Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышенный интерес исследователей к классу низкомолекулярных катионных пептидов отражает важную роль этих соединений в биологических системах. Широкое распространение в природе позволяет рассматривать низкомолекулярные пептиды как один из инструментов антибактериальной защиты организмов, проявляющейся в многочисленных реакциях антагонизма на всех уровнях организации жизни (Кокряков, 1999; Бухарин и др., 2000).
Наибольшее количество продуцентов низкомолекулярных катионных пептидов обнаружено среди грамположительных бактерий (Oscariz, Pisabarro, 2001). Синтезируемые ими пептиды обладают широким спектром антибактериального действия. Способность к секреции данных соединений наиболее распространена среди представителей родов Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus и Streptococcus (Егоров, Баранова, 1999). В значительно меньшей степени этот признак описан у бактерий рода Staphylococcus. Так, из известных в настоящее время 38 видов Staphylococcus способность продуцировать антибактериальные пептиды исследована лишь у стафилококков, принадлежащих к видам S. epidermidis (Allgaier et al, 1986), S. gallinarum (Kellner et al, 1988), S. cohnii (Furmanek et al, 1999), S. aureus (Crupper, Iandolo, 1996; Crupper et al, 1997, Navarata et al, 1998). В процессе поиска новых продуцентов низкомолекулярных катионных пептидов сотрудниками лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН выделен штамм IEGM KL-1, принадлежащий к виду S. warneri и активно синтезирующий антибактериальные соединения (Коробов, Лемкина, 1996; Коробов и др., 2003).
Изучение низкомолекулярных катионных антибактериальных пептидов имеет важное значение для понимания путей быстрой колонизации стафилококками характерных экологических ниш (лечебных стационаров, в частности) и представляет особую значимость для создания новых лекарственных средств класса природных антибиотиков. Последнее особенно актуально, поскольку в настоящее время наблюдается стремительное распространение антибиотикорезистентных форм микроорганизмов благодаря высокой мобильности их генома, способствующей быстрому формированию защитных механизмов к новым антибактериальным препаратам.
юсклцінниДМАЯІ
MIM»Mt» I
Цель настоящей работы - детальное изучение закономерностей
процесса продукции низкомолекулярного антибактериального фактора клетками S. warneri 1EGMKL-1.
Основные задачи исследования
Выявить оптимальные условия культивирования S. warneri IEGM KL-1, обеспечивающие максимальный выход антибактериального фактора.
Исследовать возможные механизмы регуляции синтеза антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1.
Разработать эффективный способ получения очищенного антибактериального фактора, изучить его физико-химические и биологические особенности.
Разработать способ повышения секреторной активности S. warneri IEGM KL-1 - продуцента низкомолекулярного антибактериального фактора.
Положения, выносимые на защиту
Продукция антибактериального фактора клетками S. warneri IEGM KL-1 зависит от условий их культивирования, фазы роста, контролируется внутрипопуляционными механизмами.
Антибактериальный фактор, продуцируемый S. warneri IEGM KL-1, -новый термо- и кислотоустойчивый низкомолекулярный катионный пептид гидрофобной природы. Информация о его синтезе локализована в бактериальной хромосоме.
Низкомолекулярный пептид, секретируемый клетками S. warneri IEGM KL-1, обладает широким спектром антибактериальной активности, степень проявления которой зависит от условий внешней среды.
Воздействие на клетки S. warneri IEGM KL-1 ультрафиолетовым светом и оптимизация состава питательной среды способствуют существенному повышению уровня продукции- низкомолекулярного антибактериального фактора.
Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы. Впервые обнаружена продукция антибактериального фактора клетками стафилококков, принадлежащих к редкому виду S. warneri. Экспериментально обосновано, что антибактфиальный фактор, выделенный из среды культивирования S. warneri IEGM KL-1, является новым низкомолекулярным катионным пептидом с молекулярной массой 2999 Да. Установлено, что продукция пептида зависит от фазы роста, условий культивирования клеток 5.^атеи1ЕСМКЕ-1,контролируетсявнутрипопуляционньгмимеханизмами.
Информация о его синтезе и секреции локализована в бактериальной хромосоме. Показано, что низкомолекулярный пептидный фактор обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении стафилококков S. aureus и S. epidermidis, а также представителей родов Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Streptococcus. Полученные результаты расширяют представление о микробной продукции низкомолекулярных катионных пептидов.
В результате проведенных исследований разработан оптимальный состав среды культивирования S. warneri IEGM KL-1, обеспечивающий 16-кратное повышение уровня продукции антибактериального фактора. Обоснована возможность использования ультрафиолетового света для увеличения секреторной активности продуцента низкомолекулярного катионного антибактериального пептида. Выявленный широкий спектр антимикробного действия низкомолекулярного катионного пептида, продуцируемого клетками S. warneri IEGM KL-1, открывает перспективы его практического использования в качестве эффективного противомикробного средства.
Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета: материалы диссертации используются в лекционном курсе "Биохимия микроорганизмов" и Большом практикуме по общей микробиологии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 1999; II Российской конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001; V Международной научной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды", Пермь-Волгоград, 2001; Международной конференции "Микробиология и биотехнология XXI столетия", Минск, 2002; Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2004.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение роли эндогенных и экзогенных факторов в регуляции роста
популяций микроорганизмов" (Индекс приоритетного направления 4.1.2, номер госрегистрации 01.9.10055303).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 литературных источников, из них 25 отечественных и 137 зарубежных авторов.
