Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные проблемы лечения гнойных ран (обзор литературы) 11
1.1. Особенности этиологии и патогенеза гнойных заболеваний мягких тканей на современном этапе 11
1.2.Современные методы лечения гнойных заболеваний мягких тканей 21
Глава 2.Материалы и методы исследования 41
2.1. Характеристика культур микроорганизмов 41
2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 41
2.3. Методы определения биологических свойств микроорганизмов 44
2.3.1 .Определение антилизоцимной активности микроорганизмов 44
2.3.2.Определение антикомплементарной активности бактерий 45
2.3.3. Определение антикарнозиновой активности микроорганизмов 47
2.3.4. Определение «антиинтерфероновой» активности бактерий 48
2.3.5. Методика определения образования биоплёнок условно-патогенными бактериями 49
2.3.6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом индикаторных дисков 50
2.3.7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных микроразведений 51
2.3.8. Исследование антимикробной активности сочетания ципрофлоксацина с окситоцином и гидрофильными основами 52
2.4. Методика определения влияния препаратов на биологические свойства микроорганизмов и их антибиотикочувствительность 53
2.5. Методика приготовления мазей и их наименование 54
2.6. Методика моделирования гнойной раны у лабораторных животных 57
2.7. Методика лечения гнойных ран экспериметальных животных 57
2.8. Микробиологическая оценка раны 59
2.9. Методика морфологического исследования ран 59
2.9.1. Патогистологическое исследование ран 59
2.9.2. Цитологическая оценка раневого процесса 59
2.10. Статистическая обработка результатов 60
Глава 3. Видовой состав и биологические свойства микрофлоры при острой хирургической инфекции мягких тканей 62
3.1. Видовой состав микрофлоры, изолированной от больных с гнойными заболеваниями мягких тканей 62
3.2. Характеристика персистентного потенциала микроорганизмов, выявляемых при гнойных заболеваниях мягких тканей 65
3.3. Характеристика способности к образованию биопленок микроорганизмов при гнойных заболеваниях мягких тканей 67
3.4. Антибиотикочувствительность изолированных штаммов 70
Глава 4. Экспериментальное изучение антибактериального действия ципрофлоксацина, окситоцина и их сочетаний в отношении возбудителей острой хирургической инфекции мягких тканей 76
4.1 Влияние окситоцина на МІЖ ципрофлоксацина 77
4.2. Влияние окситоцина, ципрофлоксацина и их сочетаний на антилизоцимную и биопленкообразующую активности патогенов 79
Глава 5. Экспериментальное изучение антимикробного и антиперсистентного эффекта комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» с гидрофильными основами 97
5.1. Определение антимикробного эффекта комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» с полиэтиленоксидами и кремнийорганическим глицерогидрогелем 99
5.2.Влияние сочетания «ципрофлоксацин+окситоцин» с полиэтиленоксидами и кремнийорганическим глицерогидрогелем на антилизоцимную активность и биопленкообразование микроорганизмов 103
Глава 6. Сравнительный анализ течения экспериментальных гнойных ран при различных методах местного лечения 120
Заключение 130
Выводы 139
Указатель литературы 141
Список сокращений 169
- Особенности этиологии и патогенеза гнойных заболеваний мягких тканей на современном этапе
- Методы выделения и идентификации микроорганизмов
- Видовой состав микрофлоры, изолированной от больных с гнойными заболеваниями мягких тканей
- Влияние окситоцина, ципрофлоксацина и их сочетаний на антилизоцимную и биопленкообразующую активности патогенов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гнойная инфекция в хирургии занимает особое место среди наиболее важных проблем клинической медицины и с течением времени её актуальность приобретает все большую значимость (Ерюхин И. А., 1992; Русаков В. И., 2000). В настоящее время при лечении гнойных ран используются новые антисептики, химиотерапевтические и иммунотропные лекарственные средства, многокомпонентные мази на гидрофильной и гидрофобной основе, протеолитические ферменты, включаемые в структуру перевязочных, шовных и пластических материалов, методы физического и электрохимического воздействия на рану (Девятов В.А., 2000, Лахно В.М., 2001; Яковлев В.П., 2002). Но, несмотря на это существенного прогресса в терапии хирургической инфекции не достигнуто. Во многих случаях низкая эффективность применения традиционных лекарственных средств обусловлена способностью микроорганизмов, инициирующих гнойно-воспалительный процесс, инактивировать факторы естественной резистентности макроорганизма: лизоцим, интерферон, комплемент и др. (Бухарин О.В., 1992, 1993, 2000), ростом доли антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых штаммов микроорганизмов (Курлаев П.П., 2001) и образовнием ими биопленок (Фадеев С.Б., 2006, 2010), частой сменой возбудителя в процессе лечения (Фадеев С.Б., 2005). Кроме того, препараты для местного медикаментозного лечения часто используются без учета фазы раневого процесса.
Местное применение сочетаний антибиотиков с окситоцином позволило значительно улучшить результаты лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей (Курлаев П.П., 2001), с острыми гнойными заболеваниями легких и плевры (Абрамзон О.М., 2002, 2004), с гнойным гайморитом (Райцелис И.В., 2000), при абдоминальном сепсисе в эксперименте (Кретинин С.В., 2008).
Эффективным в настоящее время при лечении гнойных ран считается применение мазей на гидрофильной основе с использованием смеси полиэтиленоксидов разной молекулярной массы (ПЭО-400 и ПЭО-1500 в соотношении 4:1) (Даценко Б.М., 1995), обладающей высоким осмотическим эффектом, необходимым в I фазу раневого процесса. Кроме того, перспективным является использование кремнийорганического глицерогидрогеля (Хонина Т.Г., 2005), обладающего высокой регенерирующей способностью, что важно для II и III фаз гнойных ран.
Однако окситоцин совместно с фторхинолонами, имеющими циклопропильный радикал, в составе мазей на основе ПЭО и КОГ, ранее не применялся, неизвестно их сочетанное влияние на рост микроорганизмов и их персистентный потенциал.
В связи с вышеперечисленным, создание мазей, включающих в свою структуру, помимо гидрофильной основы, препарат фторхинолонового ряда (ципрофлоксацин) и окситоцин позволило бы расширить арсенал средств, используемых в лечении гнойных ран.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось экспериментальное обоснование эффективности применения комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на основе полиэтиленоксидов и кремнийорганического глицерогидрогеля для местного лечения гнойных ран.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить видовой состав, персистентные свойства и образование биопленок клинических штаммов бактерий, возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей.
-
Изучить антимикробный эффект комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» и их влияние на антилизоцимную активность и биопленко-образование облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий, в сравнении с монопрепаратами.
-
Исследовать антимикробное действие гидрофильных основ (полиэтиленоксиды и кремнийорганический глицерогидрогель) совместно с комплексом «ципрофлоксацин+окситоцин», а также влияние комбинации данных препаратов на антилизоцимную активность и биопленкообразование микроорганизмов.
4. В эксперименте на животных при лечении гнойных ран оценить эффективность местного применения комбинации «ципрофлоксацин+окси-тоцин» с ПЭО основой (ципроксиновая мазь І) и комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» с КОГ основой (ципроксиновая мазь ІІ).
Научная новизна
Проведенные исследования in vitro выявили высокую антимикробную активность совместного применения окситоцина и ципрофлоксацина, что выразилось в значительном снижении МПК ципрофлоксацина при его сочетании с окситоцином в отношении представителей различной гноеродной микрофлоры. При сочетании ципрофлоксацина с окситоцином не только повышалась чувствительность к ципрофлоксацину у чувствительных штаммов микроорганизмов, но и появлению чувствительности у резистентных культур бактерий, что, вероятно, может рассматриваться как один из подходов решения проблемы воздействия на антибиотикорезистентную госпитальную микрофлору.
Установлено выраженное снижение АЛА и БПО клинических изолятов микроорганизмов при их культивировании в питательной среде, включающей комбинацию ципрофлоксацина с окситоцином.
Комбинация «ципрофлоксацин+окситоцин» с гидрофильными основами (ПЭО и КОГ) обладала высокой антимикробной активностью и угнетала антилизоцимную активность и биопленкообразование патогенов. Снижение средних значений АЛА и БПО микроорганизмов при действии комбинации препаратов «ципрофлоксацин+окситоцин» и их сочетания с гидрофильной основой сопровождалось перераспределением клонов бактерий в сторону увеличения численности диссоциантов с низкими значениями признака и без признака.
На основе экспериментальных данных создана мазь для лечения гнойных ран в первой фазе раневого процесса (мазь ципроксиновая І), включающая ципрофлоксацин с окситоцином на основе полиэтиленоксидов (патент РФ на изобретение № 2306947, 27.09.2007). Использование комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» на другой основе – кремнийорганический глицерогидрогель, позволило создать мазь (мазь ципроксиновая ІІ), пригодную для лечения II и III фаз гнойных ран (положительное решение формальной экспертизы по заявке на изобретение, регистрационный № 2011107059 от 24.02.2011).
Местное применение мази ципроксиновой І и ІІ в эксперименте обеспечивало более раннюю элиминацию микрофлоры из очага воспаления, прекращение выделения гнойного экссудата и стимуляцию репаративных процессов в ране, что в конечном итоге приводило к более быстрому выздоровлению животных.
Научно-практическое значение
Высокая экспрессивность и пенетрантность антилизоцимной активности и биопленкообразования стафилококков, как основных возбудителей ГВЗМТ, в сочетании с определением их антибиотикочувствительности, позволяет считать данные критерии в качестве информативных параметров при исследовании и создании препаратов, пригодных для борьбы с персистирующей инфекцией.
Практическое значение исследования заключается в разработке новой лекарственной формы - ципроксиновых мазей І и ІІ, действенность которых доказана в экспериментах in vitro и in vivo при лечении гнойных ран животных: ципроксиновая мазь І показала свою эффективность в I фазу, а ципроксиновая мазь ІІ – во II и III фазы раневого процесса.
Проведённые исследования служат основанием для представления материалов в отдел регистрации лекарственных средств, при «Федеральной службе по надзору в сфере Здравоохранения и социального развития» для получения разрешения на клиническую апробацию комбинированного препарата – ципрофлоксацина с окситоцином на основе полиэтиленоксидов и кремнийорганического глицерогидрогеля для лечения гнойных ран.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Широкая распространенность и высокая экспрессивность антилизоцимной и биопленкообразующей активности стафилококков позволяет рекомендовать данные критерии для оценки эффективности препаратов при лечении гнойных ран.
2. Применение комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» в сочетании с ПЭО и КОГ показало высокую эффективность за счет увеличения антимикробного эффекта и снижения антилизоцимной и биопленкообразующей способностей патогенов in vitro и in vivo.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследований представлены и обсуждены на научной конференции ОрГМА «Актуальные вопросы экстренной и восстановительной хирургии» (Оренбург, 2005), научной конференции ОрГМА «Молодые ученые - здравоохранению» (Оренбург, 2006), научно-практической конференции ЮУЖД и ЧелГМА «Актуальные вопросы хирургии» (Челябинск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию образования первой в России кафедры травматологии (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, получен патент РФ на изобретение и изданы методические рекомендации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 166 страницах и состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Последний включает 266 источника, в том числе 216 работ отечественных и 50 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 6 таблицами.
Особенности этиологии и патогенеза гнойных заболеваний мягких тканей на современном этапе
Ежегодно в стране регистрируется более 12 млн больных с ушибами, ранами, переломами костей верхних и нижних конечностей, что очень часто приводит к развитию гнойных процессов (Блатун Л.А., 2000, 2008). Лечение гнойных ран всегда актуально, как и в доантибиотический период (Ерюхин И.А. и соавт., 1992, 1998; Русаков В.И., 2000). Это связано не только с увеличением частоты заболеваний и гнойных осложнений (Федоров В.Д., 1991; Савельев B.C. и соавт., 1995), но и со снижением эффективности традиционной противоспалительной терапии (Королюк A.M., 1998; Ерюхин И.А., Шляпников С.А., 2000), ростом доли антибиотикоустойчивых микроорганизмов (Сидоренко СВ., 2000, 2002; Goessens W.H., 1993). Поэтому заслуживают внимание любые предложения, направленные на улучшение результатов лечения гнойных заболеваний (Сафаров С.Ю., Алиев М.А., 1993; Косинец А.Н. и соавт, 1996). Ретроспективный анализ литературных данных показал, что одной из ведущих причин распространённости хирургической инфекции было неоправданное использование не только малоэффективного в настоящее время бензилпенициллина, полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов и аминогликозидов I - II поколений, но и применение устаревших препаратов для местного лечения гнойных ран: гипертонического раствора хлорида натрия, мази Вишневского, ихтиоловой мази, стрептоцидовой, тетрациклиновой, фурациллиновой, гентамициновой мази на жировой основе. Нецелесообразность назначения этих лекарственных средств подтверждается несколькими факторами. Вышеперечисленные препараты для местного лечения ран не обладают необходимой антимикробной активностью, не обеспечивают обезболивающего, осмотического, противоотёчного эффекта (Блатун Л.А., 2000).
Как показывают многочисленные исследования, изменилась структура возбудителей, определяющих нагноение. Если в доантибиотическую эпоху среди возбудителей гнойных ран преобладали стрептококки (Wenzel R.P., 1991), то современный этиологический спектр инфекции гнойных ран характеризуется наличием широкого круга возбудителей и дальнейшим его увеличением за счет нормальной (Rauss A. et al., 1991; Eriksen N.H.et al., 1995) или условно-патогенной микрофлоры (Королюк A.M., 1998; Kamath U. et al., 1992; Farley M.M., 1995). В литературе приводятся различные сведения о значимости отдельных видов микроорганизмов в инициации гнойных ран. Одни авторы приводят данные о значительной доле среди возбудителей этой патологии грамотрицательной микрофлоры, особенно в случаях с осложненным и длительным течением инфекции (Даценко Б.М., 1995), другие говорят о значительной роли неклостридиальных анаэробов, грибов (Лещенко И.Г., Новокшенов B.C., 1993) и микробных ассоциаций (Колесов А.П. и соавт., 1989), которые, как правило, приводят к более тяжелому и продолжительному течению заболеваний (Verwej W.R. et al., 1991; Ou L.F. et al., 1993). Однако, в большинстве публикаций ведущее место среди этиологических причин гнойных ран остается за микроорганизмами рода Staphylococcus (Миронов А.Ю. и соавт., 2000; Grosserode М.Н., Wenzel R.P., 1991; Romero I., Picazo I. I., 1993; Schaechter M. et al., 1993; Emmerson M., 1994; Lavery LA. et al., 1994; Kluytmans J. et al., 1994), а среди них коагулазоотрицательным видам (Huang F. et al., 1994; Jarlov J. O. et al., 1995; Gemmell С G., 1995). Несовпадение сведений о частоте определения того или иного возбудителя при гнойных ранах, возможно связано с наличием в каждом стационаре "своих" госпитальных штаммов, обеспечивающих вторичное инфицирование и развитие гнойных осложнений. Определенное значение имеет и количество бактерий колонизирующих рану. Их высокий уровень может определять тяжесть течения заболевания (Yagupsky P., Nolte F.S., 1990). Многие годы считалось, что критической, для развития нагноения, является микробная обсемененность на уровне 105-106 микробных тел в 1 г ткани или 1 мл экссудата (Кузин М.И., 1990). Однако многое зависит от реактивности человека, от условий в ране, в которую попадает микроорганизмы. При определенных обстоятельствах заболевание может развиваться и при меньшем количестве возбудителей. Если через ткань в месте инъекции микробов провести обычную нитку критическое число микробов уменьшится до 10 тыс, а при затягивании этой нити - до 100. (Цитируется по "Теория и практика местного лечения гнойных ран под ред. проф. Даценко Б.М..- Киев: Здоровья.- 1995.- на с. 25). С другой стороны инфицирование даже надкритическим уровнем микроорганизмов не обязательно должно приводить к нагноению (Каншин Н.Н. и соавт., 1996). Ассоциация аэробов и анаэробов в гнойных посттравматических ранах, пролежнях, у больных с "диабетической стопой" достигает 98,8% (Блатун Л.А., Светухин A.M., Пальцин Н.А., 1999). От 80 до 100% выделяемых штаммов не чувствительных к пенициллину, цефалотину, тетрациклину, канамицину, гентамицину (Блатун Л.А., 1999). Появились штаммы микроорганизмов не чувствительные к метициллину (Gould D., Chamberlaine А., 1995; Miller М.А. et al., 1995). Приобретение бактериями устойчивости к метициллину, как правило, сопровождалось развитием резистентности к большинству других используемых антибиотических препаратов (Flournoy D.J., Murray С.К., 1993), что, естественно, затрудняло проведение этиотропной терапии (Nichols R.L., Smith J.W., 1993). По образному выражению А. М. Королюка (1998) "в любой популяции бактерий уже предшествуют особи, резистентные к антибиотикам, которые еще только разрабатываются в научных лабораториях". Скорость и степень такой биологической перестройки микробных патогенов была различной в зависимости от вида возбудителя, что в конечном итоге привело к изменению в этиологической структуре.
Отличительной особенностью инфекции на современном этапе является также изменение клинической картины гнойных ран в сторону преобладания доли их вяло текущих и затяжных форм (Блатун Л.А. и соавт., 1995; Martin М.А., 1994; Tan T.Q. et al., 1994; Proctor R.A. et al., 1995). Долгое время интерес клиницистов к информации о возбудителях инфекции ограничивался двумя требованиями: идентификацией микрофлоры и определением её чувствительности к ограниченному набору доступных антибиотиков (Ерюхин И. А., 1998).
Очевидно, что без более углубленного познания биологических свойств инициирующей микрофлоры невозможно организовать эффективного лечения. В связи с этим представляются интересными сведения о роли отдельных факторов бактериальной персистенции в определении течения гнойных процессов в ранах (Бухарин О. В., 1999, 2000, 2005). Как известно, клинические проявления заболевания определяются набором биологически активных веществ инициирующей микрофлоры и прежде всего экспрессией секретируемых факторов, направленных на деградацию механизмов противоинфекционной резистентности (Бухарин О.В., 1992; Бондаренко В.М. и соавт., 1994; Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996; Чернова О.Л., 1997; Дерябин Д.Г., 2000; Kuo W.N. et al., 1992; Prokesova L. et al., 1995), что обеспечивает им возможность длительного существования в организме хозяина и соответственно, пролонгирует течение гнойно-воспалительного процесса или способствует его переходу в хроническую форму. Среди биологических особенностей бактериальных патогенов, в первую очередь, следует выделить их способность к инактивации ФБР человека - лизоцима, интерферона, карнозина и комплемента, обозначаемых как антилизоцимная, антиинтерфероновая, антикарнозиновая, антикомплементарная активности и нарушающих процессы элиминации патогенов из очага воспаления (Дерябин Д.Г., 1994; Бухарин О.В., 1999).
Методы выделения и идентификации микроорганизмов
Забор материала для выделения микроорганизмов осуществляли путем пункции гнойной полости до начала местного лечения. Эвакуированный гной помещали в пустую стерильную пробирку для посева на аэробную микрофлору и 1 мл гноя - в специальные контейнеры для посева на анаэробную микрофлору — «vacutainer GasPak» (Becton Dickinson Microbiology Systems (BDMS), США). Время от момента забора до начала исследования не превышало 24 часа.
Бактериологическое исследование проводили путем посева гнойного отделяемого на селективные среды (Биргер О.М. с соавт., 1982) с определением уровня бактериальной обсемененности. Показатель микробной обсемененности определяли методикой секторальных посевов (по Gould): бактериологической петлей диаметром 3 мм производили посев (30-40 штрихов) исследуемого материала на 1-й сектор чашек Петри с питательными средами (Эндо, кровяной агар, желточно-солевой агар и кандидо-агар). После этого петлю прожигали и производили четыре штриховых посева из 1-го сектора во 2-й, аналогичным образом из 2-го в 3-й, из 1-го в 4-й, прожигая петлю после пересева с каждого сектора. Стрептококки и стафилококки определяли при посеве на кровяной агар и желточно-солевой агар соответственно. Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на кандида-агаре. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae и неферментирующие бактерии определяли посевом на среду Эндо и кровяной агар. Чашки инкубировали в термостате при 37 С в течении 24-48 часов.
Для выделения анаэробных неклостридиальных микроорганизмов из гнойного отделяемого делали высев по Gould исследуемого материала на питательные среды: Schaedler-агар (BBL, США) с добавлением 5 % бараньих эритроцитов; Schaedler-агар с 5% бараньей кровью, канамицином и ванкомицином; триптиказосоевый агар (TSA); TPY-arap. Перед посевом все питательные среды регенерировали в анаэробных условиях не менее 24 часов. Анаэробные условия создавали с помощью газогенераторных пакетов "GasPak Anaerobic System" (BBL, США) в анаэробной камере "GasPak 150" (BBL, США). Посевы инкубировали в анаэрорежиме при 37С в течение 2-7 суток.
На следующем этапе подсчитывали число колоний, выросших в разных секторах. Количество бактерий в 1 мл определяли по расчетной таблице (Фельдман Ю.М., 1984). Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств (Писаржевский С.А., 1998). В качестве руководства по идентификации бактерий использовался Определитель бактерий Берджи (1997). Биохимический профиль факультативно анаэробных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем: "ENTEROtest 24", "STREPTOtest 16", "STAPHYtest 16", "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия) и "API20CAUX" (bioMerieux, Франция). С целью идентификации анаэробных микроорганизмов анаэростат с первичными посевами анаэробных культур вскрывали через 2-7 суток, и выросшие колонии исследовали по следующей схеме: морфология колоний, аэротолерантность, индолообразование, редукция нитратов, образование сероводорода, гидролиз эскулина. Из выросших колоний проводили пересев на чистые культуры с одновременной постановкой пробы на аэротолерантность. Если культура, выросшая в анаэробных условиях, давала рост и в аэробных условиях, ее рассматривали как факультативно анаэробную, а при отсутствии роста в аэробных условиях - как строго анаэробную. Из чистых культур, изолированных микроорганизмов, с целью определения морфологии выделенных штаммов, готовили мазки с последующей окраской их по Граму. Способность культур к образованию индола, сероводорода, редукции нитратов, гидролизу эскулина, а также к ферментации углеводов оценивали с помощью коммерческих тест-систем "ANAEROtest 23" фирмы LACHEMA (Чехия). Из чистой 48 часовой культуры исследуемого микроорганизма готовили суспензию в специальной инокуляционной среде. Мутность среды с культурой соответствовала 3 степени по шкале Мс Farland. Затем взвесь по О, 15 мл раскапывали в лунки полистироловых планшет, на дно которых нанесен субстрат. Планшеты инкубировали в анаэробных условиях. Учет результатов производили через 48 часов с помощью таблицы «Интерпретация реакций», цветной шкалы сравнения. Для выявления антилизоцимной активности (АЛА) бактерий использовали фотометрический метод О.В. Бухарина с соавт. (1999). Биомассу исследуемых культур стандартной бактериологической петлёй засевали в 3 мл жидкой питательной среды (Шедлер-бульон, BBL, США). Посевы факультативных анаэробов культивировали в термостате при 37С в течение 24 часов, облигатные анаэробы - в течение 48 часов в анаэробной камере "GasPakl50" (BBL, США) с использованием газогенераторных пакетов "GasPak Anaerobic System" (BBL, США). Затем производили измерения оптической плотности (OD) бульонной культуры против бульона (Y) на фотометре Е1х808 (BioTek, США), длина волны 450 нм. Супернатант отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и обрабатывали хлороформом. В качестве тест-штамма для определения АЛА, использовали ацетонированную агаровую культуру Micrococcus luteus АТСС 15307. Культуру растворяли в физ. растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. Супернатант исследуемых микроорганизмов объёмом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37С. Затем 50 мкл смеси супернатанта лизоцима помещали в полистеролловый планшет по вертикальным рядам. Верхняя и нижняя лунки - контроли: смесь питательного бульона и лизоцим. В лунки каждого ряда планшета вносили по 200 мкл суспензии микрококка многоканальной пипеткой. Замер оптической плотности проводить через 30 и 150 с после внесения в лунки микрококка.
Видовой состав микрофлоры, изолированной от больных с гнойными заболеваниями мягких тканей
Гнойно-воспалительные процессы мягких тканей представляют большую группу заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами и различаются по первичной локализации патологического процесса и спектру превалирующих возбудителей. По литературным данным отмечается изменение состава инициирующей микрофлоры хирургической инфекции, а именно значительно снизилась роль золотистых стафилококков, и увеличилась доля грамотрицательной факультативно-анаэробной микрофлоры (Лещенко И.Г., Новокшенов B.C., 1993). Кроме того, изменилась клиническая картина этих заболеваний с тенденцией к увеличению вялотекущих форм, что многие авторы связывают с нарастанием антибиотикорезистентности этиологически значимой микрофлоры и изменением её биологических свойств (Сидоренко СВ., 2000; Goessens W.H., 1993).
Анализ бактериологических посевов содержимого гнойных полостей (раневого отделяемого) проводился у 168 больных в возрасте от 18 до 84 лет, находившихся на лечении в Отделенческой клинической больнице на ст. Оренбург в период с 2000 по 2006 гг. Исследования видового состава возбудителей хирургической инфекции мягких тканей установили, что этиологическим фактором выступали представители как грампозитивных, так и грамнегативных бактерий и грибов. Причем, преобладающее большинство изолированных микроорганизмов составили факультативно-анаэробные бактерии, которые были обнаружены у всех обследуемых лиц, тогда как представители облигатно-анаэробных неспорообразующих бактерий выявлены только в 11,8 % случаев.
Среди общего количество облигатно-анаэробных неспорообразующих микроорганизмов в 74,1 % случаев были изолированы В. fragilis и в 25,9 % -P. anaerobius. При микробиологическом обследовании ран в спектре видового состава факультативно-анаэробных бактерий преобладали стафилококки (в 79 %), среди которых частота выявления S.aureus составила 44 %, а коагулазоотрицательных стафилококков (S. epidermidis, S. saprophytics, S. warneri, S. haemolyticus) - 35 %. Значительно реже обнаруживались бактерии рода Streptococcus (в 7 %), Escherichia (5 %), Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis, P. morgani) (5 %) и Pseudomonas (P. aeruginosa) (3 %). Дрожжевые грибы рода Candida изолировали только в 1 % случаев. Все полученные штаммы грибов были отнесены к виду Candida albicans (рис 1 и 2). Наиболее высокие значения показателя микробной обсемененности отмечены у золотистых стафилококков (1 10 -1 10 КОЕ/мл). Численность коагулазоотрицательных стафилококков и стрептококков варьировала в диапазоне 1 10 -1 10 КОЕ/мл, а эшерихий, бактероидов и пептострептококков - 1 10-1 10 КОЕ/мл. Более низкие значения (1 10 -1 10 КОЕ/мл) обсемененности раневого отделяемого отмечены у Proteus spp., Pseudomonas spp. и С. albicans.
Таким образом, проведенные исследования установили, что ведущими возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей являются бактерии вида S.aureus, часто обнаруживаемые при данной патологии и имеющие наиболее высокие показатели микробной обсемененности раневого отделяемого в сравнении с другими видами микроорганизмов. Полученные данные подтверждают сведения других авторов (Блатун Л.А., 2007; Фадеев СБ., 2010; Emmerson М., 1994; Lina G. et ah, 1996; Church D. et al., 2006) о ведущей роли золотистого стафилококка в развитии гнойных заболеваний мягких тканей.
В тоже время достаточно высокой остается доля коагулазонегативных стафилококков, как этиологического фактора гнойной хирургической инфекции. Наряду с факультативно-анаэробными бактериями в видовом спектре при раневой инфекции, обнаружены облигатно-анаэробные микроорганизмы, среди которых преобладающим видом является В. fragilis. Способность микроорганизмов секретировать биологически активные вещества, инактивирующие защитные механизмы хозяина, и оцениваемые как факторы бактериальной персистенции, обуславливает длительное переживание бактерий в организме хозяина (Бухарин О.В., 1999). С целью выявления способности возбудителей гнойных заболеваний мягких тканей к инактивации факторов естественной противоинфекционной защиты макроорганизма, были определены антилизоцимная (АЛА), «антиинтерфероновая» (АИА), антикарнозиновая (АКрА) и антикомплементарная (АКА) активности патогенов. В исследованиях были использованы клинические штаммы факультативно - и облигатно-анаэробных бактерий видов S.aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, E. coli, P. vulgaris, P. aeruginosa, B. fragilis, P. anaerobius и дрожжевых грибов С. albicans, полученных при посеве раневого отделяемого при гнойных заболеваниях мягких тканей (рис.3). Установлено, что антилизоцимная активность являлась наиболее часто выявляемым секретируемым фактором персистенции бактерий и грибов и была обнаружена у 86,4 % исследуемых штаммов микроорганизмов, изолированных из раневого отделяемого при гнойных заболеваниях мягких тканей. Кроме того, у 74,8 % штаммов микроорганизмов была выявлена антикомплементарная активность, у 68,9 % культур — «антиинтерфероновая» активность» и у 54,6 % - антикарнозиновая активность.
Влияние окситоцина, ципрофлоксацина и их сочетаний на антилизоцимную и биопленкообразующую активности патогенов
В экспериментах in vitro использовали по 12 штаммов представителей семейства Enterobacteriaceae (по 6 культур Е. coli и К. pneumoniae), неферментирующие грамотрицательные бактерии (6 штаммов P. aeruginosa), грампозитивных кокков (по 6 культур S. aureus, S. epidermidis), облигатно-анаэробные грамотрицательные палочки (6 штаммов В. fragilis) и облигатно-анаэробные грампозитивные кокки (6 изолятов P. anaerobius). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) ципрофлоксацина и его сочетания с окситоцином в отношении изучаемых бактериальных патогенов определяли методом серийных микроразведений согласно стандартам NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria. Second Edition. Approved Standard. NCCLS document M11-A2. NCCLS, PA, 1990; National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. 4th ed. Approved standard M7-A4. NCCLS, Villanova, PA, 1997).
Оценку влияния окситоцина на МПК ципрофлоксацина производили при сравнении опытных и контрольных данных, при этом значимым считалось лишь снижение МІЖ в 4 раза и более. Для определения влияния гормона окситоцина на антибиотикочувствительность микроорганизмов использовался препарат окситоцин. Для определения МПК ципрофлоксацина в отношении исследуемых бактерий определяли используя 2% раствор препарата ципрофлоксацин. В качестве контроля сочетанного влияния окситоцина с ципрофлоксаином на антибиотикочувствительность микроорганизмов к антимикробному препарату в питательную среду вносили: ципрофлоксацин (контроль №1), ципрофлоксацин в сочетании с окситоцин-плацебо (контроль №2) (растворитель окситоцина, (рН 7), окситоцин (контороль №3). Доза препарата «окситоцин» используемая в работе составляла 0,05 МЕ/мл. Выбор концентрации препарата «окситоцин» обусловлен полученными экспериментальными данными, описанными в работах Михайловой Е.А. (1987), Курлаева П.П. (2001), Абрамзона О.М. (2004).
Установлено, что большинство изученных штаммов факультативно- и облигатно-анаэробных микроорганизмов (72 % культур) были чувствительны к ципрофлоксацину. Среди культур S. aureus доля чувствительных штаммов составляла 83 % (10 культур), S. epidermidis - 83 % (10 культур), у представителей семейства Enterobacteriaceae —. 83 % (10 культур), P. aeruginosa - 67 % (8 штаммов), В. fragilis - 50 % (6 штаммов) и P. anaerobius - 67 % (8 штаммов). Остальное количество штаммов (в среднем 28 % культур) проявляли резистентность к исследуемому антимикробному препарату. В связи с этим в дальнейших исследованиях все исследуемые культуры микроорганизмы были условно разделены на R-штаммы (резистентные к ципрофлоксацину) и S-штаммы (чувствительные к ципрофлоксацину).
Более низкие значения МІЖ ципрофлоксацина у антибиотико-чувствительных (S) патогенов составляла 4-16 мкг/мл и регистрировалась у облигатно-анаэробных (В. fragilis и P. anaerobius), тогда как более высокая чувствительность к ципрофлоксацину у S-штаммов (МІЖ 0,06-2 мкг/мл) отмечалась у энтеробактерий, стафилококков и синегнойной палочки (табл. 2). Среди антибиотикорезистентных (R) штаммов бактерий также самые высокие значения МІЖ ципрофлоксацина (16-32 мкг/мл) выявлены у облигатно-анаэробных микроорганизмов, а у факультативно-анаэробных R-культур грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов МІЖ антимикробного препарата составляла 4-16 мкг/мл.
Комбинация ципрофлоксацина и окситоцином-плацебо в большинстве случаев (67 % культур) не оказывал влияния на чувствительность к ципрофлоксацину исследуемой как резистентной, так и чувствительной к антимикробному препарату микрофлоры. Исключение составляли штаммы S. epidermidis и P. anaerobius, у которых было отмечено снижение МІЖ антимикробного препарата, но не более чем в 2 раза от исходной чувствительности к ципрофлоксацину.
Внесение в среду культивирования окситоцина совместно с ципрофлоксацином приводило к снижению МІЖ антимикробного препарата у всех, как антибиотикочувствительных (S), так и антибиотикорезистентных (R) культур микроорганизмов. Среди S-штаммов бактерий МІЖ ципрофлоксацина под действием окситоцина снижалась в среднем в 16 раз от исходных значений (0,5 мкг/мл против 8 мкг/мл) (р 0,05). Отмечено исчезновение резистентности к ципрофлоксацину у исследуемых R-штаммов микроорганизмов, средние значения МІЖ которых снизились с 16 мкг/мл до 2 мкг/мл (в 8 раз) (р 0,05), что соответствовало переходу МІЖ ципрофлоксацина из зоны резистентности в зону чувствительности.
Таким образом, чувствительность к ципрофлоксацину широко распространена среди штаммов, возбудителей ГВЗ мягких тканей, однако, в 17 - 50% случаев у микроорганизмов выявлено наличие резистентности к ципрофлоксацину. Внесение в среду культивирования окситоцина приводило не только к повышению чувствительности к ципрофлоксацину S-штаммов, но и появлению чувствительности у R-штаммов, что может быть одним из возможных путей решения проблемы лечения антибиотикорезистентной госпитальной микрофлоры.
