Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литературы CLASS 8
1.1. Экологические ниши эпифитной микрофлоры 8
1.2. Особенности питания эпифитных микроорганизмов 14
1.3. Размножение и распространение эпифитных микроорганизмов ... 17
1.4. Бактериальные сообщества эпифитной микрофлоры 27
1.5. Питательные среды для культивирования эпифитной микрофлоры.., ; 39
Собственные исследования
Глава 2. Объекты и методы исследований 42
Глава 3. Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры '(«тсэм») и ее характеристика 57
3.1. Технология приготовления питательной среды «ТСЭМ» 57
3.2. Химический состав питательной среды «ТСЭМ» 65
3.3. Сравнительный анализ культивирования эпифитов филлосферы на разных питательных средах 70
Глава 4. Квантитативные показатели и видовой состав эпифитных микроорганизмов на экологических нишах филлосферы 74
4.1. Геммисфера 74
4.2. Филлоплан 77
4.3. Поверхность цветков 81
4.4. Карпосфера 84
4.5. Проблемы идентификации эпифитных микроорганизмов 87
4.6. Представители эпифитной микрофлоры филлосферы 95
Глава 5. Экологическая роль эпифитных микроорганизмов филлосферы 113
Заключение 122
Выводы 131
Практические предложения 132
Библиографический список литературы 133
- Размножение и распространение эпифитных микроорганизмов
- Технология приготовления питательной среды «ТСЭМ»
- Сравнительный анализ культивирования эпифитов филлосферы на разных питательных средах
- Проблемы идентификации эпифитных микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы.
Изучение микробно-растительных взаимодействий - одно из быстро развивающихся направлений в современной биологии. До последнего времени исследования микрофлоры растений, главным образом, были связаны с почвенными и ризосферными микроорганизмами, являющимися симбионтами растений. Значительно меньше внимания уделялось эпифитным микроорганизмам филлосферы. При ее изучении интерес, в основном, был направлен на установление квантитативных показателей. Видовой состав, по мнению исследователей, зависел, главным образом, от случайно попадающих на растение микроорганизмов из воздуха, почвы, а также микробов занесенных с помощью насекомых (Burri R., 1903; Duggeli М., 1904; Clark N.A., Weller Н, 1929; Roller Е.М., 1934). В то же время, трудно представить, что в процессе эволюции такой громадный полигон для роста микроорганизмов, каким является филлосфера, не был бы заселен. Микроорганизмы обитают повсеместно, постоянный контакт и сожительство должны были в процессе эволюции привести к появлению взаимовыгодных отношений между растениями и микроорганизмами в результате естественного отбора.
В настоящее время некоторые исследователи подтверждают представления о том, что микрофлора надземных органов растений не является случайным скоплением микробов, а образует континуум микробно-растительных ассоциаций, внутри которых существует строгая видовая специфичность микроорганизмов для отдельных видов и органов растений, ее динамичность в течение вегетации, зависимость от условий произрастания растений и от ряда абиотических и биотических факторов (Холодный Н.Г., 1953; Возняковская Ю.М., 1969; Звягинцев Д.Г., 1993; Jacques М.А., Morris С.Е., 1995; Добровольская Т.Г., 2002; Глушакова A.M., Чернов И.Ю., 2004; Торопова Г.В., 2005). Свойства, присущие эпифитным микроорганизмам и проявление их в вариативных условиях внешней среды, различны. Изменение экологической обстановки может приводить к
5 трансформации количественного и качественного составов микроорганизмов, к смене биотических отношений (Широков О.Г., 1959; Самцевич С.А., 1961).
Можно предположить, что наряду с другими факторами, обеспечивающими иммунитет у растений, эпифитная микрофлора служит первичным барьером для защиты растений от попадающих из окружающей среды сапрофитных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, что делает перспективным и актуальным исследования по данной проблеме. До настоящего времени не существует единой методики отбора материалов; культивирования эпифит-ных микробов на питательных средах, не существует единой классификации эпифитной микрофлоры филлосферы. До сих пор делаются попытки раскрыть экологическую роль микрофлоры растений, но сущность влияния микроорганизмов на растения изучена далеко недостаточно, несмотря на то, что она представляет большой интерес и имеет практическое значение. В связи с вышеизложенным, комплексный подход к изучению количественного и качественного составов эпифитной микрофлоры филлосферы, выявление особенностей взаимодействия эпифитных микроорганизмов с растениями и изыскание оптимальной питательной среды (ПС) для культивирования эпифитов представляется достаточно актуальным.
Цель исследования: изучить особенности структуры микробных комплексов экологических ниш филлосферы (геммисферы, филлоплана, поверхности цветков, карпосферы) и определить экофизиологическую роль микроорганизмов в жизни растений.
Задачи исследования:
разработать питательную среду на основе тыквенного отвара для культивирования эпифитной микрофлоры «ТСЭМ» (тыквенная среда для культивирования эпифитной микрофлоры);
провести сравнительную оценку роста эпифитной микрофлоры на различных питательных средах;
установить квантитативные показатели эпифитной микрофлоры на экологических нишах филлосферы;
провести идентификацию штаммов микроорганизмов и уточнить видовой состав эпифитных микроорганизмов на различных экологических нишах филлосферы;
определить экофизиологическую роль эпифитных микроорганизмов, ассоциированных с растениями;
Научная новизна.
Впервые был применен комплексный подход в исследовании эпифитной микрофлоры, охватывающий экологические ниши филлосферы, в частности, геммисферу, филлоплан, цветки и карпосферу. Уточнен видовой состав эпифитов в экологических нишах филлосферы. Выявлены доминантные представители эпифитной микрофлоры надземных органов растений. Установлена численность эпифитной микрофлоры филлосферы зеленых растений в сезонной и годовой динамике. Выявлены представители эпифитов, имеющих высокую адаптивную способность к воздействию экологических факторов.
Разработана новая питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры «ТСЭМ», изготовленная по оригинальной технологии на основе тыквенного отвара. Ее приоритетность подтверждена уведомлением о положительном результате формальной экспертизы на изобретение, заявка от 27.08.2007, № 2007125909/13.
Теоретическая и практическая значимость.
Сведения о видовом составе эпифитной микрофлоры из разных экологических ниш филлосферы дают основания говорить о разнообразии эпифитов, входящих в различные таксономические группы. Выделены доминантные представители эпифитной микрофлоры экологических ниш филлосферы. Разработана и внедрена питательная среда «ТСЭМ» для культивирования эпифитных микроорганизмов. Научные разработки используются в работе лаборатории научно-образовательного центра «Технологии живых систем и биологических материалов» Ставропольского государственного университета, а также в учебном процессе медико-биолого-химического факультета СГУ при чтении курсов «Микробиология», «Микробиоценозы человека, животных и растений», «Сани-
7 тарная микробиология», «Экология». При помощи компьютерного комплекса визуализации изображения создана база фотографий эпифитных микроорганизмов филлосферы.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональных научных конференциях «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2005, 2006, 2007); в межвузовском сборнике научных работ «Естествознание и гуманизм» (Томск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных систем» (Пенза, 2007); VII Международной научной конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2007).
Основные положения, выносимые на защиту:
Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры: технология приготовления и результаты исследования.
Динамика (циркааннуальная и годовая) квантитативных показателей эпифитных микроорганизмов на экологических нишах филлосферы.
Трансформация видового состава эпифитной микрофлоры филлосферы.
Специфичность эпифитных микроорганизмов филлосферы.
Публикации.
По теме диссертационного исследования опубликовано 14 работ, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Объем и структура диссертационной работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы в количестве 195 научных источников, в том числе на иностранном языке - 48. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 13 таблиц, 8 рисунков и 53 фотографии.
Размножение и распространение эпифитных микроорганизмов
Если бы микроорганизмы, даже обладающие полезными свойствами, беспрепятственно размножались на растениях, то это неизбежно привело бы к угнетению последних, а в прикорневой зоне почвы - к конкуренции за питательные вещества. Особенно вредно чрезмерное обилие микрофлоры сказалось бы на растениях в молодом возрасте. Фактически этого не происходит по двум причинам. Поглощаемые растениями элементы пищи расходуются на накопление массы, на рост и т. д., а наружу выделяется лишь небольшая их часть, которая служит пищей для микроорганизмов. Невысокая концентрация питательных веществ, как в летучих выделениях растений, так и растворимых в воде, а также наличие у растений приспособлений, защищающих их от возможных при гуттации больших потерь минеральных элементов, гидатод и мелкоклеточной паренхимы является фактором, ограничивающим размножение микроорганизмов на поверхности растений.
Вторым, не менее значительным фактором, ограничивающим чрезмерное размножение нормальной микрофлоры, является естественный иммунитет растений. Эпифитные микроорганизмы приспособлены к жизни на поверхности растений и не проникают при обычных условиях внутрь их тканей. В настоящее время общепринятым является мнение, что ткани здоровых растений стерильны. Правда, в литературе периодически появлялись работы, в которых приводились факты нахождения бактерий в разных органах растений (Шеста-кова В.А., 1961; Touzig S., Bracci-Orsengigo L., 1955), однако эти сведения нельзя считать убедительными и окончательно подтвержденными.
Н. Soding (1959) изучал выживаемость бактерий в живых листьях. Он помещал мясистые листья алоэ, ириса и других растений в суспензии бактерий и создавал вакуум. После удаления, воздуха бактерии из суспензии всасывались путем инфильтрации в клетки листьев. Кроме того, исследовалась судьба бактерий Bact. prodigiosum, Bact. ozaenae, Aerobacter aerogenes и Ps. fluorescens, введенных в листья при повреждении их поверхности и внесенных в выжатый из этих растений сок. В результате было установлено, что бактерии, введенные в клетки цельного или поврежденного листа, быстро погибают, тогда как в выжатом соке и на поверхности поврежденных листьев они развиваются. О бактерицидносте цельных тканей нельзя судить по действию сока, ее можно определить только методом инфильтрации, так как бактерицидность цельной ткани листа зависит от выделения бактерицидных веществ живыми клетками. В частности, Н. Soding установил, что на поверхность стенок межклетников выделяются бактерицидные вещества типа дубильных.
Обнаружено, что из семян многих растений в момент их прорастания выделяются противомикробные вещества. Поэтому если разложить семена на поверхности питательной среды, предварительно засеянной некоторыми микроорганизмами, то вокруг семян образуются зоны отсутствия роста бактерий. Определение природы антибактериальных веществ семян показало, что они относятся к пигментам типа флавонолов и что их действие выражается в блоки-ровке дыхательных систем микроорганизмов. Кроме того, в семенах ржи был найден водорастворимый и термоустойчивый антибиотик, активный против бактерий (Новотельнов Н.В., Ежов И.С, 1957).
Все факты нахождения бактерий внутри растений (за исключением симбионтов) Е.Н. Мишустин (1957) объясняет тем, что исследователи имели дело с отмирающими тканями. Живое, здоровое растение обладает иммунитетом, который предохраняет его внутренние ткани от размножения в них бактерий. Факторами внутреннего иммунитета растений (пассивного и активного) в настоящее время считают: 1) особенности строения покровных тканей; 2) функциональные факторы, например время открывания устьиц, характер прорастания семян; 3) химический состав клеточного сока - наличие в нем алкалоидов, фенолов, танинов, глюкозидов, фитонцидов, обладающих бактерицидными свойствами; 4) образование защитных некрозов; 5) образование антитоксинов; 6) фагоцитоз. Два последних свойства появляются у растений после проникновения паразита внутрь органов. По условиям своего существования эпифитная микрофлора непосредственно не соприкасается с внутренними частями растений и не попадает под влияние факторов внутреннего иммунитета растения. Однако фракции, выделяющиеся наружу через покровные ткани растений, содержат различные органические соединения, в том числе фитонциды. Наличие различных фитонцидов, летучих и нелетучих, присуще всем растениям. Фитонциды являются важным фактором иммунитета и имеют различную химическую природу. К ним относятся алкалоиды, дубильные вещества, смоляные кислоты и др. Летучие фракции в основном представлены эфирными маслами, терпенами, глюкозидами, а также органическими кислотами и альдегидами. Обычно выделяется одновременно не одно, а несколько веществ, причем у разных растений они могут быть общими (Токин Б.П., 1952).
Установлено, что к фитонцидам относятся некоторые соединения, образующиеся в качестве промежуточных продуктов при основных жизненных процессах, протекающих в растениях. Было, например; показано, что из растертых листьев выделяются альдегиды на протяжении 5-7 дней. Это указывало на непрерывность образования подобных веществ при ферментативных реакциях -окислительно-восстановительных превращениях кислот и спиртов (Скворцов С.С., 1964).
Механизм действия многих фитонцидов одинаков и заключается в их влиянии на процессы обмена веществ, в которых участвуют функциональные сульфгидрильные группы ферментных белков. Было изучено влияние летучих фракций фитонцидов на активность ферментных систем микроорганизмов и установлено, что происходит их инактивация, приводившая к нарушению жизненных функций организмов.
Технология приготовления питательной среды «ТСЭМ»
Одним из направлений решения данного вопроса является стандартизация питательных основ и оптимизация компонентного состава питательных сред (ПС), применяемых для культивирования микроорганизмов, а также снижение их стоимости.
Для подробного изучения всего разнообразия встречающихся на растениях видов микроорганизмов, прежде всего, необходимо было подобрать питательную среду, на которой можно было бы выявить наибольшее разнообразие микроорганизмов по сравнению с другими средами, в том числе и по сравнению с такой общепринятой.средой, как мясопептонный агар. Эпифитные микроорганизмы, способные питаться выделениями растений, являются в своем большинстве типичными гетеротрофами. Гетеротрофные микроорганизмы нуждаются в получении извне тех или иных органических веществ. Гетеротроф-ность может выражаться не только по отношению к источникам углерода, но также и по отношению к аминокислотам (аминогетеротрофность) и витамино-подобным веществам (ауксогетеротрофность).
В искусственных питательных средах необходимые для микроорганизмов питательные вещества - макро- и микроэлементы обычно даются микроорганизмам в достаточных, а иногда и в избыточных количествах в виде солей, с водой, органическими веществами, примесями и т.д. Источником углерода для гетеротрофных организмов может служить огромное количество разнообразных органических веществ. Наиболее общедоступными источниками углерода являются сахара, особенно гексозы, а также многоатомные спирты и карболовые кислоты, получающиеся при окислении Сахаров.
В качестве источника азота микроорганизмы, как известно, могут использовать различные азотсодержащие вещества, начиная от сложных белков и кончая молекулярным азотом атмосферы. Наилучшими источниками их усвояемости и общедоступности являются аммиак и смесь аминокислот. Во все вещества протоплазмы азот входит только в восстановленной форме (NH и NH2), и поэтому вещества, имеющие окисленный азот, должны быть восстановлены прежде, чем их азот станет доступным для питания микроорганизмов. Те микроорганизмы, которые не способны восстанавливать нитраты или нитриты, не могут их использовать для своего питания.
Огромную роль в. питании микроорганизмов играют витамины. Они служат микроорганизмам для построения коэнзимов и синтеза нуклеопротеидов. В настоящее время известно более 12 витаминов, необходимых для роста микробов, например: тиамин (витамин В]), рибофлавин (витамин В2), пантотеновая кислота (витамин Вз), пиридоксин (витамин Вб), фолиевая кислота (витамин ВС), аскорбиновая кислота (витамин С), никотиновая кислота (витамин РР), токоферол (витамин Е), ретинол (витамин А). Следовательно, полноценной средой для микроорганизмов может быть среда, богатая органическими веществами, аминокислотами и витаминами.
Исходя из того, что эпифитные микроорганизмы приспосабливались питаться выделениями растений на протяжении длительной эволюции, можно было предположить, что их потребностям больше всего будут соответствовать среды из растительных отваров.
В связи с этим, нами было сделано предположение, что среда, основой которой будет являться тыквенный отвар, может служить оптимальной питательной средой для культивирования эпифитной микрофлоры. Тыква в качестве среды была выбрана в результате учета ее питательной ценности. Аналогом питательной среды «ТСЭМ» является капустная среда № 19, предложенная Я.П. Худяковым и Ю.М.Возняковской (1956) для выращивания эпифитной микрофлоры, ризосферной и корневой микрофлоры, а также фасолевая среда. Также используют общеизвестную стандартную среду микробиологический питательный агар (ГРМ-агар). Поэтому нами в 2005 году была разработана питательная среда «ТСЭМ» -тыквенная среда для культивирования»эпифитной микрофлоры.
Приготовление и состав среды «ТСЭМ». Приготовление среды «ТСЭМ» происходит в 2 этапа:
1 этап: приготовление тыквенного отвара.
За основу брали тыквенный отвар, полученный следующим образом (г/л): тыкву, отобранную для приготовления отвара, тщательно мыли, очищали от кожуры, испорченных мест и снова мыли. 200-250 г свежей мелко нарезанной тыквы измельчали ножом, заливали 1 л водопроводной воды и кипятили 30 мин. Жидкость фильтровали через ватно-марлевый фильтр, доводили объем до 1 л кипяченой водой.
2 этап: к тыквенному отвару добавляли 20-25 г агара, (NH HPC (фос форнокислый аммоний) - 1 г, NaCl (хлорид натрия) - 1 г; подщелачивали до рН 7,0-7,2 и стерилизовали 15 мин при 1 ати.
Хранили среду в холодильнике при t - +2-3 С. Готовая среда имела прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретала серый цвет (полупрозрачный). Для приготовления тыквенного отвара лучше всего использовать сорта тыквы крупноплодной и мускатные сорта тыквы, которые подвергаются длительному хранению и содержат большой набор питательных веществ, необходимых для эпифитных микроорганизмов: Миндальная, Мозолеевская, Мраморная, Столовая зимняя, Фестивальная и др.
Для того, чтобы выяснить, какие составные части питательной- среды необходимы для выявления наибольшего видового разнообразия и получения нормального роста у так называемых «плохорастущих» микроорганизмов, приготовляли различные варианты этой среды. Всего было приготовлено 10 вариантов питательной среды «ТСЭМ».
Мы предложим пять вариантов, которые в совокупности, наиболее подробно воспроизведут процесс получения полноценной среды.
Первый вариант получения «ТСЭМ» состоял в следующем: необходимо было отобрать количество свежей тыквы для получения тыквенного отвара 60 200 г. 200" г свежей мелко нарезанной тыквы измельчали ножом, заливали 1 л водопроводной воды и кипятили 30 минут. Затем отвар фильтровали через ват-но-марлевый фильтр, доводили объем до 1 л кипяченой водой, добавляли 10 г агара. Растворение агара происходило на водяной бане. Измеряли рН среды, кислотность среды была 6,0-6,61. Стерилизовали 5 мин при 1 ати. Готовую среду разливали в чашки Петри. Готовая среда имеет желто - коричневый прозрачный цвет, при застывании - серый цвет (полупрозрачный). Низкая кислотность и малое количество агара не обеспечивало образования достаточной плотности среды, среда растекалась. Стерильность, среды не достигалась за счет малого времени стерилизации.
Второй вариант получения «ТСЭМ» состоял в следующем: 200-г свежей мелко нарезанной тыквы измельчали ножом, заливали 1 л водопроводной воды и кипятили 30 минут. Затем отвар фильтровали через ватно-марлевый фильтр, доводили объем до 1 л кипяченой водой, добавляла 20 г агара: Учитывая кислотность среды, подщелачивали среду до рН 7,0-7,2 и стерилизовали в автоклаве 15 мин при 1 ати. Культивирование микроорганизмов производилось в термостате при температуре 25-35С. Увеличение количества агара на 10 г привело к тому, что среда не растекалась, но не образовывала достаточной плотности.
Сравнительный анализ культивирования эпифитов филлосферы на разных питательных средах
В процессе изготовления различных вариантов и выбора наиболее оптимального состава питательной среды параллельно производили высев микроорганизмов с филлосферьг методом отпечатка. Для решения этих задач, мы вели выделение микроорганизмов с надземных органов 15 растений;
Культивирование микроорганизмов на первых этапах исследования, проводили на трех средах (FPM-arap;.капустная среда № 19; «ТСЭМ»), с целью; выявления наиболее благоприятной среды для культивирования эпифитных микроорганизмов; Результаты культивирования- эпифитов оказались следующими: обильный рост микроорганизмов- наблюдался; на питательной среде FPM-arape,как правило; у P seudomonas: aeruginosa, Micrococcus aurantiaca, Kocuria rosea, Mycococcusduteus, Kocuria rhizophila. Перечисленные микроорганизмы, быстро: развиваются; на.данной среде, подавляя; рост, типичных представителей эпифитной микрофлоры, являющихся олиготрофамт
Рост микроорганизмов на; капустной среде; № 19 проявлялся образованием слизи на поверхности среды и вокруг колоний, что затрудняло выделение чистой культуры и в.дальнейшем идентификацию микроорганизмов.
При культивировании эпифитной микрофлоры на питательной среде «ТСЭМ» давали рост микроорганизмы, входящие в различные таксономические группы, но обильныйфост отмечался у типичных представителей эпифитной микрофлоры. Тинкториальных, культуральных, морфологических изменений свойств микроорганизмов на среде не отмечено. Установлено что «ТСЭМ» имеет в своем составе широкий набор активных субстанций, необходимых для полноценного развития различных видов эпифитной микрофлоры. В результате сравнительной оценки питательных сред дальнейшие исследования проводили на «ТСЭМ».
В отваре из тыквы, который используется для приготовления среды «ТСЭМ», питательные вещества (минеральные; соли, микроэлементы, амино 71 кислоты, белки и проч.), очевидно, присутствуют в сочетаниях, наиболее подходящих для микроорганизмов, приспособившихся к жизни на растениях; сравнение тыквенного отвара с капустным отваром, и питательным ГРМ-агаром, показало, что тыквенный отвар не уступает ни одной из сред указанных выше.
Во всех приведенных работах для изучения видового состава эпифитной микрофлоры зеленых частей растений, исследователи пользовались в качестве питательной среды - МПА. Известно, что состав питательной среды играет решающее значение для установления качественного разнообразия микроорганизмов, выделяемых из естественных субстратов.
Результат, который был получен большинством исследователей, обнаруживших на растениях небольшое количество видов с частым преобладанием Ps. herbicola и Ps. fluorescens, можно объяснить тем, что скорость роста этих микроорганизмов на оптимальной для них питательной среде МПА значительно больше, чем у многих микобактерий, дрожжей и др. микроорганизмов.
Кроме того, Ps. herbicola и Ps. fluorescens выделяют продукты обмена, которые накапливаясь в среде, тормозят развитие многих медленнорастущих на МПА видов.
Рост микроорганизмов при высевах с этих же растений проявлялся наиболее четко на тыквенной среде, хороший рост был получен и на среде из отвара капусты, однако, тыква является-наиболее доступным растением для его использования в течение круглого года, храня его в холодильнике.
Для сравнения питательной среды «ТСЭМ» с другими средами — капустной средой № 19 и МПА, были сделаны высевы с различных экологических ниш филлосферы параллельно на-данные питательные среды.
Для учета общего количества микроорганизмов посев проводили глубинным методом, а для учета качественного состава - поверхностным способом.
Для того, чтобы представить себе насколько полно на среде «ТСЭМ» выявляется вся присутствующая на поверхности надземных частей растений микрофлора, производился высев смыва с листьев на элективные среды, применяв 72 мые для учета микроорганизмов, входящих в различные физиологические группы.
Рассматривая результаты, можно видеть, что такие группы, как целлюло-зоразлагающие, нитрифицирующие бактерии, азотобактер, требующие особых сред для их выявления, практически на надземных органах растения отсутствуют. Наибольшее количество входит в группу аммонификаторов которые находят вполне благоприятные условия для роста на среде «ТСЭМ». Хорошо растут на этой среде грибы, дрожжи, актиномицеты.
Некоторые микроорганизмы давали хороший рост на ГРМ-агаре или на капустной среде, росли слабо или вообще не росли на «ТСЭМ».
Сначала отпечатки делали на ГРМ-агаре, затем на капустной среде, и в конце на питательной среде «ТСЭМ».
Для- выяснения интенсивности роста на приготовленных средах посев производили следующим образом: питательные среды разливали на чашки Петри и на поверхность их наносили культуры штрихами. Посевной материал обязательно предварительно разводили в воде - 1 петля на 10 мл воды. Разведение посевного материала необходимо; так как известно, что масса клеток может нести с собой запасы различных питательных веществ.
Первоначально выделение микроорганизмов производили с ГРМ-агара, затем с капустной среды, и в конце с питательной среды «ТСЭМ».
Оказалось, что для нормального роста культур на среде «ТСЭМ» первенствующее значение имеет добавление к ним источника различных аминокислот. Однако, оставались еще такие культуры, которые и при этих условиях давали очень плохой рост.
После ряда испытаний было установлено, что добавление фосфорнокислого аммония двузамещенного - (NH4)2HP04 - делает среду более полноценной, но рост еще отмечался недостаточный. После добавления хлорида натрия (NaCl) рост микроорганизмов был полноценным.
Посев большого количества культур на «ТСЭМ» показал, что такая замена вполне возможна, многочисленные посевы на разные варианты, приготов 73 ленные из тыквенной среды, позволили остановиться на пятом варианте, несложном по своему составу и изготовлению и содержащем все необходимые для бактерий вещества.
На питательном агаре (ГРМ-агар) выделили — 170 штаммов, на капустной среде № 19 — 78 мтаммов. На питательной среде «ТСЭМ» — 189, в том числе, с почек — 19, с листьев - 87, с поверхности цветков - 24, с плодов - 59 мтаммов микроорганизмов.
Для приготовления тыквенного отвара лучше всего использовать следующие сорта тыквы: Миндальная, Мозолеевская, Мраморная, Столовая зимняя, Фестивальная и др. Вырастив их на почве, обогащенной минеральным и органическим составом возможно приготовление из тыквенной массы сухого вещества (в виде прессованных таблеток), который можно использовать в приготовлении отвара в зимне-весенний период, т.к. тыква в период хранения портится и теряет некоторый запас питательных веществ.
Проблемы идентификации эпифитных микроорганизмов
Определение видов у микроорганизмов представляет значительные трудности. Распознавать их можно, только зная целый ряд характерных для них культуральных, морфологических и биохимических признаков. В имеющихся определителях бактерий, в частности в определителе бактерий Берджи (2001) собрана микрофлора разных разделов микробиологии: медицинской-, технической, молочной и др. Естественно, что ориентироваться на 700 страниц текста, включающего тысячи названий, весьма затруднительно. Это обстоятельство, наряду с отсутствием оптимальных питательных сред, определяло в значительной степени малую изученность-видового состава микрофлоры растений. Между тем, как уже указывалось, нельзя изучать деятельность и взаимоотношения между растением и микрофлорой без познания свойств отдельных-видов.
Мы считали, что для того, чтобы получить полное представление о видовом составе микрофлоры растений необходимо:
- выделить с растений и идентифицировать большое количество культур-микроорганизмов;
- выделять культуры с растений различных по систематическому положению и по условиям произрастания;
- учесть соотношение разных видов микроорганизмов на одном и том же растении;
- сравнить видовой состав микрофлоры почек, листьев, цветов плодов.
Для решения этих задач, за период с сентября 2004 г. по сентябрь 2007 годы мы вели выделение микроорганизмов с надземных органов 15 родовых единиц растений.,
В итоге всего было выделено на питательной среде «ТСЭМ» 189 культур, в том числе, с почек — 19, с листьев - 87, с поверхности цветков - 24, с плодов -59.
Техника выделения культур с поверхности растений сводилась к следующему: по несколько экземпляров растений брали в поле, в лесу или в саду и анализировали в тот же день. Навеску исследуемого материала (1 г) помещали в колбочку с 100 мл стерильной воды и энергично встряхивали. Иногда для лучшей смываемости бактерий в воду добавляли небольшое количество песка, чтобы получить на чашках рост изолированных колоний, из исходного смыва делали разведение в 10 раз. Для этого 1 мл жидкости переносили в пробирку с 10 мл стерильной воды. Посев производили путем нанесения одной капли на поверхность агаровой среды, налитой в чашки Петри. Эту каплю1 растирали шпателем Дригальского последовательно на 2-3 чашки. После посева чашки выдерживали в термостате при температуре 22-24С трое суток, а затем на двое суток оставляли на столе при дневном освещении, при котором лучше проявляется пигментация колоний, остальное время хранили культуры в холодильники. Подсчет колоний производили в течении 15 суток.
Особенности роста микроорганизма на питательной среде, его культу-ральные свойства, внешний вид колоний являются довольно характерными признаками для каждого вида. Обычно на чашке можно заметить одинаковые колонии и отличить их от колоний других видов и потому выделение культур можно производить не путем отвивки всех 100 % выросших на чашке колоний, а выбирать все чем-либо отличающиеся друг от друга формы.
Определение вида нельзя начинать, пока не будет уверенности в абсолютной чистоте культуры, поэтому выросшие на чашках при высеве из смыва с растений колонии отвивали в пробирки на косой агар. После получения роста культуры вновь рассевали на чашки. Такой рассев в некоторых случаях производился по нескольку раз чистые культуры получали после отвивки из одной колонии на 2 пробирки с косым агаром. Одна пробирка считалась коллекционной, вторая рабочей. Каждую культуру при ее выделении записывали в журнал под определенным порядковым номером, при этом описывали цвет колонии, ее форму, консистенцию, величину и структуру.
Следовательно, основным условием правильной идентификации эпифит-ных микроорганизмов, вне зависимости от используемого при этом метода, является наличие чистой культуры, В связи с этим отколу колонии и последую 89 щей макро- и микроскопической проверке чистоты культуры необходимо уделять особое внимание. В отдельных случаях даже откол отдельно лежащей колонии не гарантирует получения- в последующем чистой культуры. Например, колонии слизеобразующих бактерий могут содержать клетки других микроорганизмов, захваченные вместе со слизью. Культуры актиномицетов и представителей рода Bacillus могут иметь контаминанты в полостях между цепочками клеток. При раннем отборе колоний с селективной среды загрязнение может быть связано с захватом контаминантов, находящихся в подавленном, но жизнеспособном состоянии. Также колонии Bacillus характеризуются морфо-физиологической колониальной изменчивостью, на разных средах могут переходить из колоний R - формы в S - формы и наоборот, что затрудняет первичное определение по культуральным и тинкториальным признакам.
Также идентификация рода Bacillus затруднена тем; что виды имеют различные разновидности. В настоящее время не существует полных и однозначных сведений в литературе по определению представителей рода Bacillus.
На селективных средах откол не следует производить тоже слишком рано, в связи с возможным наличием медленно растущих микроорганизмов.
Поэтому выросшие на чашках при высеве из смыва растений колонии отвивают в пробирки на косой агар. После получения роста культуры вновь рассеивают на чашки. Такой рассев в некоторых случаях производится по несколько раз.
Работа по идентификации бактерий начинается с изучения культураль-ных свойств, т.е. характера роста микроорганизмов на питательной среде. Культуральные свойства бактерий, выращенных на плотной питательной среде включают: форму, размер колоний, наличие пигмента, способность к росту при определенной температуре1 и концентрации углекислого газа и кислорода, на среде определенного состава и т.д.
Кроме культуральных свойств иногда могут быть определены морфологические, тинкториальные свойства (например, путем микроскопии мазка из колонии, окрашенного по Граму), некоторые биохимические свойства (напри 90 мер, наличие ферментов оксидазы, каталазы), антигенные свойства (например, с. помощью-реакции агглютинации или реакции иммунофлуоресценции) и некоторые другие: признаки, без знания которых также невозможно их определе
