Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ. 12
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
Глава I. Восстановление Fe(III) прокариотами 16
Типы микробной железоредукции 16
Железоредуцирующие микроорганизмы 20
Восстановление Fe(III) термофильными прокариотам 24
Распространение термофильных железоредукторов 24
Филогения термофильных железоредукторов 27 Глава II. Физиология восстановления Fe(III) прокариотами 29
1. Ассимиляция Fe(III) прокариотами 29
Импорт и запасание Fe(III) 29
Ассимиляционные железоредуктазы прокариот 31
2. Fe(III) в катаболических процессах 34
2.1. Доноры электронов, используемые при восстановлении Fe(III) у прокариот с
различным типом метаболизма 34
Сбраживаемые углеродные субстраты 34
Несбраживаемые органические кислоты и спирты 36
Другие полностью окисляемые органические соединения 38
Молекулярный водород 39
Другие неорганические доноры электронов 40
2.2. Альтернативные акцепторы электронов, используемые прокариотами,
диссимиляционно восстанавливающими Fe(III) 41
2.3. Формы Fe(III), восстанавливаемые микроорганизмами в катаболических
процессах 47
Глава III. Биохимия диссимиляционного восстановления Fe(III) прокариотами 53
Стратегии диссимиляционного восстановления нерастворимых форм Fe(III) 53
Транспорт электронов к Fe(III) при его диссимиляционном восстановлении 58
2.1. Транспорт электронов к Fe(III) у бактерий родов Shewanella и Geobacter 59
Особенности транспорта электронов к Fe(III) у представителей рода Shewanella 64
Особенности транспорта электронов к Fe(III) у представителей рода Geobacter 66
2.2. Железоредуктазная активность Clostridium beijerinckii 70
3. Описанные железоредуктазные активности термофилов 71
Железоредуктаза Archaeoglobus fulgidus 72
Железоредуктазные активности представителей рода Pyrobaculum 74 Глава IV. Восстановление хрома(У1), технеция(УП) и урана(У1) железовос-станавливающими прокариотами 77
Восстановление хрома 79
Восстановление технеция 83
Восстановление урана 86
Восстановление Cr, U и Тс термофильными железоредукторами 90 Резюме 92 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 94 Глава I. Материалы и методы исследования 94
Объекты исследования 94
Состав сред и условия культивирования 95
Состав сред для Carboxydothermus ferrireducens и Thermoanaerobacter siderophilus 95
Состав сред для остальных микроорганизмов 97
Посевной материал и условия культивирования 98
Оценка роста 99
Получение клеточных суспензий 100
Определение железовосстанавливающей активности С. ferrireducens 101
Исследование восстановления Cr(VI), Tc(VII) и U(VI) клеточными суспензиями 102
Определение ферментативных активностей 104
Железоредуктазная активность 104
Флавин-редуктазная активность 105
СО-дегидрогеназная активность 105
НАД(Ф)Н-оксидазная активность 105
Спектрофотометрическое определение цитохромов и оксидоредуктазной активности 106
Экстракция белков поверхностного слоя клеточной стенки С. ferrireducens 107
Очистка Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей 108
Гель-электрофорез 110
Аналитические методы 111
Электронная микроскопия 113 Глава П. Физиология литоавтотрофного и органотрофного роста С. ferrireducens в присутствие Fe(III) 114
Литоавтотрофный рост С. ferrireducens с Fe(III) в качестве акцептора электронов 115
Влияние Fe(III) на органотрофный рост С. ferrireducens 116
2.3. Влияние молекулярного водорода на органотрофный рост С. ferrireducens в
отсутствие Fe(III) 118
Глава III. Физиологические стратегии восстановления нерастворимых форм Fe(III)
C.ferrireducens 127
Влияние внешних переносчиков электронов и хелаторов Fe(III) на рост C.ferrireducens с ферригидритом и его восстановление 127
Использование сидерофора при диссимиляционном восстановлении ферригидрита C.ferrireducens 131 Глава IV. Биохимические механизмы восстановления Fe(III) у С. ferrireducens 141
Наличие цитохромов с-типа у С. ferrireducens 141
Ингибиторный анализ глицерин-зависимой ферригидрит-восстанавливающей активности клеточных суспензий С. ferrireducens 141
Локализация Ре(Ш)-восстанавливающей активности С. ferrireducens 142
Выделение и очистка мембраносвязанных НАД(Ф)Н-зависимых Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей С. ferrireducens 144
Нативный и ДСН-ПААГ-электрофорез очищенных Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей 145
Биохимические свойства очищенных Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей 145
Спектрофотометрические исследования очищенных НАД(Ф)Н-зависимых Ре(Ш)-ЭДТА-редуктазных активностей 146 Глава V. Восстановление хрома(УІ) С. ferrireducens 156
Проверка способности растущих культур С. ferrireducens к восстановлению хромаг(УІ) 156
Восстановление Cr(VI) клеточными суспензиями C.ferrireducens 156
Сравнение Сг(У1)-восстанавливающей активности клеточных суспензий C.ferrireducens и некоторых термофильных прокариот 157
Глава VI. Восстановление технеция(УП) С. ferrireducens 162
Осаждение растворимого Tc(VII) в результате его восстановления клеточными суспензиями С. ferrireducens 162
Характеристика процесса восстановления Tc(VII) клеточными суспензиями C.ferrireducens 163
Удерживание восстановленного технеция в осадке в присутствии клеток C.ferrireducens 163
Локализация восстановленного технеция 164 Глава VII. Восстановление ypaHa(VI) С. ferrireducens 170
Восстановление U(VI) растущими культурами С. ferrireducens 170
Восстановление U(VI) клеточными суспензиями С. ferrireducens 171
Сравнение активности восстановления U(VI) и других металлов клеточными суспензиями С. ferrireducens 172 Заключение 177 ВЫВОДЫ 180 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 182
Введение к работе
Актуальность работы. Железо - четвёртый по распространённости химический элемент земной коры - может использоваться прокариотами в качестве акцептора электронов в диссимиляционных процессах [Заварзин, 2004]. Микробное восстановление Fe(III) является важным путём окисления органического вещества во многих экосистемах. Биогеохимический цикл железа сопряжён с циклами углерода, кислорода и серы и оказывает значительное экологическое воздействие на современную окружающую среду [Lovley, 1991; Nealson, Saffarini, 1994; Thamdrup, 2000]. Современные гидротермальные экосистемы рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли, и процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов [Заварзин, 2001]. Термофильные железовосстанавливающие прокариоты населяют практически все известные типы термальных систем [Слободкин, 2005]. Согласно существующим гипотезам, диссимиляционное восстановление Fe(III) могло быть первым возникшим типом метаболизма и являться глобально значимым процессом окисления органического вещества в Архее и Протерозое [Walker, 1987; Lovley, 2005].
Изучение физиологических стратегий и биохимических механизмов диссимиляционного восстановления Fe(III) важно для понимания взаимодействий между микробными клетками и минералами в природных условиях, где при нейтральной реакции среды соединения трёхвалентного железа существуют в виде нерастворимых оксидов. Детальные исследования физиологии и биохимии диссимиляционной железоредукции до настоящего времени проводились лишь для представителей мезофильных родов Shewanella и Geobacter, имеющих грамотрицательный тип клеточной стенки. В ходе этих работ были открыты фундаментальные механизмы передачи электронов на нерастворимый акцептор с помощью веществ-переносчиков или электропроводящих пилей, контактирующих с минералом железа [Lovley et ah, 1998;
Newman, Kolter, 2000; Gorby et al, 2006]. К настоящему времени описано более 20 содержащих гем с белков, участвующих в транспорте электронов к Fe(III), однако не известно ни одного фермента, которому может быть приписана функция терминальной железоредуктазы in vivo. Информация о физиологии и биохимии диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами ограничена единичными сообщениями [Vadas etai, 1999; Childers, Lovley, 2001; Feinberg, Holden, 2006].
Многие железоредукторы способны восстанавливать токсичные металлы и радионуклиды (Cr(Vl), Tc(VII), U(VI)) с образованием малорастворимых соединений, что может быть использовано при разработке технологий биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, могут найти применение в современных нанотехнологиях, а также как носители в высокочувствительных методах анализа [Lloyd, 2003; Berensmeier, 2006].
В связи с вышеизложенным, исследования физиологических и биохимических механизмов восстановления Fe(III) термофильными прокариотами представляют научный и практический интерес.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение физиологии роста, а также стратегий и биохимических механизмов восстановления трёхвалентного железа термофильной бактерией Carboxydothermus ferrireducens. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
Исследовать способность С. ferrireducens к устойчивому литоавтотрофному росту с Fe(III) в качестве акцептора электронов и определить кинетические характеристики этого процесса.
Выяснить функции восстановления Fe(III) в метаболизме С. ferrireducens при органотрофном росте.
Изучить физиологические стратегии восстановления нерастворимого оксида Fe(III) и биохимические механизмы диссимиляционной железоредукции.
4. Исследовать способность С. ferrireducens к восстановлению токсичных и радиоактивных металлов переменных валентностей.
Научная новизна. Впервые охарактеризованы физиологические стратегии восстановления нерастворимых форм Fe(III) и мембраносвязанные железоредуктазные активности у микроорганизма с грамположительным типом клеточной стенки, диссимиляционно восстанавливающего железо. Полученные результаты расширяют представления о возможных физиолого-биохимических механизмах восстановления Fe(III) у различных филогенетических групп диссимиляционных железоредукторов.
Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к нерастворимому акцептору. Механизм стимуляции заключается в многократном использовании сидерофора в качестве челночного медиатора, переносящего ион Fe3+. Подобный механизм диссимиляционной железоредукции ранее описан не был.
Впервые продемонстрирована способность термофильных бактерий восстанавливать технеций(УИ), а также использовать уран(УІ) в качестве акцептора электронов для роста.
Практическая значимость. Обнаружена способность С. ferrireducens к восстановлению токсичных и радиоактивных соединений хрома(УІ), технеция(УП) и урана(УІ). Образующиеся восстановленные формы Cr(III), Tc(IV) и U(IV) обладают значительно меньшей растворимостью и могут быть удалены из жидкой среды. Полученные результаты можно использовать при разработке новых технологий очистки горячих радиоактивных стоков, а также биоремедиации подземных захоронений радиоактивных отходов, подверженных саморазогреванию, либо попавших в геотермально нагреваемые зоны.
Полученные сведения о механизмах микробного восстановления нерастворимых форм Fe(III) могут способствовать разработке технологий получения биогенных минералов железа, обладающих особыми магнитными свойствами или характеристиками
поверхности.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: 3"й международный конгресс по экстремофильным микроорганизмам "Extremophiles 2000" (Гамбург, Германия); международная конференция по биологии и биотехнологии термофилов "Thermophiles 2001" (Нью Дели, Индия); международный конгресс "Extremophiles 2002" (Неаполь, Италия); Гй конгресс европейских микробиологов FEMS (Любляна, Словения, 2003); международный конгресс "Extremophiles 2004" (Кеймбридж, Мэриленд, США); 2"й конгресс FEMS (Мадрид, Испания, 2006). На всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005) работа была отмечена как лучшее стендовое сообщение.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов, 1 статья принята к печати.
Место проведения работы. Работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Очистка и характеристика железоредуктазной активности была выполнена во время стажировки в Лаборатории биотехнологии Технологического университета г. Делфт (Нидерланды) под научным руководством проф. д-ра С. Де Вриса. Работы с технецием(УИ) проводились в Лаборатории радиохимических исследований Института физической химии и электрохимии РАН в сотрудничестве с к.х.н. К.Э. Германом. Исследования способности С. ferrireducens к восстановлению хрома(УІ) и урана(УІ) проводились совместно с сотрудниками Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН д.б.н. Н.Н, Медведевой-Ляликовой и к.б.н. Т.В. Хижняк.
Определение валентного состояния урана выполнили сотрудники Института общей и ядерной физики Научного Центра «Курчатовский институт» Н.Г. Яковлев и И.Е.
Велешко. Электронную микроскопию и рентгеновский микроанализ проводили совместно с Н.А. Кострикиной, Е.С. Бариновой и В.В. Сорокиным (ИНМИ РАН).
Работа была выполнена при поддержке грантов: РФФИ 06-04-48684-а и 04-03-22000-CNRS, АФГИР (CRDF) RB-2-2379-MO-02C, ИНТАС 01-151, НАТО CLG-LST-978616, NSF (Grant МСВ02383387 to F.T.R.); программ: CNRS №2730, Молодёжного научного сотрудничества FEMS («Восстановление железа термофильными прокариотами»), Президиума РАН («Молекулярная и клеточная биология»).
Благодарность. Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым выше участникам работы, а также всем сотрудникам и аспирантам Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН и Лаборатории биотехнологии Т.У. г. Делфт за поддержку и участие в этой работе. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. А.И. Слободкину и зав. лаб. Гипертермофильных микробных сообществ д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 214 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка и 12 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий в себя 289 наименований.
