Содержание к диссертации
список сокращений - 6
Введение 7
Г. Обзор литературы 11
1.1. Биология радиорезистентности
(клеточные и молекулярные детерминанты РР) 14
Пролиферативная активность и РР 14
Фазы клеточного циклам РР 16
Индуцибельные механизмы РР - роль гена р53 и апоптоза 19
Конститутивные механизмы РР - структурная организация генома. ...23
Репарациярадиоиндуцированных повреждений 34
1.2. Отдаленные эффекты действия радиации 42
Отдаленные клеточные эффекты действия радиации 43
Молекулярные механизмы отдаленных эффектов облучения 46
1.2.3. Механизмы радиоиндуцированной нестабильности генома 48
L3. Возобновление роста опухоли после облучения 53
1.4. Приобретенная радиоустойчивость опухолей 56
Экспериментальные модели приобретенной РР с использованием трансплантируемых опухолей 58
"In vivo - in vitro" модели приобретенной РР 61
1.4.3. Модели приобретенной РР in vitro 67
И. Материалы и методы исследования
П.1. Линии клеток 76
Радиочувствительность 77
Кинетика роста клеток 78
11.4. Ростклетокв полужидкой среде 79
11.5. Определение плоидности клеток 80
Цитологические препараты для светового и флуоресцентного микроскопирования 81
Проточная цитофлуориметрия 82
Восстановление клеток от радиоиндуцированных повреждений 82
Прививка клеток животным 84
Перевод клеток из опухолей в культуру in vitro 84
Спектрофотометрическое определение НгОг-катаболизирующей
активности клеток 85
11.12. Чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам 87
П. 12.1. Оценка цитотоксического действия препаратов по
колониеобразующей способности 88
II. 12.2. МТТ-тест выживаемости клеток 88
Определение радиоиндуцированного апоптоза 89
Электрофорез ДНК 90
Определение функциональной активности р53 САТ-методом 91
Определение экспрессии генов методом Нозерн-гибридизации 93
Регистрация изменения структурной организации хроматина методом аномальных временных зависимостей вязкости (АВЗВ) 94
Статистическая обработка полученных результатов 96
Результаты исследований
III. Получение и цитоморфологическая характеристика потомков
облученных клеток 98
III, 1, Выделение потомков облученных клеток 98
HL2. Морфология клеток линий ПОК-10 и ПОК-20 102
Ш.З. Плоидность клеток линий ПОК 104
IV. Радиочувствительность потомков облученных клеток 107
IV. 1. Зависимость радиочувствительности от типа твердой подложки 107
IV. 1.1. Стеклянная подложка 107
IV.1.2. Пластиковая подложка 110
IV.2. Зависимость радиочувствительности от сохранности
межклеточных контактов ИЗ
IV.3. Влияние радиации на способность клеток
к независимому от субстрата росту 117
V. Постлучевая репопуляция ПОК 122
V. 1. Кинетика роста клеток линий ДХ-ТЮ, ПОК-10 и ГЮК-20 после у -
облучения 122
V.2. Динамика цитоморфологических изменений в клеточных популяциях в
первые 4 суток после облучения в дозе 10 Гр 128
VI. Туморогенность клеток 141
VH. Стабильность радиорезистентного фенотипа ПОК-20 145
Vn,I. Морфология клеток и колоний... 145
VII.2. Клоногенная активность 148
VII.3. Пролиферативная активность 150
VII.4. Кинетика роста клеток 153
VII.5. Радиочувствительность 160
Vin. Чувствительность ПОК к противоопухолевым препаратам 165
Выяснение механизмов возникновения высокой радиорезистентности у
ПОК
IX. Распределение облученных клеток по фазам клеточного цикла 170
X. Эффективность восстановления ПОК от радиоиндуцированньгх
повреждений 173
X.I. Восстановление отПЛП 173
Х.2. Восстановление отСЛП 175
XI. Н202 - катаболизирующая активность 179
XI.1. Разложение перекиси водорода без облучения 179
XI .2, Разложение клетками перекиси водорода после у-облучения 181
XII. Функциональная активность р53 188
XIII. Апоптоз 191
ХШ.1. По морфологическим критериям 191
ХШ.2. Электрофорез ДНК 194
XIV. Определение экспрессии генов 196
XV. Оценка роли структурной организации хроматина в формировании
радиорезистентности ПОК 199
XV.1, Исходная организация хроматина интактных клеток 199
ХШ .2. Влияние облучения на изменение структуры хроматина 202
ХШ.З. Восстановление структуры хроматина после облучения (репарация) 204
Обсуждение результатов 213
Заключение 249
Выводы 253
Библиография 256
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АВЗВ - аномальная временная зависимость вязкости
АФК - активные формы кислорода
ДР - двунитевые разрывы ДНК
KB - коэффициент восстановления, используемый для оценки
эффективности восстановления клеток от СЛП ЛТ - лучевая терапия МИ - митотический индекс МЦ - метилцеллюлоза
ПЛП - потенциально летальные повреждения ПОК - потомки облученных клеток
ПОК-10 - лгошя ПОК, выделенная после однократного у-облучения родительской линии опухолевых клеток в дозе 10 Гр
ПОК-20 - линия ПОК, полученная после однократного у-облучения родительской линии опухолевых клеток в дозе 20 Гр РР - радиорезистентность РЧ - радиочувствительность СЛП - сублетальные повреждения ЭК - эффективность клонирования
Введение к работе
Проблема рецидивов, нередко возникающих после лучевой терапии (ЛТ) злокачественных новообразований, непосредственно связана с изучением отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на популяцию опухолевых клеток. Как в эксперименте, так и в клинической практике наряду с регрессией опухолей после больших лучевых нагрузок в ряде случаев отмечается феномен усиления радиорезистентности (РР) опухоли. Вторично повышенную РР могут также проявлять и опухолевые рецидивы, возникающие спустя какое-то время после радиотерапевтического излечения, что значительно снижает эффективность ЛТ. Преодоление приобретенной радиоустойчивости -одна из кардинальных проблем радиационной онкологии. Одним из подходов к её решению является исследование фундаментальных механизмов феномена клеточной PP.
До сих пор нет ясности за счет каких клеток или процессов происходит возобновление роста опухоли после облучения в высоких дозах. Не ясны и причины повышения резистентности рецидивов к последующему облучению.
Традиционно повышение РР опухоли к повторным курсам ЛТ связывают с селекцией устойчивых к радиации клонов после каждого лучевого воздействия, при котором "выбивается" наиболее чувствительная фракция клеток. Общеизвестно, что устойчивый к облучению резерв опухоли могут составлять высокодифференцированные клетки с, низкой митотической активностью или в состоянии гипоксии; клетки, находившиеся в момент облучения в резистентных фазах цикла, способные к более эффективной репарации повреждений. На знании этих закономерностей базируется ЛТ, направленная на оптимальный подбор и использование известных биологических, физических и химических факторов, модифицирующих лучевой поражение. Для подавления вторично устойчивых очагов опухолевого роста есть ещё один путь - повышение лучевой нагрузки. Однако в этом случае эффективность ЛТ ограничена тяжелыми
осложнениями, связанными с повреждением нормальных радиочувствительных тканей.
Между тем резистентные клеточные клоны как предсуществуют в популяциях опухолевых клеток, так и могут возникать заново под действием радиации. Даже очень незначительное количество наследственно измененных клеток, обладающих селективным преимуществом, в ходе естественного отбора может дать начало новым клонам. В этом случае источником возобновленного, нередко ускоренного роста опухоли или появления радиорезистентных рецидивов будут уже генетически измененные клетки. Если устойчивость злокачественных клеток к облучению, обусловленную определенным периодом их жизнедеятельности, удается снизить при помощи модификаторов, то возникшую вследствие изменения генетического аппарата клетки трудно изменить даже в условиях интенсивной терапии. Таким образом, выяснение природы приобретенной РР имеет ключевое значение для ЛТ злокачественных новообразований. Без исследования механизмов приобретенной РР решение проблемы преодоления устойчивости опухоли к облучению может быть достигнуто лишь долгим и трудным эмпирическим путем.
К сожалению, этот важный для онкологии радиобиологический феномен остается слабошученным. Информация в литературе о причинах повышения РР опухолевых клеток скудна и несистематична; до сих пор исследования в этом направлении носили больше описательный, феноменологический характер. Фактически, такое научное направление в радиобиологии отсутствует.
Среди причин крайне недостаточного внимания к данному феномену основными являются: сложность и многофакторность механизмов, определяющих развитие устойчивости опухолевой популяции к у-облучению, и отсутствие удовлетворительных радиобиологических моделей.
Целенаправленное изучение феномена приобретённой РР проводилось б единичных работах. Основной экспериментальный материал по приобретенной
радиоустойчивости опухолей получен в опытах на животных в 50-60-х гг. (Балмуханов и Ефимов 1971). Путем многократных последовательных облучений - трансплантаций асцитной карциномы Эрлиха был получен её РР вариант. В ходе сравнительного изучения свойств клеток из чувствительной и резистентной к у-облучениго опухолей обнаружены изменения в кариотипе, уровне содержания сульфгидридных соединений, соотношении основных и кислых белков и ряд других отличий. В остальных исследованиях in vivo получены разрозненные и противоречивые данные, которые трудно связать между собой, чтобы сделать определенные выводы.
Для расшифровки фундаментальных механизмов, лежащих в основе опухолевой прогрессии, характеризующейся возникновением повышенной РР неоплазмы, необходимы целенаправленные исследования в культуре. Подходящей экспериментальной моделью могут являться стабильные линии потомков выживших после облучения опухолевых клеток. Однако анализ литературы показывает, как трудно in vitro смоделировать явление приобретенной PP. В разное время предпринимались попытки создания моделей для исследования механизмов приобретения опухолевыми клетками устойчивости к повторному облучению. Однако в большинстве случаев в культуре in vitro облучением не удавалось индуцировать повышения радиоустойчивости (Hill et al., 1990; Brown and Trott, 1994; Tamawski et al., 1998); часто клетки из выделенных резистентных клонов оказывались или нежизнеспособными, или вскоре возвращались к исходному уровню чувствительности (Li et al., 2001). Стабильные линии радиорезистентных потомков облученных опухолевых клеток удалось получить лишь в единичных работах (Russell et al., 1995; Mitsuhashi et al., 1996).
Поэтому остаётся актуальной проблема разработки клеточной модели in vitro, на которой можно изучать процессы выживания облученной опухолевой популяции и выяснять причины возникновения в ней радиорезистентных
клеточных вариантов. Исследование особенностей биологии потомков облученных опухолевых клеток в культуре даст возможность лучше понять механизмы, лежащие в основе появления радиоустойчивых рецидивов. Это с одной стороны позволит целенаправленно подобрать соответствующие средства, препятствующие самому их возникновению, а с другой, может оказаться полезным для разработки научно-обоснованных подходов по преодолению уже возникшей радиорезистентности.
Цель представленной работы - исследование механизмов приобретённой радиорезистентности опухолевых клеток. Для этого была поставлена задача смоделировать данное явление in vitro и разработать клеточную систему, состоящую из стабильных родственных линий злокачественных клеток, резко различающихся по радиочувствительности. На полученной клеточной модели провести комплексное изучение биологических свойств потомков опухолевых клеток, выживших после у-облучения в высоких дозах.
