Введение к работе
Актуальность проблемы. Холера – особо опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в последние годы в мире ежегодно регистрируется 3,0-5,0 млн. случаев холеры и более 100-120 тыс. человек умирает (Информационный бюллетень ВОЗ, N107, 2011). Современный период характеризуется наличием стойких очагов холеры в Юго-Восточной Азии и Африке. Крупные эпидемии и вспышки холеры на эндемичной территории, занос инфекции из эндемичных очагов практически на все континенты и тенденция к росту мировой заболеваемости определяют неблагоприятный прогноз по холере (Онищенко Г.Г. с соавт., 2005; Москвитина Э.А. с соавт, 2011, 2012). Возникновение эпидемических осложнений по холере в России связано с реальной возможностью ее завоза из зарубежных стран, неблагополучных по этой инфекции. Так, с 2005 г. по 2010 г. в России было зарегистрировано 8 случаев завоза холеры из Индии и Таджикистана (Москвитина Э.А. с соавт, 2011).
К настоящему времени известно о семи пандемиях холеры, среди которых первые шесть (1817-1923 гг.) предположительно были вызваны V. cholerae О1 классического биовара (Бароян О.В., 1971). Одной из характерных особенностей этого возбудителя является его высокая патогенность, обусловленная эффективной продукцией основных факторов вирулентности – токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) и холерного токсина (ХТ), которые соответственно определяют развитие двух ключевых этапов инфекционного процесса – колонизацию холерными вибрионами тонкого кишечника и развитие профузной диареи (Kaper J.B. et al., 1995; De Haan L.et al., 2004). Однако к началу прошлого столетия на эндемичных по холере территориях эти вибрионы были постепенно вытеснены V. cholerae О1 серогруппы, но другого биовара – эльтор. Вследствие этого события возбудителем текущей, 7-ой, пандемии холеры (с 1961 г. по настоящее время) стали токсигенные штаммы V. cholerae О1 биовара эльтор, отличающиеся от классических вибрионов по ряду фенотипических и генетических свойств (Бароян О.В., 1971; Waldor M.K. et al., 1996; Dziejman M. et al., 2002). К одним из основных генетических различий классического и эльтор биоваров относят отличия в нуклеотидных последовательностях двух генов, входящих в состав профага CTX – гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез ХТ, и гена-репрессора rstR. Вследствие этого аллели указанных генов у классических вибрионов обозначены как ctxВСlass (или ctxB1) и rstRСlass, у вибрионов эльтор – ctxBEltor (или ctxB3) и rstREltor. Разная нуклеотидная последовательность генов ctxB1 и ctxB3 обуславливает различия в аминокислотной последовательности В-субъединицы их токсинов, поэтому различают ХТ 1-го типа, продуцируемый классическими вибрионами, и ХТ 2-го типа, характерный для вибрионов эльтор (Olsvik O. et al., 1993; Waldor M.K. et al., 1996, 1997).
В течение 7-ой пандемии холеры геном ее возбудителя претерпел различные изменения. Одно из важнейших событий в эволюции этого возбудителя в современный период – возникновение новых генетически измененных вариантов (геновариантов) с повышенной вирулентностью, в геноме профага CTX которых содержится аллель ctxB1 (Nair G.B. et al., 2002; Morita M. et al., 2008; Safa A. et al., 2010; Borkakoty B. et al., 2012). К настоящему времени эти геноварианты стали не только доминировать во многих странах Азии и Африки, но и проникать на новые территории (Гаити, Доминиканская Республика, Венесуэла) (Москвитина Э.А. с соавт., 2012; Nair G.B. et al., 2006; Grim C.J. et al., 2010; Safa A. et al., 2010; Tappero J.W. et al. 2011). В Российской Федерации, согласно последним данным, эпидемические вспышки и единичные случаи холеры во время седьмой пандемии были вызваны как типичными штаммами, так и измененными вариантами V. cholerae биовара эльтор, завезенными из различных стран Азии (Миронова Л.В. с соавт., 2010; Савельев В.Н. с соавт., 2010; Смирнова Н.И. с соавт., 2010). Однако в нашей стране отсутствуют комплексные диагностические тест-системы, позволяющие одновременно проводить идентификацию штаммов холерного вибриона О1 серогруппы, определять их биовар и дифференцировать типичные и генетически измененные варианты V. cholerae биовара эльтор. Несмотря на то, что геноварианты биовара эльтор уже обнаружены на территории России и стран ближнего зарубежья, все еще остаются неизученными их фенотипические свойства, не исследована вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Недостаточно сведений о структуре профага СТХ и острова патогенности VPI-1, несущих основные гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, кодирующие продукцию ХТ и ТКПА. Вместе с тем, изучение структуры генома и экспрессии генов вирулентности и жизнеобеспечения измененных вариантов эльтор необходимо для оценки их генетического разнообразия и выяснения механизма образования.
Все вышеперечисленное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является проведение сравнительного анализа фенотипических и молекулярно-генетических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных государств.
Задачи исследования:
-
Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1 классического и эльтор биоваров с одновременной дифференциацией типичных штаммов и измененных вариантов эльтор вибрионов. С помощью разработанной тест-системы провести анализ клинических штаммов, завезенных на территорию Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, и выявить измененные варианты возбудителя холеры эльтор.
-
Провести сравнительный анализ фенотипических свойств типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae О1 биовара эльтор. Определить уровень продукции холерного токсина и оценить вирулентные свойства геновариантов.
-
Изучить структуру профага СТХ, кодирующего биосинтез холерного токсина, у измененных эльтор вариантов, завезенных в Российскую Федерацию в современный период. Определить генотипы исследованных штаммов.
-
Определить количество копий профага СТХ в геноме измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор.
-
Выявить наличие островов патогенности VPI-1 и VPI-2 у геновариантов V. cholerae биовара эльтор и провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена tcpA.
Научная новизна работы
Впервые проведен комплексный фенотипический и молекулярно-генетический анализ 60 штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор, выделенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья с 1970 по 2010 гг. Установлено, что, начиная с 1993 г., причиной эпидемических осложнений на территории Российской Федерации были измененные варианты, содержащие в геноме профага CTX ген ctxB классического типа.
Впервые проведен сравнительный анализ продукции основных и дополнительных факторов патогенности у типичных штаммов и измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории России и сопредельных государств. При определении экспрессии холерного токсина выявлено, что генетически измененные варианты в условиях in vitro синтезируют в 2-10 раз больше холерного токсина по сравнению с типичными клиническими штаммами V. cholerae биовара эльтор. Установлено, что геноварианты не отличаются от типичных штаммов по продукции гемолизина, но обладают повышенной подвижностью. На модели лабораторных животных подтверждена высокая токсигенность и вирулентность геновариантов по сравнению с типичными эльтор вибрионами.
Получены новые сведения о вариабельности профага СТХ измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья, выражающейся в присутствии в его геноме разных аллелей гена ctxB (ctxB1 или ctxB7), rstR (rstRClass и/или rstREltor), а также разного числа тандемных гептаповторов в промоторной области оперона ctxAB (trp3, trp4, trp5). Полученные данные позволили отнести все изученные штаммы к 4-м генотипам: ctxB1, rstREltor, trp3; ctxB1, rstREltor, trp4; ctxB1, rstREltor/rstRClass, trp4; ctxB7, rstREltor/rstRClass, trp5.
Впервые определено количество копий оперона ctxAB у геновариантов, выделенных на территории России и сопредельных государств. Установлено, что в хромосоме большинства изученных штаммов (90 %) присутствует две копии оперона ctxAB, что свидетельствует о наличии в геноме двух копий профага СТХ.
При определении нуклеотидной последовательности гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии и входящего в состав острова патогенности VPI-1, впервые установлено, что штаммы геновариантов, завезенные в Россию после 2006 г., имеют отличную как от классических, так и от типичных эльтор вибрионов нуклеотидную последовательность гена tcpA.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена получением патента РФ на изобретение (патент № 2458141 от 05.03.2012г.).
Практическая значимость работы
Предложен способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1 серогруппы, определения их биовара (классический или эльтор) и дифференциации типичных и генетически измененных холерных вибрионов биовара эльтор. На основе разработанного способа сконструирован «Набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ)», зарегистрированный в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (РУ № ФСР 2012/ 13427 от 21.05.2012 г.) и рекомендованный для применения в Российской Федерации.
По результатам работы составлены методические рекомендации «Мультиплексный ПЦР-анализ для выявления измененных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара эльтор, несущих профаг вирулентности CTX с генами классических вибрионов», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №6 от 13.10.2010 г.) и утвержденные директором.
В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы:
– три штамма (V. cholerae О1 серогруппы классического биовара, V. cholerae О1 серогруппы эльтор биовара и V. cholerae О139 серогруппы) с изученными молекулярно-генетическими характеристиками, используемых в качестве референс-штаммов при проведении геномной паспортизации штаммов возбудителя холеры (КМ259, КМ260, КМ261);
– коллекция из 6 штаммов в качестве генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор с известным генотипом для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов (КМ265, КМ266, КМ267, КМ268, КМ269, КМ270).
Полученные в ходе выполнения данные по изучению генетической организации измененных вариантов V. cholerae О1 биовара эльтор используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации по особо опасным инфекциям при и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
-
Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет идентифицировать токсигенные штаммы холерного вибриона О1 серогруппы, определять принадлежность к классическому или эльтор биовару и проводить дифференциацию штаммов V. cholerae биовара эльтор на типичные изоляты и генетически измененные варианты.
-
На территории России вспышки и спорадические случаи заболевания холерой, начиная с 1993 года, были вызваны измененными вариантами холерных вибрионов биовара эльтор. Геноварианты V. cholerae биовара эльтор в отличие от типичных эльтор вибрионов в условиях in vitro синтезируют больше холерного токсина и являются более вирулентными для лабораторных животных – крольчат-сосунков.
-
Измененные варианты V. cholerae биовара эльтор, выделенные с 1993 по 2010 гг. на территории Российской Федерации при эпидемических вспышках и единичных случаях холеры, отличаются между собой по структуре профага CTX, содержащего разные аллеи генов ctxB, rstR и разное количество тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB. В геноме большинства изученных штаммов геновариантов профаг CTX присутствует в количестве 2 копий. Штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор несут полный набор генов островов патогенности VPI-1 и VPI-2. В составе VPI-1 геновариантов, выделенных после 2006 г., содержится аллель tcpETCIRS.
Апробация работы.
Материалы диссертации представлены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010), на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Протвино, 2011), на совещании специалистов Роспотребнадзора по вопросам совершенствования эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2011), проблемной комиссии (48.04) «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2012), на Х съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2010-2012).
Работа выполнена в рамках плановой НИР 37-4-09 «Изучение природных и генетически измененных штаммов холерного вибриона и установление связи между вариабельностью генома и патогенными свойствами V. cholerae»; Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы) в рамках государственных контрактов № 70-Д от 25.07.2011 г., лот 12, тема «Оценка изменчивости фенотипических и генетических свойств вирулентных штаммов возбудителей инфекционных болезней при смене ими экологических ниш обитания» и № 53-Д от 04.06.2012 г., лот 12, тема «Молекулярно-генетические особенности генетически измененных штаммов возбудителей опасных инфекционных болезней и их значимость в изменении вирулентных свойств и адаптации патогенов к меняющимся условиям окружающей среды».
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 5 статей в рекомендованных ВАК изданиях и один патент.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 197 цитируемых работ, из них 35 отечественных и 162 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 131 страницу. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 12 рисунками.
