: (I) сублиния мышиных фибробластов. LSM , полученная в Отделе клеточных, культур Е.Г.Семеновой из суспензионной линии LS , путем селекции клеток по признаку адгезивнос-ти к субстрату (Семенова Е.Г. и др.,1981); (2) клоны клеток-гиб-ридом. продуцентов (EJJ) И непродуцентов (EjO антител к бараньим эритроцитам., полученные в отделе клеточных культур Й.И.Фридлянс-кой. путем, слияния клеток плазмацитомы мыши P3/HS1/1-Ag4/l с лимфоцитами иа. селезенок мышей, иммунизированных эритроцитами барана.
Все исходные клеточные линии были получены из коллекции клеточных культур института цитологии АН СССР .
Клетки линий лимфоидного и эритроидного происхождения поддерживали на средах РМШ илж EPMI с добавлением 10$ эмбриональной телячьей, сыворотки, а клетки фибробластного и эпителиального происхождения- - на среде Игла с добавлением 15% сыворотки крупного рогатого скота. Все клеточные линии культивировали во флаконах: Карреля, объемом 100 мл в виде моносдоя (линии Ь д2д LSM и HeLa) или в виде суспензии (все остальные клеточные ли ).
В опытах, по перераспределению лиганд-рецепторных комплексов использовали суспензионные культуры с плотностью 0,8-1,6x10 клеток/мл среды, а монослойные - после образования плотного моносдоя. Клетки, культивируемые в виде монослоя, снимали с подложки путем обработки их. раствором, вереєна в течение 5-Ю минут и затем суспендировали в свежей среде Игла.
Зависимость процесса образования "шапочек" от метаболизма клеток
Для визуального наблюдения лиганд-рецепторных комплексов на поверхности клеток использовали метод непрямой иммунофлуо-ресценции (Weller and Coons ,1954). После связывания конканава-лина А или антител с поверхностью клеток и удаления несвязав-шихся лигандов, клетки обрабатывали антиконканавалиновой и затем люминесцирующей (в случае конканавалина А, в качестве ли-ганда) или только люминесцирующей сыворотками (в случае антили-мфоцитарных сывороток в качестве лигандов). Антитела антиконканавалиновой и люминесцирующей сывороток связывают между собой молекулы конканавалина А и таким образом повышают степень склеенности рецепторов этого лиганда. Точно также, лгоминесциру-ющая сыворотка, связанная между собой антитела антилимфоцитар-ной сыворотки увеличивает степень перекрестного связывания соответствующих антигенных молекул. Поскольку, по данным литературы повышение степени склеенности поверхностных рецепторов облегчает или стимулирует перераспределение лиганд-рецепторных комплексов (De Petris , 1978), предоставлялось необходимым оценить, - какой вклад в стимуляцию перераспределения в наших опытах вносят лиганды в последующие антисыворотки. Для этого клетки фиксировали на разных стадиях обработки их лигандами с помощью !-% формальдегида.
а) Фиксация клеток до обработки лигандами. Если клетки сначала фиксировали, а затем обрабатывали лигандами, то свечение поверхности как у лимфоцитов, так и у клеток культивируемых линий было равномерным (Рис.9).
б) Фиксация клеток после связывания лигандов. Клетки ин кубировали с лигандами, отмывали и инкубировали 60 минут при 37С, а затем фиксировали и обрабатывали последующими антисыво ротками. При этом у клеток культивируемых линий (практически у всех) свечение имело вид мелких пятнышек, равномерно распределенных по поверхности. У лимфоцитов при этом наблюдали 5-10$ клеток с "шапочками".
в) Фиксация клеток после связывания лигандов и первых ан тисывороток. Клетки последовательно инкубировали на холоду с лигандами и" первыми антисыворотками, отмывали и инкубировали в среде при 37С в течение 60 минут, после чего фиксировали и обрабатывали второй антисывороткой (в случае конканавалина А).
При этом: у клеток культивируемых линий в случае конканавалина А наблюдали мелкие и крупные светящиеся пятна, беспорядочно разбросанные на поверхности, а в случае антилимфоцитар-ной сыворотки -1-10$ клеток с "шапочками", как было показано ранее (таблица 2). У лимфоцитов в случае конканавалина А наблюдали "шапочки" у 20-30$ клеток, а в случае антимышиной сыворотки - у 50-60% клеток как и ранее (таблица I).
Контролем этой серии опытов (3-4 опыта с каждым типом клеток) служили клетки, обработанные лигандами и зафиксированные после прогрева в течение 60 минут при 37С в среде. У этих клеток наблюдали те же характер и степень перераспределения лиганд-рецепторных комплексов, что было зарегистрировано ранее (таблицы I и 2).
Таким образом, в этой серии опытов было обнаружено, что у лимфоцитов связывание лигандов индуцирует формирование "шапочек" у небольшого числа клеток t5-I0%). У клеток же культивируемых линий индукция образования "шапочек" происходит только только при максимально возможной степени склеенности лиганд-рецепторных комплексов антителами последующих антисывороток. Однако и при таких условиях, формирование "шапочек" происходит лишь у небольшой части клеток в популяции (1-10$), тогда как у лимфоцитов при этом половина и более клеток образуют "шапочки" (таблицы I и 2).
Поскольку у культивируемых клеток процесс формирования "шапочек" был очень слабо выражен, по сравнению с лимфоцитами, необходимо было установить, являются ли регистрируемые у разных типов клеток "шапочки" результатом активного клеточного процесса, зависящего от метаболизма, как было показано для лимфоцитов многими авторами ( De Petris,I978).
Для снижения уровня метаболизма клеток использовали действие низкой температуры и азида натрия.
Температура. Клетки инкубировали с лигандами и последующими антисыворотками при 0-4С, отмывали холодной средой и инкубировали в среде с такой же температурой, а затем фиксировали.
У клеток культивируемых линий в таких условиях формирования "шапочек" не происходило и свечение поверхности было равномерным (Рис. Ю).
У лимфоцитов при этом доля клеток с "шапочкой" варьировала в пределах 10-30%, а у остальных клеток наблюдали крупные светящиеся пятна на поверхности.
Азид натрия. Клетки обрабатывали лигандами по стандартной схеме в присутствии 20 мМ азида натрия.
Влияние винбластина на процесс перераспределения лиганд-рецепторных комплексов
Винбластин, в отличие от цитохалазина Б практически не подавлял образования "шапочек" у клеток культивируемых линий лимфоидного происхождения и у нормальных лимфоцитов. Доля клеток, формирующих "шапочки" в присутствии винбластина слегка возрастала у нормальных лимфоцитов из тимуса и лимфоузлов мыши при обработке их антимышиной сывороткой, а также у лимфоцитов из лимфоузлов, при обработке конканавалином А (табл.7). Морфология лимфоцитов и клеток культивируемых линий лимфоидного происхождения изменялась в присутствии винбластина сходным образом. В основном изменения морфологии регистрировали у клеток, формирующих "шапочки". На их поверхности возникали выпячивания или выросты, на которых образовывались "шапочки". По форме, образующиеся выросты часто напоминали так называемые "уроподы", которые были описаны у нормальных лимфоцитов как в обычном состоянии, так и после обработки их винбластином, когда количество уропод резко возрастало. У лимфоцитов и культивируемых клеток лимфоидного происхождения "шапочки", локализованные на таких выростах почти совсем отшнуровывались от клетки, а при более длительной инкубации с винбластином обнаруживались в среде отдельно от клеток (Рис.60).
Совершенно иные результаты были получены при инкубации с винбластином фибробластов LS. Оказалось, что у этих клеток винбластин резко снижает долго клеток, образующих "шапочки", независимо от того, каким лигандом они были индуцированы. При этом снижение доли клеток, формирующих "шапочки" в присутствии винбластина было в 2 раза больше, чем в присутствии цитохалазина Б (табл.6,7; рис.61). Морфология клеток LS при инкубации с винбластином практически не изменялась, а диффузный характер свечения клеток указывал на то, что в этих условиях мо жет происходить эндоцитоз лиганд-рецепторных комплексов. У клеток LSMH Lg29» распластанных на субстрате и обработанных лигандами в присутствии винбластина (1,0 мкг/мл) ли-ганд-рецепторные комплексы имели вид мелких светящихся пятнышек равномерно разбросанных по всей поверхности клеток и отростков (Рис.62).
Полученные результаты свидетельствуют о выраженных различиях в чувствительности процесса формирования "шапочек" у клеток фибробластов LS и LSM и у клеток лимфоидного происхождения к действию агентов, разрушающих микротрубочки. Это позволяет полагать, что клетки фибробластного и, возможно, эпителиального происхождения по каким-то особенностям организации цито-скелета отличаются от клеток лимфоидного происхождения. Для проверки этого предположения аналогичные опыты были проделаны на клетках HeLa . Эти клетки снимали с поверхности с помощью версена и обрабатывали в суспензии лигандами в присутствии ци-тохалазина Б или винбластина. В отсутствие этих агентов около 40-50$ клеток HeLa формировали полярные скопления лиганд-рецепторных комплексов по типу "шапочек". Однако, в отличие от других типов клеток, у клеток HeLa полярная концентрация свечения имела диффузный характер, что свидетельствует о внутриклеточной локализации лиганд-рецепторных комплексов в результате эндоцитоза ( De Petris ,1978) (Рис.63). Присутствие в среде винбластина полностью блокировало полярную концентрацию лиганд-рецепторных комплексов и свечение в этом случае имело вид мелких пятнышек, равномерно разбросанных по поверхности, также как это наблюдали у клеток LS . (Рис.64). В отличие от фибробластов LS , клетки HeLa оказались очень чувствительными к действию цитохалазина Б. Даже в концентрации I мкг/мл этот агент оказывал мощное действие на морфологию клеток. При этом наблюдали образование большого количества пузырей на поверхности, а свечение было распределено равномерно и лишь у 5-10% клеток наблюдали полярное смещение свечения на одну сторону клетки. В этих случаях часто (примерно у 10% таких клеток) регистрировали совпадение.участков полярной концентрации свечения с зоной, где происходило образование пузырей. Любопытно, что сами пузыри при этом никогда не светились (Рис.65). Все эти явления наблюдали при использовании обоих лигандов.
Таким образом, результаты данной серии опытов говорят о том, что клетки фибробластного и эпителиального происхождения резко отличаются от клеток лимфоидного происхождения по чувствительности процесса формирования "шапочек" к агентам, разрушающим микротрубочки.
В литературе имеются данные о том, что "шапочки" у нормальных лимфоцитов могут быть разрушены цитохалазином Б ( De Petris, 1974). Учитывая полученные выше результаты, представлялось необходимым сравнить действие цитохалазина Б и винбластина на "шапочки", сформированные в их отсутствие у клеток различного происхождения.
