Содержание к диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 3. СИСТЕМАТИКА И БИОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ РОДА
ARTHROASCUS 49
ЭКСПЕРИМЕНТАЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 54
Молекулярный полиморфизм естественных популяций К. pratensis.... 104
Введение к работе
Традиционно в систематике дрожжей используются морфологические и физиологические признаки, в частности способность утилизировать различные источники углерода и азота. Однако эти признаки обладают значительной изменчивостью, и нельзя с полной достоверностью только на основании стандартных физиологических тестов относить исследуемый штамм к тому или иному виду. На основе физиолого-морфологических характеристик ранее неоднократно делались попытки построить филогенетические схемы, но они, как правило, не отражали действительного родства дрожжей.
В 70-е годы прошлого века в систематике дрожжей стали применяться генетические методы и принципы. Биологическая концепция вида, разработанная на высших эукариотах (растениях и животных) была успешно применена к дрожжам, имеющим половой процесс. Было показано, что генофонд дрожжей дискретен и представлен репродуктивно изолированными биологическими видами (Naumov, 1987). Гомогенные роды включают виды, способные скрещиваться, но образующиеся гибриды стерильны. Генетический анализ позволяет экспериментально определять принадлежность дрожжей к определенному роду и виду. Для этого изучают скрещиваемость, жизнеспособность полового потомства (аскоспор гибридов) с тест-штаммами различных биологических видов и возможность обмена генами - рекомбинацию контрольных ауксотрофных маркеров. Генетические принципы и методы были использованы в систематике дрожжей родов Saccharomyces, Williopsis, Zygowilliopsis, Arthroascus и Zygofabospora (Наумов и др., 1985а,б; Наумов, 1986, 1987; Naumov, 1987). Однако отсутствие споруляции или низкая жизнеспособность спор анализируемых дрожжей ограничивают использование генетического метода.
В настоящее время таксономисты пытаются построить такую классификацию, которая бы отражала генетическое родство между видами и родами дрожжей. Для этого используются новые молекулярные методы, основанные на сравнении последовательностей рибосомальных генов (5S, 18S, 26S). Создана компьютерная база данных последовательностей D1/D2 района 26S рРНК для практически всех известных аскомицетовых дрожжей (Kurtzman, Robnett, 1998). Филогенетическая концепция вида позволяет проводить дифференциацию дрожжей вне зависимости от наличия у них полового процесса. Следует отметить, что секвенирование генов рРНК в основном проводится на типовых культурах и этот метод не применим для идентификации большого количества штаммов, например в экологических исследованиях, когда анализируются десятки и даже сотни штаммов. В этой связи, актуальным является использование молекулярных методов, дающих быструю и достоверную идентификацию большого количества штаммов. Одним из таких методов, успешно используемых в настоящее время в таксономии дрожжей, является полимеразная цепная реакция (PCR/ПЦР) с неспецифическими праймерами, имеющими случайную нуклеотидную последовательность: RAPD-PCR (случайно амплифицированная полиморфная ДНК), AP-PCR (ПЦР с произвольными праймерами) и УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) (Булат, Мироненко, 1996). Для классификации дрожжей используются другие молекулярные методы: определение мол. % ГЦ (Kurtzman, Fell, 1998), молекулярное кариотипирование (Boekhout et al., 1993), изоферментный анализ (Yamazaki et al., 1983; Kurtzman, Fell, 1998).
Систематическое положение группы почвенных дрожжей с сатурновидными аскоспорами подвергается частым ревизиям: пересматривается их родовой и видовой статус. Их помещали в разных родах: Williopisis, Hansenula, Pichia, Waltiozyma, Zygohansenula, Zygowilliopsis, Endomycopsis. Род Williopsis был описан Zender еще в 1925 году на основании способности к образованию сатурновидных спор и ассимиляции нитратов. Последний признак впоследствии стал основным для ревизии родов Hansenula и Pichia (Stelling-Dekker, 1931). В род Hansenula включали и виды Williopsis (Lodder, 1970; Kreger-van Rij, 1984). В 1977 году von Агх восстановил род Williopsis. Данные генетического гибридологического анализа доказали справедливость этой ревизии (Наумов, 1987). В новом определителе дрожжей (Kurtzman, 1998) в род Williopsis включены виды: W saturnus с пятью с разновидностями (var. saturnus, var mrakii, var. sargentensis, var. suaveolens, var. subsufficiens), W. californica, W. mucosa, W. salicorniae, W. pratensis. Род Williopsis генетически очень гетерогенен. Четыре вида, W. mucosa, W. salicorniae, W. pratensis и W. californica, имеющие сатурновидные споры в то же время значительно отличаются по последовательностям генов 26S и 18S рРНК друг от друга, а также от типового вида рода - W. saturnus (Liu, Kurtzman 1991; Yamada et al., 1994, 1995; James et al., 1998) и, очевидно, представляют собой различные роды. Неоднозначным является и систематическое положение дрожжей комплекса W. saturnus. Генетическим анализом было дифференцировано пять видов-двойников: W. saturnus, W. beijerinckii, W. mrakii, W. suaveolens и W. subsufficiens (Вустин, 1981; Вустин и др., 1982; Вустин, Наумов, 1984; Наумов и др., 1981, 19856). В дальнейшем к ним был добавлен вид W. sargentensis (Наумов, 1987). Однако генетическая классификация была пересмотрена (Kurtzman, 1998). Указанные виды-двойники имеют гомологию геномов 36-72% (Kurtzman, 1991) и идентичные последовательности генов рибосомальной РНК (Yamada et al., 1994; James et al., 1998). В последнем определителе дрожжей (Kurtzman, 1998) виды рода Williopsis sensu stricto, вопреки общепринятому стандарту видовой шкалы ДНК-ДНК реассоциации, классифицируются как разновидности.
Следует отметить, что генетический и филогенетический анализы проводились на ограниченном количестве штаммов, в основном на типовых культурах. Молекулярные методы, позволяющие анализировать большое количество штаммов, такие как ПЦР анализ и молекулярное кариотипирование, на дрожжах с сатурновидными спорами ранее не применялись.
Цель настоящей работы - разработка молекулярно-генетических основ классификации и идентификации дрожжей с сатурновидными спорами.
Обзор литературы посвящен методам, используемым в современной систематике дрожжей и систематическому положению дрожжей с сатурновидными спорами.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СИСТЕМАТИКЕ
ДРОЖЖЕЙ
1.1. Традиционная систематика, основанная на морфологических, физиологических и биохимических характеристиках
Дрожжи - одноклеточные грибы, размножающиеся почкованием или делением. В таксономическом отношении они представляют собой гетерогенную группу, что проявляется в разнообразии морфологических признаков, способах бесполого размножения, особенностях полового процесса, физиологических характеристиках и др. Несмотря на развитие новых молекулярных методов в систематике дрожжей, морфологические, биохимические и физиологические характеристики по-прежнему имеют большое таксономическое значение (Kurtzman, Fell, 1998).
Идентификация и описание любого таксона дрожжей в первую очередь основывается на морфологических признаках. Они включают в себя морфологию вегетативных клеток и особенности бесполого размножения (форма, размер, структура клеток, наличие капсул, почкование или деление, образование истинного или ложного мицелия, наличие баллистоспор, хламидоспор, эндоспор и др.), характеристики полового процесса (разные способы конъюгации дрожжей, морфология зигот, асков, аскоспор, базидий и др.). Для описания морфологических признаков дрожжей и дрожжеподобных грибов используются стандартные среды и условия культивирования (Yarrow, 1998). Некоторые морфологические признаки имеют высокую таксономическую ценность, позволяя определять принадлежность дрожжей к аскомицетам или базидиомицетам, а также к конкретным родам. Например, треугольные клетки образуются у Trigonopsis, бутылковидные - у Malassezia, лимоновидные - у Hanseniaspora и Wickerhamia (Kurtzman, Fell, 1998). Голобластический тип почкования характерен для аскомицетовых дрожжей, а энтеробластический - для базидиомицетовых (Boekhout, Kurtzman, 1996).
