Содержание к диссертации
Введение
Глава I . Обзор литературы. Микробиологическое повреждение целлюлозосодержащих материалов и методы их защиты II
1.1. Микробиологическое повреждение промышленных целлюлозосодержащих материалов II
1.2. Грибы, повреждающие целлюлозу, и их влияние на свойства материалов 13
1.3. Способы борьбы с микроорганизмами, поражающими целлюлозосодержащие материалы 19
1.4. Биохимические механизмы действия фунгицидов на грибы 31
1.5. Заключение 38
Глава 2. Методическая часть 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Методы определения фунгистатической активности химических соединений 43
2.2.2. Метод исследования влияния длительности воздействия фунгицидов на выживаемость спор грибов '. 44
2.2.3. Методы исследования изменений роста и биосинтетической активности грибов под влиянием химических соединений 45
2.2.4. Метод исследования грибостойкости целлюлозо-содержащих материалов 49
Экспериментальная часть 51
Глава 3. Исслещование характера поражения древесной массы микроскопическими грибами 51
Глава 4 . Исследование фунгистатической активности химических соединений различных классов 63
4.1. Исследование фунгистатической активности дигидрофторида диметиламина 63
4.2. Исследование фунгистатической активности полифторированных функциональных алифатических соединений 66
4.3. Исследование фунгистатической активности фенольных соединений 71
4.4. Исследование фунгистатической активности нитросоединений 75
4.5. Исследование фунгистатической активности оловоорганических соединений и их смесей с четвертичными аммониевыми соединениями 79
4.6. Исследование фунгистатической активности производных адамантана 84
4.7. Изучение влияния длительности воздействия фунгицидов на выживаемость спор грибов 88
Глава 5. Исследование изменения роста и биосинтетической активности грибов под влиянием фунгицидов 92
5.1. Изучение влияния фунгицидов на накопление биомассы грибами при поверхностном и глубинном культивировании 92
5.2. Исследование влияния фунгицидов на активность целлюлолитических ферментов ПО
5.3. Определение влияния фунгицидов на дыхательную активность грибов П7
5.4. Исследование влияния фунгицидов на биосинтез белка в мицелии грибов 121
Глава 6. Изучение грибостойкосїи древесной массы,обработанной фунгицидами 127
Глава 7. Рекомендации наиболее оптимальных срвдств защиты для цемшсодержащих материалов 137
Выводы 140
Литература 142
Приложение 159
- Микробиологическое повреждение промышленных целлюлозосодержащих материалов
- Методы определения фунгистатической активности химических соединений
- Исследование фунгистатической активности дигидрофторида диметиламина
- Изучение влияния фунгицидов на накопление биомассы грибами при поверхностном и глубинном культивировании
Введение к работе
Актуальность темы. Решения ХХУ и ХХУІ съездов КПСС предусматривают повышение требований к качеству выпускаемой целлюлозно-бумажной продукции. Влажные полуфабрикаты для изготовления бумаги и картона - беленая целлюлоза и древесная масса при хранении и транспортировке подвергаются воздействию микроорганизмов, главным образом грибов, которые в значительной степени ухудшают товарный вид продукции и снижают ее прочностные свойства.
Ущерб, наносимый грибами, весьма велик и трудно поддается оценке. По самым приблизительным подсчетам Научного Совета АН СССР ежегодный ущерб об биоповреждений превышает 10 млрд.рублей. По зарубежным оценкам ущерб от биоповреждений превышает 3% объема продукции.
В Советском Союзе проблема защиты целлюлозосодержащих материалов приобретает все большее значение. Это вызвано повышением требований к качеству выпускаемой продукции. Качество продукции, в том числе и целлюлозно-бумажной промышленности является одним из основных критериев деятельности предприятий. Значительная роль в повышении качества продукции принадлежит химическим защитным средствам, обеспечивающим ее более длительное хранение. В этом вопросе важное место занимает решение проблемы защиты влажных полуфабрикатов - древесной массы и целлюлозы от биологического поражения.
Однако номенклатура имеющихся в настоящее время средств защиты влажных полуфабриков мала, и они не обеспечивают сохранности целлюлозных материалов при хранении. Несмотря на то, что постоянно синтезируются новые препараты и модифицируются уже извест-
7 гае, большая часть средств защиты труднодоступны, дороги, с ма-
шм спектром действия.
Широко применяемый пентахлорфенолят натрия весьма ядовит, {ак показал опыт применения пентахлорфенолята натрия на Пермском целлюлозно-бумажном комбинате: обработка продукции 0,3% от веса зухого волокна не обеспечивает защиты при транспортировке и хра-іении. Салициланилид и его производные не предохраняют от плес-ієвєния даже при расходе 6% от веса сухого волокна. Органические їоединения ртути и олова весьма эффективны, но труднодоступны и роксичны для человека и гидробионтов.
Для разработки методов защиты с помощью химических соедине-іий важное значение имеет выяснение состава ассоциации грибов -- биодеструкторов, и их отношения к защитным средствам.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение эизиологии некоторых микроскопических грибов, развивающихся на цэевесной массе в ранние сроки ее хранения, при воздействии фун-ицидов.
Задачами работы являлось следующее:
выявление повреждающего действия микроскопических грибов, взвивающихся на древесной массе;
исследование фунгистатической активности химических соеди-іений различных классов:
изучение физиологических особенностей грибов: накопления іиомассьі, биосинтеза белка, дыхательной и целлюлолитической ак-'ивности при воздействии фунгицидов в целях рационального приме-іения и рекомендации в практике на научной основе для замены из-юстных фунгицидов и предупреждения реакции привыкания.
Научная новизна. Впервые проведено исследование физиологии іикроскопических грибов, поражающих древесную массу: накопления
8 биомассы, биосинтеза белка в мицелии грибов и его выход в культу-ральную жидкость, дыхательной и целлюлолитической активности при воздействии фунгицидов.
Впервые показана фунгистатическая активность дигидрофторида диметиламина, полифторированных функциональных алифатических соединений, хлор- и дихлорфторфенолятов калия, галоиднитросоедине-ний, оловоорганических соединений и их смесей с четвертичными аммониевыми соединениями, производных адамантана по отношению к микроскопическим грибам. Впервые установлено усиление фунгицидно-го действия смесей оловоорганических соединений с четвертичными аммониевыми соединениями.
Впервые изучена кинетика подавления роста ,Penicillium purpurogenum и Aspergillus niger при воздействии препарата АФПК, оловоорганических соединений и их смесей с четвертичными аммониевыми соединениями. Проведенные исследования позволили предположить механизм действия оловоорганических соединений и их смесей с четвертичными аммониевыми соединениями на грибы.Экспериментально проверены в лабораторных условиях грибостойкость древесной массы, обработанной фунгицидами, и воздействие последних на прочностные свойства полуфабриката.
Практическая ценность работы. На основании выполненной работы рекомендуются новые химические соединения,обладающие фунгицидной активностью по отношению к микроскопическим грибам: хлортетрафтор-фенолят калия,АФПК,дигидрофторид диметиламина и смеси оловоорганических соединений с четвертичными аммониевыми соединениями.
Полученные данные по воздействию указанных соединений на накопление биомассы грибами, биосинтез белка, дыхательную и целлю-лолитическую активность,кинетики подавления роста позволяют определить рациональные пути их использования.Разработаны техничес-
9 кие условия на хлортетрафторфенолят калия, изучена его токсичность по отношению к теплокровным животным.
Публикации. По результатам исследований создано 4 изобретения, опубликовано б статей. Результаты работы были доложены и обсуждены на комиссии по биологическому повреждению материалов Всесоюзного ботанического общества, Всесоюзной научной школе "Биокоррозия, биоповреждение, обрастания" (1976), Всесоюзном симпозиуме "Биологические активные соединения ІУ Б группы" (1977) и Ш Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов" (1981).
Объем работы. Диссертационная работа представлена на 141 странице^ машинописного текста, содержит 6 рисунков, &2 таблиціьі'. Библиография - 157 наименований, из них 38 иностранных авторов.
Таким образом, автором выносятся на защиту:
результаты экспериментальных исследований повреждающего действия микроскопических грибов, развивающихся на древесной массе;
результаты экспериментальных исследований фунгистатической активности дигидрофторида диметиламина, полифторированных функциональных алифатических соединений, хлор- и дихлорфторфенолятов калия, галоиднитросоединений, оловоорганических соединений и их смесей с четвертичными аммониевыми соединениями и производных адамантана по отношению к микроскопическим грибам;
результаты экспериментальных исследований физиологических особенностей микроскопических грибов, поражающих древесную массу, в том числе накопления биомассы, биосинтеза белка, дыхательной
и целлюлолитической активности при воздействии на них фунгицидов;
10 - новые химические соединения в качестве фунгицидов для защиты древесной массы и целлюлозы: дигидрофторид диметиламина, АФПК, хлортетрафторфенолят калия и смеси оловоорганических соединений с четвертичными аммониевыми соединениями.
Микробиологическое повреждение промышленных целлюлозосодержащих материалов
Биологическое повреждение древесины и изделий из нее в условиях повышенной влажности и температуры резко возрастает в связи с интенсивным развитием промышленности. Древесина и целлюлозосо-держащие материалы разрушаются под влиянием главным образом биологических агентов, к которым в первую очередь относятся грибы и беспозвоночные животные. Как отмечает Горшин (1979) в средней полосе Советского Союза грибы служат причиной 90% всех видов биологического разрушения древесины.
Доминирующая роль в биологическом повреждении древесины, а также и целлюлозосодержащих материалов принадлежит грибам в силу их малой специализации к определенному субстрату и легкой приспособляемости к субстратам и изменениям условий обитания.
Как указывает Билай (1980) первое место принадлежит грибам в силу большой распространенности и быстрого роста мицелия, обусловленного высоким тургорным давлением растущих клеток, высокой энергией размножения, вследствие чего образуется огромное количество сухоспоровых конидий с длительным периодом выживания. Грибы обладают активной системой ферментов, позволяющей им использовать различные целлюлозосодержащие материалы.
В результате активизации окислительных оксидаз выделяются продукты окисления - органические кислоты, усиливающие коррозию материала. Обладая гетерогенным генетическим аппаратом, грибы способны к формированию новых высокоагрессивных рас, занимающих впоследствии доминирующее положение.
В своем обзоре мы не затрагиваем вопросов биоповреждений древесины, которые вызваны действием прежде всего высших базидиаль-ных грибов (.Eriksson , 1980).Повреждение целлюлозосодержащих материалов таких как товарная целлюлоза, древесная масса, древесноволокнистые плиты, картон, различные виды бумаг вызваны главным образом несовершенными грибами. Обстоятельные исследования по биологическим, экологическим и физико-химическим аспектам повреждений грибами бумаг и книг в СССР описаны в трудах Нюкши (1972-1980). По данным Нюкши поражение грибами бумаги начинается при низких пределах относительной влажности воздуха и широких амплитудах температур.
Значительно усиливаются повреждения материалов в условиях субтропического и тропического климата и при хранении в условиях повышенной влажности. Развиваясь на целлюлозном материале, грибы изменяют его внешний вид, внутреннюю структуру, в результате чего в значительной степени снижаются показатели прочности.Развитие грибов с активным комплексом целлюлолитических ферментов приводит к прямой деградации субстрата.
Повреждение древесины, целлюлозы и материалов из них,вызываемое грибами, составляет звено общей цепи биоповреждений и является компонентом проблемы "Человек и биосфера".
Всесторонний учет ущерба от биоповреждений не налажен, так как трудно поддается оценке. По СССР имеются данные о потерях только деловой древесины, оцениваемых в I млрд. рублей в год (Баженов и др., 1972). Отсутствуют учтенные данные убытков народного хозяйства в ходе изготовления, обработки, транспортировки, хранения и эксплуатации изделий.
Проблема биоповреждений, в том числе грибами, считается,как отмечает Ильичев (1979), эколого-технологической проблемой, объектами повреждений являются созданные человеком материалы, предметы культуры и т.п. Указанные объекты должны быть долговечными в эксплуатации в различных условиях.
В связи с этим вопросы изучения агентов биоповреждений разнообразных промышленных материалов и изделий, средств защиты, прогнозирование развития и их предупреждения имеют важнейшее народнохозяйственное значение.
Методы определения фунгистатической активности химических соединений
Фунгистатическую активность химических соединений исследовали методами, описанными в литературе (Нюкша, 19726; Горшин, 1977; Егоров, 1979). Методические указания, приведенные данными авторами, являются общепризнанными и обладают хорошей воспроизводимостью результатов.
Методом, описанным Горшиным (1977), проводили первичную оценку токсичности химических соединений. Раствор препарата вводили в разогретый до 55С сусло-агар, после застывания поверхность агаровой пластинки инокулировали спорами и небольшими кусочками мицелия гриба в 5 точках по схеме "конверта". Для инокулирования среды использовали 30-суточные культуры грибов Aspergillus niger, Peni-cxllium purpurogenum, Trichoderma viride. Учет результатов проводили на 7 и 14 сутки после засева по минимальной концентрации препарата, при которой рост гриба отсутствовал. Оценку фунгистатической активности химических соединений проводили также методом бумажных дисков (Лилли и Барнетт, 1953; Егоров, 1979), при котором фунгицид вносят в бумажный диск. Метод дисOB широко используется для определения чувствительности микроорганизмов к различным веществам. Интерпретацию результатов осуществляют на основании величины зон угнетения роста исследуемого микроорганизма. В работе использовали диски из фильтровальной бумаги І древесной массы массой 0,1 и 0,5 г. После обработки фунгицидом і подсушивания на воздухе диски помещали на поверхность агара. Поверхность агара и дисков инокулировали водной суспензией спор и яицелия грибов, содержащей до 2 млн спор в I мл. Количество спор з суспензии определяли с помощью счетной камеры Горяева. Учет результатов опытов проводили на 7 и 14 сутки по минимальной концентрации фунгицида, задерживающей рост грибов.
Вышеуказанные методы определения фунгистатической активности івляются весьма удобными и достаточно надежными при массовом отбо-зе веществ с фунгистатической активностью. Данные,полученные с по-ющью этих методов, являлись отправными для дальнейшего изучения іаиболее активных из них на рост грибов.
Метод исследования влияния длительности воздействия фунгицидов на выживаемость спор грибов Определение влияния длительности воздействия фунгицидов на выживаемость спор грибов проводили по методу, описанному Злочевской і1979),путем выдерживания их в растворах фунгицидов различной концентрации и последующим высевом на среду без фунгицида. После l-суточного выращивания на среде Чапека-Докса в качалочных колбах тределяли биомассу гриба. Контролем служил мицелий, выросший из шор, находившихся аналогичное время в среде Чапека-Докса. Опыты іроводили с культурой гриба Aspergillus niger.. Методы исследования изменений роста и биосинтетической активности грибов под влиянием фунгицидов Определение накопления биомассы грибами при воздействии препарата проводили на видоизмененной среде Чапека состава (г/л): NaN03- 3,0; К2НР0«- 1,0; MgS04- 0,5; FeSO - 0,01; микроэлементы: Fe,Ccr,2n , Ып - 0,01, вода - I л (Ташпулатов и др., 1974). I качестве источника углерода использовали измельченную фильтро-зальную бумагу - 2%, глюкозу - 20 г/л. Исходное значение рН питательной среды - 5,2. Использование фильтровальной бумаги в качест-зе источника углерода было обусловлено необходимостью максимального приближения к условиям роста грибов в естественных условиях на цел-иолозных полуфабрикатах. Для сравнения способности грибов накапли-зать биомассу в возможно оптимальных условиях проводили культивирование с использованием глюкозы в качестве источника углерода. Ірепарат вносили в питательную среду одновременно с засевом гриба. Засев гриба проводили водной суспензией спор и мицелия 14-суточной «ультуры гриба. Выращивание гриба проводили поверхностным способом. )пыты имели пятикратную повторность.
Определение сухой массы мицелия проводили в динамике через саждые 7 суток культивирования в течение I месяца. Биомассу отде-шли от культуральной жидкости фильтрованием через капроновый фильтр, затем промывали несколько раз дистиллированной водой и шределяли массу сухого мицелия весовым способом. После отделения 5иомассы и целлюлозы от культуральной жидкости в фильтрате определяли количество образовавшихся при гидролизе целлюлозы восстанав-швающих Сахаров и активность целлюлолитических ферментов.
Определение восстанавливающих Сахаров проводили с использова 46 шем модифицированного метода Шомоди-Нельсона. Принцип метода состоит в первоначальном окислении восстанавливающих Сахаров, образовавшихся при ферментативном гидролизе целлюлозы, реактивом Шомо-\я в щелочной среде (рН 9) с образованием закиси меди и последующим окислением арсеномолибдатным реактивом Нельсона в кислой среде ірН 1,7 - 2,0) с образованием молибденовой сини. Определение восстанавливающих Сахаров проводили, помещая в пробирку I мл гидроли- $ата (культуральной жидкости), I мл реактива Шомоди, помещали в сипящую водяную баню на 15 минут, добавляли I мл реактива Нельсона і 7 мл воды. Восстанавливающие сахара определяли как глюкозу по ным калибровки. Для построения калибровочных графиков в градуи-юванные пробирки вносили по 0,5 мл реактива Шомоди и 0,5 мл раст-юра глюкозы (0,01 - 0,040 г/л), пробирки помещали на 40 минут в сипящую водяную баню, охлаждали, вносили в каждую по 0,5 мл реак- ива Нельсона, интенсивно встряхивали и содержимое пробирок доводили до 5 мл дистиллированной водой (Клесов и др., 1980). Поглоще-іие полученного окрашенного раствора определяли на фотоэлектроколо-)иметре (ФЭК-56) при 610 нм относительно 0,05 М натрий-ацетатного іуфера, обработанного реактивами Шомоди-Нельсона.
Активность экзо- А-глюканазы определяли по количеству глюкозы, ібразовавшейся в реакционной смеси при использовании в качестве субстрата хлопкового волокна. Определение активности проводили сле-ующим образом: в пробирку помещали 3 мг обезжиренного хлопкового юлокна, I мл цитрат-фосфатного буфера и I мл культурального фильт-іата, закрывали пробкой и ставили в термостат на 24 часа при опти-[альных условиях реакции и определяли восстанавливающие сахара Родионова и др., 1967).
Активность.эндо-А -глюканазы определяли по количеству восста-:авливающих Сахаров, образующихся при гидролизе карбоксиметилцел 47 люлозы под действием целлюлазного комплекса грибов. Для этого реакционную смесь (0,5 мл забуференной культуральной жидкости и 2,5 мл 1% раствора Na-КМЦ) инкубировали при 50С в течение 60 ми-яут. Количество восстанавливающих Сахаров определяли в I мл смеси цо и после инкубации.
Эндоглюканазную активность определяли также по снижению вязкости 0,3%-ного раствора ШКМЦ (степень замещения 0,63, степень полимеризации 495). Для этого к 5 мл 0,3%-ного раствора Na-КМЦ добавляли 0,7 мл культурального фильтрата и 0,3 мл цитрат-фосфатного Зуфера. После инкубации (3 мин.) определяли время истечения раствора (Родионова и др., 1967).
Исследование фунгистатической активности дигидрофторида диметиламина
Из литературы известно фунгистатическое действие фторидов и бифторидов щелочных металлов и аммония по отношению к деревораз-рушающим и деревоокрашивающим грибам, проявляющееся в концентрации 0,3% (Горшин, 1977). Мы исследовали фунгистатическую активность нового соединения дигидрофторида диметиламина по отношению к Aspergillus niger и Penicillium purpurogenum. Исследование фунгистатического действия дигидрофторида диме-тиламина проводилось в интервале концентраций 10,0-250,0 мкг/мл, всего 20 концентраций, на сусло-агаровой среде при посеве уколами. Контролем служил рост грибов, высеянных на сусло-агар без ингибитора. Испытание фунгистатического действия препарата мы проводили также методом бумажных дисков, пропитанных препаратом в количестве от 0,01 до 2,00% от массы сухого волокна. Всего испытано 10 дозировок. Результаты опытов учитывали визуально по наличию и характеру роста, спороношения, форме и размеру колоний и изменению их окраски, а также по минимальной концентрации препарата, подавляющей полностью рост гриба. Наблюдения за развитием грибов в ходе эксперимента при посеве уколами в 5 точках показали, что дигидрофторид диметиламина начинает тормозить рост .Penicillium purpurogenum в концентрации 10,0, Lspergillus niger - 50,0 мкг/мл. Угнетение роста грибов в указанных концентрациях проявлялось в задержке спороношения по сравнению с контролем на 3-4 суток. Увеличение концентрации дигидрофторида диметиламина от 50,0 цо 150,0 мкг/мл для Penicillium purpurogenum и от 100,0 до 200,0 мкг/мл для Aspergillus niger привело к стабильному подавлению спороношения у обоих видов грибов, которое сохранялось в течение 28-суточного опыта. Сублетальные концентрации дигидрофторида диметиламина, а имен-до 150,0-225,0 мкг/мл приводили к изменениям структуры колоний грибов. В случае Penicillium purpurogenum рост гриба в интервале концентраций 150,0-200,0 мкг/мл наблюдался на 7-8 сутки после за-зева в виде мелких колоний с диаметром 3 мм, вначале белых, затем эозвдых колоний, диаметр которых не превышал 4 мм на 28 сутки, в го время как в контроле диаметр колоний достигал 25-28 мм. Для Aspergillus niger действие сублетальных концентраций препарата 150,0-225,0 мкг/мл заключалось в появлении дегенеративного роста: изменении структуры колоний и их окраски. В этом случае колонии расползались по агару, цвет их был белый и ярко-желтый. Диаметр колоний гриба при концентрации препарата 150,0 мкг/мл не превышал 20 мкм 28 суткам роста.
Данные минимальных концентраций, полностью подавляющих рост грибов, представлены в таблице 5. При указанных концентрациях дигидрофторида диметиламина рост грибов не наблюдался в течение Показано отсутствие роста грибов на бумажных дисках, обработанных дигидрофторидом диметиламина в количестве 0,5% от массы абсолютно-сухого волокна. При этом развитие грибов на агаре вокруг образца было интенсивным. При увеличении содержания дигидрофторида диметиламина в бумажном диске до 1% отмечена стерильная зона вокруг обработанного образца размером 5-Ю мм. Таким образом, установлены минимальные действующие концентрации дигидрофторида диметиламина, вызывающие торможение роста гри бб бов по сравнению с контролем: 10,0 мкг/мл для Penicillium purpurogenum и 50 мкг/мл для Aspergillus niger. Подавление спо-роношения грибов происходит в интервале концентраций 50,0 - 200,0 мкг/мл для Penicillium purpurogenum и 100,0-225,0 мкг/мл для Aspergillus niger. Полное подавление роста грибов Penicillium purpurogenum происходит при концентрации 225,0 и Aspergillus niger - 250,0 мкг/мл. По-видимому, дигидрофторид диметиламина уг нетает два процесса развития грибов: рост мицелия и образование спор. 4.2. Исследование фунгистатической активности полифторированных функциональных алифатических соединений Исследована фунгистатическая активность полифторированных спиртов, кислот, аммонийных солей, амидов и анилидов полифторированных кислот в количестве 29 соединений по отношению к Aspergillus niger,Penicillium purpurogenum. Активность соединений исследована в интервале концентраций 10,0-2000 мкг/мл, всего 10 концентраций каждого соединения. Испытание активности проводили по методикам, описанным в методической части и разделе .4.1. Наблюдения показали, что полифторированные функциональные алифатические соединения слабо подавляют рост грибов. Исходя из этого мы представили результаты опытов в виде ЭД д - дозы соединений, вычисленной статистически на основании 4-5 концентраций, подавляющих рост Aspergillus niger:,от 100 до 8%{таблица 6). Наиболее низкой оказалась фунгистатическая активность перфорированных спиртов, которая проявлялась в концентрациях 1000 - 2000 мкг/мл в слабом подавлении спороношения. В концентрации 2000 мкг/мл на 7-е сутки происходила задержка роста и спороноше 67 Таблица б Фунгистатическал активность полифторированных функциональных алифатических соединений по отношению .к Aspergillus niger СЕ СЄ натрия к ЭДзд в мкг/мл определена статистически по методу Першина (Беленький, 1963) на основании 4-5концентраций, дающих подавление спор от 100 до 8f0. ния грибов по сравнению с контролем, где рост был интенсивным. На средах, содержащих перфорированные спирты,колонии .-Aspergillus niger достигали 30 мм, в контроле же колонии имели диаметр 35-38 мм. ЭДсгл перфторированных спиртов составила 4900-7812 мкг/мл. Среди перфторированных кислот фунгистатическая активность обнаружена :у перфгорпропионовой кислоты1, вызывающей слаб о е подавление роста и спороношения грибов в концентрации 1000 мкг/мл. ЭД перфторпропионовой кислоты составила 2312 мкг/мл. Перфтормасля-ная, перфторбензойная и перфторциклогексакарбоновая кислоты практически не обладают фунгистатическим действием. В связи с выявленным нами фунгистатическим действием перфторпропионовой кислоты представляло интерес выявить фунгистатичес-кую активность некоторых ее производных. Амиды перфторпропионо-вых кислот обнаружили фунгистатическую активность, близкую к активности соответствующих кислот. Так, ЭД амида 2,2,3,3-тетра-фторпропионовой кислоты по отношению к Aspergillus niger составила 3187 мкг/мл. Полученные нами результаты о близкой фунгистатической активности фторзамещенных жирных кислот и их соответствующих амидов по отношению к Aspergillus niger и Penicillium purpurogenum согласуются с данными Гершона. ( Gershon, 1970), полученными им по отношению к Aspergillus niger,Trichoderma viride и Myrothecium verrucaria. При этом наибольшая фунгистатическая активность достигается при длинах цепи 5-6 атомов углерода для обоих рядов соединений .
Изучение влияния фунгицидов на накопление биомассы грибами при поверхностном и глубинном культивировании
Образование биомассы грибами в виде дерновинок различного цвета на поверхности влажных целлюлозных полуфабрикатов происходит в значительном количестве. Исходя из высокой активности грибов Trichouerma viride и Penicillium purpurogenumKpocTy на целлюлозных полуфабрикатах мы использовали культуры этих грибов, выделенных нами из пораженной древесной массы, в своих опытах для изучения влияния фунгицидов на накопление биомассы. В опытах также использовали гриб Aspergillus niger. Культивирование грибов проводили периодическим способом в поверхностных и глубинных условиях (на качалке) в течение 14 и 5 суток (соответственно) на среде Чапека-Докса с глюкозой или фильтровальной бумагой, с добавлением фунгицидов и без них. Фунгициды вводили в среду одновременно с засевом грибов. Съем биомассы грибов производили на 14 сутки при поверхностном культивировании и на 6-е сутки - при глубинном.
Количественное определение образовавшейся биомассы грибов без внесения фунгицидов показало, что рост происходит по параболической кривой и не отличается существенно от кривой, описанной Моно. При поверхностном культивировании образование дерновинок грибов происходило на 4-5 сутки роста на среде с использованием глюкозы как источника углерода и на 6-7 сутки на среде с использованием целлюлозы. Учет выросшей за 14 суток биомассы гриба Aspergillus niger показал, что гриб накапливает наибольшее количество биомассы по сравнению с другими взятыми нами грибами, которое составило 0,9 г абсолютно сухой массы на 100 мл среды при использовании глюкозы как источника углерода. В этих же условиях гриб Trichoderma viride накапливает до 0,6 г и Penicillium purpurogenum - ДО 0,3 г сухой биомассы. Аналогичное количество биомассы накапливают грибы при использовании фильтровальной бумаги в качестве источника углерода.
При добавлении к питательной среде фунгицидов мы наблюдали торможение роста грибов, которое проявлялось в задержке роста гриба, а также в снижении накопления биомассы по сравнению с контролем. Обработанные статистическим методом результаты опытов определения биомассы грибов, образовавшейся в присутствии фунгицидов и без них при 14-суточном культивировании, приведены на рис. 2 и таблицах 16, 17, 18, 19. Из взятых нами галоидеодержащих фунгицидов наибольшее подавление синтеза биомассы грибов наблюдается при воздействии дихлортрифторфенолята калия (см. рис. 2 и табл. 16). Торможение синтеза биомассы грибов в интервале изученных концентраций (1,0 - 50,0 мкг/мл) составляет от 53 до IOOf.
Уменьшение количества атомов хлора в молекуле фенолята приводит к снижению фунгицидного действия по сравнению с дихлортрифтор-фенолятом. Однако действие хлортетрафторфенолята калия является фунгицидным в концентрации 50,0 мкг/мл и фунгистатическим в интервале концентраций 1,0-25,0 мкг/мл для испытанных нами грибов Penicillium purpurogenum,0!richoderma viride и Aspergillus niger.
Активным фунгицидным действием обладает АФПК, подавляющий накопление биомассы у грибов в интервале концентраций от 1,0 --25,0 мкг/мл на 38-92%. При концентрации препарата в среде 50,0 мкг/мл грибы не развивались. При испытании хлорфторфенольных соединений на жидкой среде подтверждается аналогичное действие данных препаратов на грибы, установленное нами ранее при испытании на твердых средах. Так, в присутствии низких концентраций (1,0-5,0 мкг/мл) хлортетрафторфенолята и дихлортрифторфенолята калия гриб Aspergillus niger образует на поверхности жидкой среды на 7-е сутки отдельные колонии с диаметром 10-12 мм и бесплодным мицелием, в то время как в контроле к этому сроку образуется плотная морщинистая пленка с воздушным спороносным мицелием по всей поверхности среды. Присутствие в среде хлортетрафторфенолята калия в концентрации 5,0 мкг/мл приводило к задержке спороношения на 6-7 суток, в случае же пентахлорфенолята натрия - 7-9 суток в сравнении с контро 0,3 Масса cvxoro мицелия 7 г/ЮОмл. При дальнейшем культивировании гриба в среде, содержащей 5,0 мкг/мл фунгицида, интенсификации спороношения не наступало. Аналогичный характер воздействия на рост грибов отмечен в присутствии АЗШК. Торможение роста грибов 4-бром-4,4-динитромасляной кислотой начиналось в концентрации 5,0 мкг/мл и проявлялось в снижении накопления биомассы на 32-50%, усилении выделения пигмента и экссудата у Penicillium purpurogenum. В сублетальной концентрации 100,0 мкг/мл подавление синтеза биомассы составило 94,6 у Aspergillus niger, (табл. 16), 82-83% - у грибов Irichoderma viride и Penicillium purpurogenum (рис. 2). Обращает на себя внимание интенсивное выделение пигмента грибом Penicillium purpurogenum в результате чего культуральная жидкость окрашивалась в тёмнокрасный цвет. При увеличении концентрации 4-бром--4,4-динитромасляной кислоты до 150,0 мкг/мл накопления биомассы не наблюдалось.
Подавление накопления биомассы грибов на 94% к контролю ди-гидрофторидом диметиламина отмечено в сравнительно высокой концентрации 200,0 мкг/мл. В интервале концентраций 150,0-200,0мкг/мл рост грибов Aspergillus niger и Penicillium purpurogenum оставался бесплодным в течение 30 суток. При снижении концентрации препарата до 100,0 мкг/мл происходила задержка (на 7-Ю суток) спороношения у Aspergillus niger в сравнении с контролем.
Ранее (глава 4) нами показано, что оловоорганические соединения начинают тормозить рост грибов при культивировании на твердых средах в низкой концентрации, равной 0,01 мкг/мл и полностью подавляют его в концентрации 5,0 мкг/мл. При культивировании на жидкой среде торможение роста грибов также как и при росте на твердой среде начинается при концентрации 0,01 мкг/мл и проявля 99 ется в задержке роста на 1-2 суток и подавлении накопления биомассы на 10-20% в сравнении с ростом грибов в контроле. Наиболее сильное подавление синтеза биомассы в данной концентрации отмечено в присутствии ТБТО, которое составило 17-20% у Penicillium purpurogenum и Trichoderma viride (см. табл. 17) и до 34% у Aspergillus niger (см. табл. 18). В сублетальных концентрациях (1,0-2,0 мкг/мл) подавление накопления биомассы Penicilliura purpurogenum составило 82-96% при воздействии ТБТО и 80-85% при воздействии фумарата. При добавлении к среде N-цетилпиридиний хлорида ингибирую-щий эффект оловоорганических соединений усиливается и приводит к резко выраженному подавлению синтеза биомассы уже при низких концентрациях оловоорганического соединения в смеси. Так, при содержании в среде 0,1 мкг/мл фумарата подавление накопления биомассы Trichoderma viride составило 48%, с добавлением в среду 10,0 мкг/мл N-цетилпиридиний хлорида ингибиругощий эффект составил 97% к контролю. Рассматривая представленными данные, можно заключить, что в случае смесей оловоорганических соединений и N-цетилпиридиний хлорида имеет место синергизм фунгицидного действия. N-Цетилпиридиний хлорид в концентрации 100,0 мкг/мл подавлял накопление биомассы грибов на 10% от контроля. При повышении концентрации N -цетилпиридиний хлорида в среде до 500,0 мкг/мл подавление накопления биомассы усиливалось и составило 20% в случае Trichoder-гаа viride (табл. 17).
