Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В условиях сохраняющейся неблагоприятной эпидемиологической ситуации по туберкулезу заболеваемость костным туберкулезом детей и взрослых остается высокой. Среди внелегочных локализаций у взрослых туберкулез костей составляет треть, что сопровождается высокой частотой (до 85%) инвалидизации пациентов. Туберкулезное поражение костей практически всегда протекает с осложнениями вследствие поздней диагностики заболевания, что связано с трудностями бактериологической и гистологической верификации (Руководство по легочному и внелегочному туберкулезу. Под. ред. член-корр. РАМН, проф. Ю.Н. Левашова, проф. Ю.М. Репина. С-Пб.: ЭЛБИ, 2008. 544 с).
Внелегочный, в том числе, костный туберкулез характеризуется
олигобациллярностью, что значительно затрудняет этиологическую диагностику.
При этом такая важная характеристика возбудителя, как лекарственная
устойчивость, остается не выявленной (Журавлев В.Ю. и соавт. Технологии «ТБ-
Биочип» в верификации диагноза туберкулезного спондилита. Проблемы
туберкулеза и болезни легких. 2011. №4. С. 144-145). Гистологическое
исследование биопсийного материала больных костным туберкулезом при
малоактивной фазе туберкулезного воспаления иногда не позволяет достоверно
подтвердить этиологию процесса вследствие слабой выраженности
морфологических признаков. В сложившейся ситуации актуальной проблемой
диагностики костного туберкулеза является быстрое и достоверное обнаружение
возбудителя и определение его лекарственной устойчивости, с целью подбора
эффективного режима химиотерапии. Однако в большинстве
противотуберкулезных учреждений этиологическая диагностика туберкулезного поражения костей осуществляется методом посева диагностического материала на плотные питательные среды, дающим ответ не ранее чем через 5-8 недель (Zhuravlev V. et al. Actual technologies in etiologic diagnostics of tuberculous spondylitis (TS). Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2011. Vol. 15, № 11. P. 269).
В Свердловской области в течение последнего десятилетия отмечено увеличение заболеваемости детей костным туберкулезом. Подобная ситуация наблюдается и в других регионах России. По мнению ряда авторов, участившиеся случаи костного туберкулеза у детей являются БЦЖ-оститом (Аксенова В.А. и соавт. БЦЖ-оститы у детей: эпидемиологические показатели некоторых регионов Российской Федерации. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. №1. С. 9-12).
Проблема диагностики БЦЖюстита до настоящего времени остается окончательно не решенной в связи с особенностями течения данного процесса и трудностями выявления и идентификации вакцинного штамма, что может приводить к ошибочному диагнозу костного туберкулеза. Постановка клинического диагноза БЦЖ-остита и его верификация крайне важна с учетом юридических и социальных аспектов данной проблемы. Дифференцирование М. bovis с другими видами М. tuberculosis complex (МТС) культуральным методом не позволяет достоверно идентифицировать вакцинный штамм (Talbot Е. A. PCR Identification of Mycobacterium bovis BCG. Clin. Microbiol. 1997. №3. Vol. 135. P. 566-569). Ведущая роль ПЦР-диагностики в верификации БЦЖ-остита признается не всеми отечественными специалистами. Молекулярно-генетические методы диагностики дают возможность в короткие сроки проводить достоверную этиологическую верификацию туберкулезного
поражения костей, однако в настоящее время они практически отсутствуют в арсенале лабораторий противотуберкулезных учреждений даже регионального уровня.
В связи с вышесказанным, изучение возможностей молекулярно-генетических методов этиологической диагностики костного туберкулеза у взрослых и детей представляется весьма актуальным.
Цель исследования: совершенствование этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования.
Задачи исследования
-
Дать краткую клинико-эпидемиологическую характеристику туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей и провести этиологическую верификацию туберкулезного спондилита и остита бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования в различные морфологические фазы активности процесса.
-
Провести сравнительный анализ результатов бактериологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей, оценить эффективность применения метода полимеразной цепной реакции для верификации туберкулезного поражения костей в различные морфологические фазы активности процесса, показать различия видовой принадлежности изолятов микобактерий, выделенных у пациентов сравниваемых групп.
-
Апробировать и внедрить методику выделения нуклеиновых кислот микобактерий из материала костных деструкции, залитого в парафин.
-
Разработать алгоритмы этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей.
Методология и методы исследования
В работе применен комплекс морфологических, микробиологических и современных молекулярно-генетических методов исследования при туберкулезном спондилите у взрослых и остите у детей.
Исследование проведено в соответствии с основными принципами доказательной медицины и одобрено Комитетом по этике ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, протокол № 6 от 12.09.2012 г.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном количестве наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования с использованием программ: BioStat 2009 Professional 5.8.4.3, Microsoft Excel 2007.
Для оценки статистической значимости рассчитывали показатели непараметрической статистики: критерий «хи-квадрат» для значений более либо равных 5, точный критерий Фишера для значений менее 5. Выборочная средняя (средняя арифметическая) и стандартное отклонение (SD) представлены как M±s, различия считали значимыми при р<0,05. Различающие возможности методов оценивали также по критерию отношения шансов (ОШ) и их доверительным интервалам (ДИ).
Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на VIII
Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007); научно-практической конференции
и школе по инфекционной патологии с международным участием (Москва, 2007);
XVIII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург,
2008); всероссийских научно-практических конференциях: молодых ученых и
студентов с международным участием (Екатеринбург, 2009), «Модернизация
фтизиатрии. Современные технологии оказания противотуберкулезной помощи
населению» (Екатеринбург, 2011), «Инновационные медицинские и
образовательные технологии в обеспечении качества и доступности
противотуберкулезной помощи населению» (Екатеринбург, 2012),
«Междисциплинарные аспекты дифференциальной диагностики и лечения больных туберкулезом» (Москва, 2012); 1-ом Конгрессе Национальной Ассоциации фтизиатров (Санкт-Петербург, 2012); региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (Екатеринбург, 2013).
Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализе и обобщении данных специальной литературы, в разработке дизайна и определении необходимых методологических подходов, цели и задач исследования. Автор лично выполнил не менее 90% всех лабораторных исследований, провел набор, математическую обработку и систематизацию всего необходимого фактического материала, разработку алгоритмов этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей. Автор лично написал диссертационную работу, сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации.
Положения, выносимые на защиту
-
Среди методов этиологической диагностики морфологически подтвержденного туберкулезного спондилита во все фазы активности процесса более высокой чувствительностью обладают молекулярно-генетические методы исследования операционного и архивного гистологического материала, в сравнении с культуральным методом исследования. При этом исследование молекулярно-генетическими методами операционного материала более чем у половины пациентов выявляет множественную лекарственную устойчивость возбудителя, а при генотипировании М. tuberculosis complex, выделенных из операционного материала, и культур, полученных при посеве операционного материала, в подавляющем большинстве случаев определяется генотип Beijing.
-
Культуральное исследование операционного материала у детей с морфологически подтвержденным туберкулезным оститом позволяет получить культуру М. tuberculosis complex в 35% посевов, молекулярно-генетическое исследование операционного, архивного гистологического материала и культур, полученных при посеве операционного материала костно-деструктивных очагов, выявляет нуклеиновые кислоты М. bovis BCG в 47%, в 30% и 100% образцов соответственно. Комплексное применение данных методов исследования позволяет верифицировать 46% случаев БЦЖ-остита у детей, диагностированного на основании комплекса клинико-эпидемиологических критериев.
-
Посев операционного материала от больных туберкулезным спондилитом позволяет получить культуру микобактерий в 24%, при посеве операционного
материала от детей с БЦЖ-оститом - в 35% исследований. При этом молекулярно-генетическое исследование достоверно чаще выявляет нуклеиновые кислоты М. tuberculosis complex из операционного материала при туберкулезном спондилите, чем при БЦЖ-остите. Частота выявления ДНК М. tuberculosis и М. bovis BCG в различные фазы активности туберкулезного воспаления в операционном материале от больных туберкулезным спондилитом и от детей с БЦЖ-оститом достоверно не отличается. Вероятность обнаружения ДНК М. tuberculosis в архивном гистологическом материале больных туберкулезным спондилитом в 4 раза выше, чем вероятность обнаружения ДНК М. bovis BCG в архивном материале костно-деструктивных очагов детей с БЦЖ-оститом.
4. Предложенные алгоритмы применения лабораторных методов выявления и типирования М. tuberculosis complex оптимизируют этиологическую верификацию морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей.
Научная новизна
Впервые проведено сравнительное исследование морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей в различные фазы активности процесса с использованием широкой панели классических и современных методов этиологической верификации туберкулеза.
Определена эффективность и проведено сравнение результатов выявления микобактерий культуральным методом исследования костного операционного материала, выявления и типирования микобактерий при молекулярно-генетическом исследовании операционного материала, полученного из костно-деструктивных очагов, а также депарафинизированного архивного гистологического материала костной ткани взрослых, больных туберкулезным спондилитом и детей с БЦЖ-оститом.
Показана зависимость эффективности выявления микобактерий методом посева ткани операционных биоптатов при туберкулезном спондилите от фазы активности процесса и отсутствие подобной зависимости при молекулярно-генетическом исследовании.
Показана высокая эффективность этиологической верификации туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей при молекулярно-генетическом исследовании архивного гистологического материала, что имеет особое значение для диагностики поствакцинального костного поражения у детей.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные могут быть использованы в работе бактериологических и молекулярно-генетических лабораторий, отделений костно-суставного туберкулеза, детских фтизиатрических отделений профильных научно-исследовательских институтов и головных противотуберкулезных учреждений субъектов РФ, отделений гнойной хирургии детских и взрослых многопрофильных больниц, а также в процессе последипломной подготовки врачей-бактериологов, врачей клинической лабораторной диагностики и фтизиатров.
Показана необходимость комплексного использования классических и современных молекулярно-генетических методов исследования для этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у
взрослых и остита у детей, при этом доказана высокая эффективность ПЦР-исследования образцов операционной ткани, в том числе, архивного депарафинизированного материала.
Апробированная методика выделения ДНК микобактерий из ткани, залитой в парафин, позволяет провести отложенное исследование и повысить эффективность этиологической верификации туберкулезного поражения костей у детей и взрослых в случаях отсутствия положительных результатов культурального и ПЦР-исследования операционного материала костной ткани.
Разработанные алгоритмы способствуют совершенствованию этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и БЦЖ-остита у детей.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработка практических рекомендаций позволила внедрить основные положения диссертации в практическую работу ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, ГБУЗ СО «ПТД», г. Екатеринбург, методические рекомендации включены в учебный план кафедры фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО «УГМУ» Минздрава России и в учебный план ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, кафедры фтизиатрии ГБОУ ВПО «ИГМА» Минздрава России, ГБОУ ВПО «ТюмГМА» Минздрава России.
Публикации
Автор имеет 38 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 24 научные работы общим объемом 6,3 печатных страниц, в том числе 7 статей в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 4 работы в зарубежных научных изданиях. Получен патент на промышленный образец №83318 (схема «Дифференциальная диагностика оститов с морфологической картиной туберкулеза у детей»), 9 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 3 публикации в электронных научных изданиях.
Объем и структура работы
