Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Реакция пассивной гемагглютинации и ее модификации 8
2.2. Сенсибилизация эритроцитов белковыми и небелковыми веществами 15
2.3. Стабилизация эритроцитов 23
2.4. Получение сенситинов 25
2.5. Заключение по обзору литературы ... 29
3. Материалы и методы исследований .... 30
3.1. Штаммы бактерий и фаги 30
3.2. Сыворотки и диагностикумы .... 31
3.3. Получение бактериальных суспензий ... 31
3.4. Фаголизаты 32
3.5. Гретые вакцины 32
3.6. Получение Н-антигенов путем обработки ультразвуком 32
3.7. Получение ультразвуковых О-антигенов сальмонелл 32
3.8. Дизентерийные ультразвуковые антигены ... 33
3.9. Комплексный антиген по методу Грассе ... 33
3.10. Содержание белков, углеводов и нуклеиновых кислот 33
3.11. Получение гипериммунных сывороток ... 33
3.12. Формалинизированные эритроциты ... 34
3.13. Сенсибилизация эритроцитов О-антигенами. . . 35
3.14. Сенсибилизация эритроцитов Н-антигенами. . . 35
3.15. Реакция пассивной гемагглютинации ... 36
3.16. Реакция торможения пассивной гемагглютинации 37
3.17. Статистическая обработка результатов ... 37
4. Результаты исследований 37
4.1. Получение и характеристика О-антигенов сальмонелл 37
4.2. Выделение и характеристика О-антигенов из фаголизатов шигелл 48
4.3. Получение и характеристика Н-антигенов из фаголизатов сальмонелл 51
4.4. Оценка сенситивной активности О-антигенов, выделенных из фаголизатов .... 54
4.5. Оценка сенситивной активности Н-антигенов, выделенных из фаголизатов .... 62
4.6. Характеристика специфической активности эритроцитарных О- и Н-диагностикумов, приготовленных из фаголизатов шигелл и сальмонелл 68
4.7. Схема технологии получения эритроцитарных диагностикумов из фаголизатов шигелл и сальмонелл 78
4.8. Применение эритроцитарных диагностикумов из фаголизатов шигелл и сальмонелл в процессе производства диагностических сывороток 81
5. Обсуждение результатов 84
6. Выводы 99
7. Список литературы 100
- Реакция пассивной гемагглютинации и ее модификации
- Сыворотки и диагностикумы
- Получение и характеристика О-антигенов сальмонелл
Реакция пассивной гемагглютинации и ее модификации
Как известно, в основе пассивной или непрямой гемагглютинации лежит реакция между антигеном и антителом, но один из этих агентов, антиген или антитело, связан с поверхностью эритроцитов. В практике чаще встречается ситуация, когда с эритроцитами связан антиген. Такие эритроциты хорошо агглютинируются соответствующими антителами. Связывание антител с антигеном, сорбированным на эритроцитах, приводит к утяжелению эритроцитов. Кроме того, полные антитела могут реагировать своими активными центрами с разными эритроцитами, что приводит к формированию конгломератов и обусловливает отчетливо выраженную агглютинацию.
В этой реакции эритроциты выступают как частицы, несущие антиген. Иными словами, РПГА представляет собой одно из проявлений пассивной агглютинации, известной уже давно. Так, еще в конце прошлого века было установлено, что при сорбции антигенов возбудителя брюшного тифа на других бактериях последние могут агглютинироваться тифозной сывороткой /210/. Бактериальные клетки использовали в качестве сорбентов и в последующие годы. В частности, было показано, что бактерии, сорбировавшие вирусы, могут агглютинироваться антивирусными сыворотками /II, 105/. В качестве сорбентов антигенов для последующей пассивной агглютинации применяли также частицы дерматола, коллодия, бентонита, талька, латекса и др. Однако наибольшее применение в этом плане нашли все-таки эритроциты. Это было обусловлено многими причинами, среди которых важную роль сыграли сведения о наличии на поверхности эритроцитов довольно развитого рецепторного аппарата, способного связывать различные токсины и бактериальные продукты /29,83,147/, причем эта способность проявляется не только ьп viito, но также in vivo /113,145/.
Как отмечает Ландштейнер /183/, эритроциты как носители были впервые использованы ещё в 1908 году, когда было показано, что после контакта с антигенами холерного вибриона они начинают агглютинироваться противохолерной преципитирующей сывороткой. Этот факт, однако, не привлек должного внимания, и лишь в 1936 г. /184/, а затем в 1942 г. /212/ эритроциты были снова использованы для сорбции диазопродуктов и извлечения антител к этим продуктам из сывороток. Широкое применение эритроцитов как носителей бактериальных антигенов началось в 40-е годы нашего столетия, когда целый ряд отечественных и зарубежных исследователей провел адсрбцию различных бактериальных антигенов для последующего выявления антител в сыворотках /70,71,111,112,180,199/. Уже в эти годы была предложена модификация РПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТЇЇГА), которая позволяет при помощи эритро - 10 -цитов, нагруженных антигеном, и специфической сыворотки выявлять гомологичный антиген в исследуемых пробах /180/.
Дальнейший прогресс в применении РПГА связан с исследованиями Е. 8о ел/144/, который показал, что нативные эритроциты хорошо сорбируют небелковые антигены, в частности, липополисахари-ды, однако после обработки таниновой кислотой эритроциты приобретают способность сорбировать в основном белковые антигены. Это позволило затем сорбировать на танизированных эритроцитах специфические антитела и получать антительные эритроцитарные диагностикумы для выявления антигенов /101/, а также разработать РТПГА с антительными диагностику мами /233,23V. Разработаны также реакции нейтрализации антител (РНАт) и реакции нейтрализации антигенов (РНАг) как варианты РТПГА /175/.
Сыворотки и диагностикумы
. Для получения бактериальных суспензий с целью выделения О-антигена культуры выращивали в матрацах с 2,5% агаром Хоттингера в течение 18-20 часов при 37, смывали 0,85$ раствором УУаСІ рН 7,2 и тем же раствором доводили до концентрации 100-200 млрд микробных тел в I мл по оптическому стандарту ГИСК им.Тарасевича.
Для получения суспензий бактерий с выраженным Н-антигеном культуры перед засевом в матрацы выращивали последовательно в бульоне Хоттингера в й-образных трубках с 0,2-0,3% агаром Хоттингера,бульоне Хоттигера, снова в К-образных трубках с 0,2-0,3% питательным агаром и снова в бульоне Хоттингера. Эта процедура обеспечивала получение посевной культуры с выраженным Н-антигеном. После выращивания на матрацах микробную массу смывали 0,85% /VaCI рН 7,2 и дово - 32 -дили по оптической плотности до концентрации 100-150 млрд микробных тел в I мл.
3.4. Фаголизаты получали путем выращивания бактерий, зараженных фагом в бульоне Хоттингера при 37 в течение 18-20 часов (до полного лизиса).
3.5. Гретые вакцины получали путем прогревания взвеси бактерий (2.10 клеток в I мл) в 0,85% растворе /VaCI рН 7,2 в течение I часа при 56. Об инактивации бактериальных клеток судили по отсутствию роста при высеве на чашках с 2% агаром Хоттингера.
8.4. Получение Н-антигенов путем обработки ультразвуком /88/. Бактериальную суспензию в объеме 100-200 мл в акустически пр?грач-ном сосуде с водяным охлаждением обрабатывали в течение 120-150 сек. ультразвуком с частотой колебаний I мгц и интенсивностью ультразвуковой энергии 5-7 вт/см . В течение обработки температура колебалась от 7 до 12. Озвученную суспензию центрифугировали в течение 20 мин. при 4000 об/мин и температуре 5-10. Надосадочную жидкость снова озвучивали в течение 5 мин при том же режиме и центрифугировали в течение 60 мин при 6000 об/мин и температуре 6-10. Надосадочную жидкость, содержащую Н-антиген, консервировали мертиолатом 1:10000, диализовали против дистиллированной воды с мертиолатом (1:10000) при температуре 4-10 в течение 24 часов и затем против дистиллированной воды в течение 48 часов. Полученные препараты лиофилизировали и хранили при 4.
Получение и характеристика О-антигенов сальмонелл
Для изучения возможности получения О-сенситинов из фаголизатов сальмонелл были отобраны штаммы S imonexct ур" 0901, Sotfr o-nePv, fiaratypAi A Л83І из этих штаммов получены фаголизаты, которые диализовали в вискозных мешках фирмы TEE-РАК (серия №24849) в течение 3 суток против проточной водопроводной воды при температуре 12-14.
Наличие О-антигена в полученных фаголизатах было показано, прежде всего, путем гипериммунизации кроликов. G этой целью фаго-лизаты стерилизовали путем фильтрования через свечи Шамберлана Ь-5, и вводили кроликам с интервалом в 5 дней по схеме, описанной в разделе 3 (Материалы и методы). Кровь брали из сердца кролика через 7 дней после окончания иммунизации. Параллельно кроликов иммунизировали по той же схеме антигенами, полученными по методу Грассе. Каждым антигеном иммунизировали по 5 кроликов. Полученные сыворотки проверяли затем в РПГА с эритроцитарными диагно-стикумами, приготовленными из О-антигенов о&гппопет&а г /ок/ t ЗаРтопе е paraltyp Ri А и Sa on rra typfamuriu-rr) . Эти диаг-ностикумы были получены изЦНИИ вакцин и сывороток им.Мечникова. Результаты РПГА с указанными диагностикумами приведены в табл.1.
Как видно из табл.1, гипериммунные сыворотки к фаголизатам характеризовались высокими титрами антител, выявляемых в РПГА с гомологичными эритроцитарными О-диагностикумами. Антитела к гетеро-логичным О-диагностикумам в таких сыворотках содержались в относительно низких титрах. Это обусловлено, по-видимому, наличием в сыворотках антител к антигену 012, который содержится у всех изученных нами штаммов сальмонелл. Как правило, антитела к этому антигену синтезируются в незначительных количествах.
Принципиально такие же данные, как следует из табл.1, были получены при изучении гипериммунных сывороток к антигенам Грассе. При сравнении титров антител к гомологичным О-диагностикумам в сыворотках к фаголизатам и антигенам Грассе можно отметить более высокие титры в сыворотках к фаголизатам, однако наблюдаемые различия статистически не значимы.
