Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Молекулярные механизмы лизоцим резистентности и антилизоцимнои активности бактерий (обзор литературы) 10
1.1. Неспецифические механизмы лизоцимрезистентности бактерий 12
1.1.1. Экранирование пептидогликана 12
1.1.2. Модификация пептидогликана 12
1.1.3. Секреция неспецифических ингибиторов 14
1.2. Специфические ингибиторы лизоцима белковой природы 16
1.2.1. Анионный термостабильный ингибитор 16
1.2.2. Ингибитор лизоцима позвоночных 16
1.2.3. Периплазматический и мембраносвязанный ингибиторы лизоцима 20
1.3. Регуляция продукции специфических ингибиторов лизоцима 23
Глава 2. Материал и методы исследования 28
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе 28
2.2. Методы исследования профиля генетических детерминант ингибиторов лизоцима у исследуемых энтеробактерий 28
2.2.1. Методы и средства, использованные для филогенетического анализа и конструирования специфичных праймеров генетических детерминант ингибиторов лизоцима 28
2.2.2. Метод ПЦР-скрининга генетических детерминант ингибиторов лизоцима 30
2.2.3. Методики анализа плазмидной ДНК 31
2.3. Методы изучения ряда биологических свойств энтеробактерий 34
2.3.1. Определение профиля антибиотикорезистентности 34
2.3.2. Метод выявления лизоцимрезистентности энтеробактерий 34
2.3.3. Определение уровня антилизоцимной активности 35
2.3.3.1. Чашечный метод 35
2.3.3.2. Фотометрический метод 36
2.3.3.3. Метод определения сорбционного компонента АЛА 38
2.4. Способы регуляции антилизоцимной активности бактерий 39
2.4.1. Методы стимуляции антилизоцимной активности 41
2.4.2. Методы ингибирования антилизоцимной активности 42
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов 43
Глава 3. Анализ генетических детерминант секретируемьгх ингибиторов лизоцима энтеробактерий 44
3.1. Анализ последовательностей гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима 45
3.2. Филогенетический анализ геноврНС и ivyC энтеробактерий 49
3.3. Конструирование ПЦР тест-систем для выявления генов секретируемых ингибиторов лизоцима 53
3.4. Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима 57
3.5. Анализ плазмидного профиля исследуемых штаммов энтеробактерий 62
Глава 4. Лизоцимрезистентность и антилизо-цимная активность различных штаммов энтеробактерий 65
4.1. Общая антилизоцимная активность энтеробактерий, (чашечный метод) 65
4.2. Характеристика экскретируемого компонента антилизоцим ной активности энтеробактерий (фотометрический метод) 68
4.3. Характеристика сорбционного компонента антилизоцимной активности энтеробактерий, (фотометрический метод) 70
4.4. Скрининг лизоцимрезистентности энтеробактерий в комбинированной среде 72
Глава 5. Регуляция антилизоцимной активности штаммов энтеробактерий с различным генетическим профилем 77
5.1. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием хлорамфеникола 78
5.2. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием акридоновых соединений 80
5.3. Изменение антилизоцимной активности у энтеробактерий, отличающихся по присутствию pliC-мегаплазмид под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого 82
5.4. Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности 85
Заключение 89
Выводы 99
Список литературы 100
Список сокращений 113
- Ингибитор лизоцима позвоночных
- Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима
- Скрининг лизоцимрезистентности энтеробактерий в комбинированной среде
- Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности
Ингибитор лизоцима позвоночных
На данный момент описаны как минимум три таких системы ингибиторов: анионный термостабильный ингибитор, ингибитор лизоцима позвоночных С-типа, известный как белок Ivy, и периплазматический либо мембраносвязанный ингибитор лизоцима С-типа, имеющий в базах данных названия РИС и МНС соответственно. Обе эти системы достаточно широко распространены среди грамотрицательных бактерий, имеющих либо одну, либо другую, либо обе системы сразу. При этом достаточно фундаментальных филогенетически-обусловленных закономерностей в распространенности этих генов, например, в пределе типа Proteobacteria не выявлено.
Первая работа, направленная на поиск секретируемого соединения, обеспечивающего анти-лизоцимную активность у бактерий, привела к выделению из супернатан-тов бульонных культур условно-патогенных энтеробактерий разных родов конститутивно секретируемого анионного белка массой 21 кДа, способного специфически ингибировать ферментативную активность лизоцима путем необратимого связывания с его нативными молекулами. Выделенный белок был термостабилен, но чувствителен к действию трипсина (Соколов В.Ю., 1990).
В 2001 году, в ходе работ по исследованию «генов-сирот» с неизвестными функциями в базе данных нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК Е. coli была выявлена генетическая детерминанта хромосомной локализации, белковым продуктом которой явился специфический ингибитор лизоцима позвоночных, получивший название Ivy.
Ген ivy у Е. coli имеет длину 474 нуклеотида и является частью одногенного оперона, демонстрируя высокий уровень экспрессии во время экспоненциальной и стационарной фаз роста микроорганизмов. Для его белкового продукта показано наличие N-концевого сигнального пептида. Определены и физико-химические свойства Ivy: при физиологических условиях этот белок с молекулярной массой 15,04 кДа является гомодимером с сильной афинностыо к лизоциму С-типа, а ферментативные исследования показали способность Ivy ингибировать куриный и человеческий лизоцимы С-типа путем специфического взаимодействия (Monchois V. et al., 2001).
Через комплексообразование IvyC/HEWL активный участок лизоцима закрывается петлей из 6 аминокислотных остатков, выступающих из молекулы Ivy. В центре этой петли остаток гистидина (Н60) образует водородные связи с двумя из трех аминокислотных остатков, ответственных за ферментативную деятельность лизоцима. Конформационных изменений образующих комплекс молекул при этом не происходит. Установлено, что наиболее выраженной функциональной активностью обладают варианты Ivy, данная гексапептидная петля которых имеет последовательность CKPHDC. (Abergel С. et al., 2007)
В качестве подтверждения значимости Ivy в защите бактерии от лизоцима, были проведены исследования сопротивляемости Е. coli бактерицидному эффекту лизоцима в присутствии средств, повышающих проницаемость наружной мембраны. И в присутствии лактоферрина (3.0 мг/мл) и под высоким гидростатическим давлением (250 МПа) устойчивость к лизоциму Е. coli уменьшилась после нокаута гена ivy, и увеличилась при его сверхэкспрессии. Однако нокаут ivy увеличивал чувствительность к лизоциму не всех штаммов Е. coli (Deckers D. et al., 2004).
Специфичность ингибирующего действия белка Ivy была изначально проверена при смешивании с хитиназой, достоверного влияния на активность которой выявлено не было (Monchois V., 2001). Более детальное определение спектра ингибирующего действия было проведено при сравнении уровня ингибирования различных типов лизоцима: С-типа из куриного яичного белка, G-типа из гусиного яичного белка и G-типа из лосося; который был наибольшим для первого случая, несколько сниженным для второго и практически отсутствовал в случае лизоцимов G-типа, продуцируемых морскими позвоночными. Данные молекулярных исследований в эксперименте in vitro позволили расшифровать стереохимические особенности в организации активных центров лизоцимов С и G-типов и ингибирующей области белка Ivy, и возможностей их комплементарной стыковки (Kyomuhendo Р., 2008).
Кроме вышеперечисленных исследований осуществлен анализ филогенетического распространения IvyC с использованием всех публично доступных сиквенсных данных, включая полные последовательности бактериальных геномов и данные из продолжающихся проектов секвенирования. В общей сложности было выявлено 35 различных Ivy-подобных последовательностей. В результате гомологи Ivy обнаружены только среди типа Proteobacteria, и для всех из них предсказана периплазматическая локализация данного белка. (Abergel С. et al., 2007).
С одной стороны, может казаться логичным, что белки Ivy колокализованы с пептидогликановым компонентом клеточной стенки (субстратом лизоцима) в пределах периплазматического пространства. С другой стороны, пептидогликановая сеть, как отмечено ранее, физически ограждена от повреждения экзогенными ферментами и наружной мембраной Proteobacteria и не считается естественной мишенью для лизоцима. Присутствие гена, кодирующего ингибитор лизоцима у грамотрицательных, а не грамположительных бактерий представлялось, таким образом, парадоксом.
На сегодняшний день семейство белков Ivy более всего представлено в классах Gamma и Beta типа Proteobacteria, но два гомолога Ivy были однозначно идентифицированы в двух несвязанных видах класса Alpha: Parococcus denitrificans и Gluconobacter oxydans. В пределах классов гамма и бета, гомологи Ivy распределены спорадически. Например, гомологи белка Ivy присутствуют во всем порядке Enterobacteriales, кроме рода Salmonella, но также найдены во всех секвенированных геномах микроорганизмов семейства Pseudomonadaceae. Также в классе Beta, гомологи белка Ivy найдены во всем роде Burkholderia, идентифицированы в единственном виде у Neisseriaceae, и отсутствуют во многих других секвенированных геномах этого класса. Такое спорадическое распределение семейства белков Ivy говорит о сложном пути эволюционной истории, состоящем из различных генных потерь среди таксонов, в сочетании с событиями горизонтальных переносов, о чем говорит детальный филогенетический анализ. За исключением класса Alphaproteobacteria, большинство разновидностей, несущих ортологи Ivy, являются патогенными или условно-патогенными микроорганизмами для человека или других позвоночных животных (Abergel С. et al., 2007).
Наиболее хорошо идентифицированные члены семейства белков Ivy, включая самые близкие гомологи Ivy Е. coli, показывают абсолютно точное сохранение аминокислотной подпоследовательности CKPHDC. Этот структурный мотив точно совпадает с лизоцим-ингибирующей петлей, идентифицированной в сложной трехмерной структуре ITEWL/Ivy и функциональных исследованиях мутантов петли Ivy. Кроме того, исследования ортолога белка Ivy P. aeruginosa показали, что он, в отличие от Ivy Е. coli проявляет свою функциональную активность в виде мономера, но при этом несколько менее выраженную (Abergel С. et al., 2007). Однако, проведенные затем исследования с натуральными секретами, богатыми лизоцимом, такими как слюна, грудное молоко и белок куриного яйца показали, что нокаут гена ivy значительно снижает выживаемость Е. coli, но практически не влияет на рост культур P. aeruginosa (Deckers D., 2008), что, вкупе с отсутствием гомологов ivy у таких безусловных патогенов человека и других млекопитающих, как род Salmonella и семейство Vibrionaceae, а также у всех заведомо чувствительных к лизоциму грамположительных бактерий (Abergel С. et al., 2007), на фоне отсутствия специальных широкомасштабных функциональных исследований неизбежно подводит к мысли о существовании других семейств белков-ингибиторов лизоцима.
Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима
Разработанные нами тест-системы для ПЦР-анализа, после отладки на модельных и некоторых клинических штаммах, были применены для проведения скрининга на наличие генов секретируемых ингибиторов лизоцима.
При исследовании на наличие гена ivyC у Е. coli, отрицательные результаты показали только три штамма: Е. coli 243, 251 и 254 (рис. 10), что составило 6±3% всех исследованных культур кишечной палочки.
Изучение распространенности генетических детерминант ингибтора лизоцима этого семейства у клебсиелл показало аналогичные результаты, однако доля ivyC-негативных штаммов была заметно выше: 20±5,5%. На рис. 11 показана фореграмма результата ПЦР-анализа ряда штаммов клебсиелл с наибольшим количеством ivyC-отрицательных результатов, которые, в данном случае, демонстрируют штаммы К. pneumoniae 261, 270, 271.
Подчеркнуты индексы штаммов энтеробактерий других видов, использованных в качестве контролей. Указатель «100 bj)» соответствует маркеру молекулярных масс.
Индекс штамма указан в верхней части дорожек.
Подчеркнуты индексы штаммов энтеробактерий других видов, использованных в качестве контролей. Указатель «100 bg» соответствует маркеру молекулярных масс. Картина, подобная вышеописанной у Е. coli, выявлена и в отношении хромосомных гомологов гена рНС у S. enterica, где доля /?//С-негативных сальмонелл составила 8±3,5%. Результат ПЦР-анализа части исследованных штаммов сальмонелл представлен на фореграммах рис. 12, где показаны два р/г С-негативных штамма: S. enterica S10 и S13 (рис. 12Ь).
Исследование распространенности гомологичной детерминанты у клебсиелл дало ожидаемо обратный результат вследствие хромосомной локализации гомолога генар/г С у К. pneumoniae: /?//С-позитивные штаммы составили всего 20%, как и в случае с ivyC-негативными вариантами представителей данного вида условно-патогенных энтеробактерий (рис. 12). Следует, однако, отметить, что все выявленные / /г С-положительные штаммы клебсиелл (К. pneumoniae 275, 276, 277, 278) также показали положительный результат и на наличие хромосомного гена ivyC.
Подчеркнуты индексы штаммов энтеробактерий других видов, использованных в качестве контролей. Указатель «100 Ьр» соответствует маркеру молекулярных масс.
Скрининг исследуемых штаммов на наличие известных гомологов генов секретируемых протеаз семейств espP и eatA положительных результатов не показал.
Таким образом, цикл работ по ГЩР-скринингу гомологов генов ivyC и pliC позволил нам составить целостную картину распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима трех видов среди наиболее часто встречаемых условно-патогенных и патогенных видов энтеробактерий человека (рис. 14).
Скрининг лизоцимрезистентности энтеробактерий в комбинированной среде
Определение чувствительности энтеробактерии к лизоциму по схеме определения чувствительности к любому низкомолекулярному антибиотику неприменимо, поскольку интактные энтеробактерии, будучи грам-отрицательными микроорганизмами, имеют наружную мембрану над поверхностью пептидогликана, которая в норме полностью непроницаема для крупномолекулярных соединений, включая молекулу лизоцима. Это затруднение может быть разрешено путем внесения дополнительных факторов, повышающих проницаемость наружной мембраны. Данные факторы, однако, не должны существенным образом влиять на ферментативную активность лизоцима, поэтому соединения, существенно изменяющие рН среды (сильные кислоты, щелочи), а также грубые детергенты на основе ПАВ (додецилсульфат натрия, N-лауроилсаркозил натрия) для данной цели неприменимы.
В то же время стабильность липополисахаридного компонента наружной мембраны зависит от присутствия в среде двухвалентных катионов, которые могут быть связаны с помощью хелатирующих соединений. (Ellison, R.T., 1990). Поэтому единственным доступным методом для нас стало использование комбинированной бессолевой среды с добавлением три-лона Б в качестве хелатора. В ходе пилотных экспериментов нами был установлен диапазон концентраций трилона Б, который в сочетании с различными концентрациями лизоцима оказывал бактериостатическое действие на исследуемые виды энтеробактерии и составил 10 тМ.
В результате проведенного скрининга установлено, что МПК лизоцима у исследуемых штаммов энтеробактерии не зависела от наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима и определялась видовой принадлежностью штамма (рис. 22, рис. 23).
В целях сопоставления получаемых данных с работами других авторов (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004) нами было проведено сравнение наличия генов ингибиторов лизоцима с плазмидным профилем и исследуемыми стенотипическими параметрами: профилем антибиотикорези-стентности и уровнем АЛА. Среди исследуемых штаммов энтеробактерий плазмиды в диапазоне до 30 тысяч н.п. значительно чаще выделялись у по-лиантибиотикорезистентных штаммов Е. coli, которые показали наибольшее разнообразие резистоваров, тогда как все исследуемые штаммы клеб-сиелл имели устойчивость только к ампициллину, а сальмонеллы наличия антибиотикорезистентности не демонстрировали. В то же время корреляция наличия искомых генов с наличием малых плазмид и устойчивостью к антибиотикам не отмечена.
В результате проведенного нами исследования антилизоцимного фенотипа у штаммов с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима показано, что присутствие в геноме гомологов гена ivyC у исследованных штаммов Е. coli соответствует уровню антилизо-цимной активности, не превышавшему 2 мкг/мл, тогда как присутствие гомологов данного гена в геноме К. pneumoniae не было сопряжено с уровнем АЛА и выявленные ivyC-негативньте штаммы К. pneumoniae демонстрировали такой же уровень признака как и ivyC-позитивные варианты. Штаммы Е. coli и S. enterica, не содержащие известных гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима показали минимальный уровень данного параметра, измеряемого как стандартным чашечным так и фотометрическим методом, тогда как наличие плазмидного гена pliC как у сальмонелл, так и у клебсиелл соотносилось с существенно более высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.
Анализ сорбционного компонента АЛА показал, что у энтеробактерий всех исследованных видов, не зависимо от наличия в их геноме гомологов одного либо другого известного гена секретируемого ингибитора лизоцима, данный фенотипический признак не различался и составлял в среднем 1,2±0,4 мкг/мл инактивированного лизоцима, и максимальные значения, демонстрируемые отдельным штаммами не превысили 2 мкг/мл инактивированного лизоцима.
Полученные данные подтверждают экскреторный характер различий исследуемого фенотипического признака, выявленных с использованием предыдущих методов и указывают на тот факт, что определение антилизоцимной активности у энтеробактерий исследуемых видов чашечным методом также отражает преимущественно экскреторный его компонент.
Попытка определения степени устойчивости к лизоциму штаммов, отличающихся по присутствию в геноме гомологов различных генов секретируемых ингибиторов лизоцима выявила только межвидовые различия, продемонстрировав существенно более высокий уровень резистентности к комбинации «хелатор+лизоцим» у представителей вида К. pneumoniae не зависимо от наличия генов того или иного семейства ингибиторов лизоцима.
Это наблюдение указывает на преимущество несекреторных механизмов для выживания энтеробактерий в лизоцимнасыщенной среде, особенно если принять во внимание тот факт, что бактерицидный эффект лизоцима не исчерпывается его ферментативной активностью (During, К. et al., 1999).
Выявленные различия в уровне антилизоцимной активности штаммов, отличающихся по наличию гена pliC и отсутствие существенной разницы в данном фенотипическом признаке между ivyC-позитивными и ivyC-негативными штаммами Е. coli и К. pneumoniae подтверждает предположение о ведущей роли гена рНС в дистантном ингибировании лизоцима.
Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности
Проведенное на заключительном этапе изучение влияние эффекта пептидогликанового стресса, вызванного с помощью р-лактамного антибиотика ампициллина, на уровень антилизоцимной активности штаммов, различающихся по профилю наличия генетических детерминант ингибиторов лизоцима семейств ivyC и pliC, не выявило достоверных изменений выраженности антилизоцимного признака среди исследуемых групп энте-робактерий (рис. 29).
Исследование динамики данного параметра в условиях пептидогликанового стресса под влиянием ампициллина, в сочетании с действием бак-териостатических концентраций хлорамфеникола, характеризовалось аналогичным результатом, также не позволяющим выявить наличие стимулирующего эффекта пептидогликанового стресса на количество экскрети-руемых внеклеточно ингибиторов лизоцима у энтеробактерий, различавшихся по генетическому профилю в отношении исследуемых детерминант специфических секретируемых ингибиторов лизоцима (рис. 30).
Расхождение полученных негативных результатов с работами, указывавшими на стимулирующий характер пептидогликанового стресса на продукцию секретируемых ингибиторов лизоцима (Callewaert L. et al., 2009), вполне объяснимо с учетом того, что методы исследования антилизоцимной активности направлены на оценку суммарного количества ингибиторов лизоцима, экскретируемых за пределы бактериальной клетки, тогда как в предыдущих работах, посвященных секретируемым и мембра-носвязанным ингибиторам семейств ivyC и mliC/pliC, в качестве исследуемого материала использован периплазматический экстракт клеток энтеробактерий (Callewaert L. et al., 2005).
Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемых видов энтеробактерий с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима (рис. 5А) выявило наиболее существенное изменение признака под воздействием данных препаратов у штаммов S. enterica и К. pneumoniae, содержащих гомологи гена рНС и менее выраженную динамику исходных значений антилизоцимной активности энтеробактерий, содержащих в генотипе только гомологи гена ivyC.
Проведенное исследование динамики копийности плазмид и антилизоцимной активности в присутствии вышеуказанных плазмид-ассоциированных регуляторных факторов у Е. coli и К. pneumoniae показало нарастание числа копий пДНК с увеличением концентрации хлорамфе-никола до бактериостатической в 1,3 раза.
Исследование динамики показателя у указанных штаммов под воздействием акридинового оранжевого выявило снижение копийности плазмид вплоть до полного отсутствия регистрируемых количеств пДНК уже при достижении начальной ингибиторной концентрации препарата. В то же время вторичное исследование получаемых клонов показывало сохранность плазмид в бактериальных клетках, что свидетельствовало об адаптированности штамма бактерии-хозяина к наличию плазмид с ослабленным контролем репликации (BoumaJ.E., Lenski R.E., 1988; Ганусов, В.В.,2001).
Внесение в среду культивирования акридонуксусной кислоты в виде препарата «Циклоферон» в концентрации до 5 мг/мл не вызывало значимого изменения количества плазмид.
Определение динамики антилизоцимной активности исследуемого штамма при действии акридинового оранжевого выявило сходную картину: при повышении концентрации акридинового оранжевого до уровня начальной ингибирующей концентрации происходило уменьшение уровня
антилизоцимной активности до нулевых значений. Под действием препарата «Циклоферон» также наблюдалось снижение значений антилизоцим-ного признака вплоть до полного его отсутствия.
Ингибирование числа копий плазмидной ДНК и уровня антилизоцимной активности под действием акридинового оранжевого и повышение данных показателей после воздействия хлорамфеникола у исследованных штаммов не зависимо от видовой принадлежности и плазмидного профиля, а также при наличии генов секретируемых ингибиторов лизоцима любого из двух известных типов подводит к выводу о комплексном характере действия исследуемых препаратов на различные анаболические системы бактериальной клетки, которое реализуется, возможно, через неспецифическое изменение интенесивности синтеза и деградации нуклеиновых кислот аппарата трансляции (J Midgley., W.Gray, 1971; V. Shen, Н. Bremer, 1977).
Уменьшение уровня антилизоцимной активности под действием «Циклоферона» при отсутствии влияния его на копийность плазмид показывает, что механизм регуляции персистентных свойств препаратом «Циклоферон» находится не на уровне генотипа и не может быть обусловлен уменьшением «дозы генов», локализующихся в плазмидах с нестрогим контролем репликации.
Попытка стимуляции секреции внеклеточных ингибиторов лизоцима методом пептидогликанового стресса, вызванного Р-лактамным антибиотиком, не привела к достоверному изменению выраженности антилизо-цимного признака, что согласуется с данными как ранних работ по священных регуляции антилизоцимного фенотипа (В.Ю. Соколов, 1990, О.В. Бухарин, 1999), так и с точки зрения характеристики конкретных секретируемых ингибиторов семейства ivyC, основной пул которого локализуется в периплазматическом пространстве энтеробактерии, и семейства рНС, зависимость продукции которого от стресс-регуляторной системы Res до настоящего момента не показана.
