Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 10
1.1. S. pneumoniae как условный патоген и его роль в развитии заболеваний
1.1.1. Морфология 10
1.1.2. Эпидемиология 10
1.1.3. Геномный анализ 11
1.1.4. Патогенез 12
1.1.5. Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии внебольничных пневмоний и бактериемии 22
1.1.6. Проблема развития резистентности к пенициллинам 24
1.2. С.albicans как условный патоген и ее роль в развитии заболеваний 25
1.2.1. Эпидемиология 25
1.2.2. Морфология 25
1.2.3. Геномный анализ 26
1.2.4. Патогенез 27
1.2.5. Этиологическая значимость C.albicans в развитии кандидозов 34
1.3. Роль полимеразной цепной реакции в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями 40
Глава 2. Материалы и методы. 47
2.1. Группы больных 47
2.1.1. Контингент обследованных на инфицированность S. pneumoniae 47
2.1.2. Контингент обследованных на инфицированность Candida 49
2.1.3. Контингент обследованных с иммуносупрессией
2.2. Микробиологические исследования 51
2.3. Полимеразная цепная реакция 51
Глава 3. Результаты и обеуяедение. 60
3.1. Результаты, полученные при исследовании ретроспективной группы больных с внебольничными пневмониями, и их обсуждение 60
3.2. Результаты, полученные при исследовании группы больных с диагнозом внеболышчная пневмония; контрольной группы, их обсуждение 61
3.3. Результаты, полученные при исследовании группы больных с генитальным кандидозом и носительством кандид, их обсуждение 98
3.4. Результаты, полученные при исследовании группы больных с иммуносупрессией, и их обсуждение 100
4. Заключение 103
5. Выводы 108
6. Практические рекомендации 109
7. Список литературы ПО
- Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии внебольничных пневмоний и бактериемии
- Этиологическая значимость C.albicans в развитии кандидозов
- Результаты, полученные при исследовании группы больных с диагнозом внеболышчная пневмония; контрольной группы, их обсуждение
- Результаты, полученные при исследовании группы больных с иммуносупрессией, и их обсуждение
Введение к работе
Популяции условно - патогенных микроорганизмов входят в
естественные биоценозы человека и в сбалансированном состоянии /
Г v.J*
удерживаются в пределах определенных экологических ниш. Находясь в'' t"7
U" f
сбалансированном состоянии, микробные ценозы удерживаются в пределах
определенных экологических нишГ1 Благодаря естественной резистентности
макроорганизма, представители ценоза поддерживают свою численность и не
могут расширить ареал обитания [12]. Разнообразные неблагоприятные
внешние воздействия, экстремальные условия, стрессовые ситуации,
снижение иммунного статуса, гормональные нарушения приводят к сдвигу
такого равновесия. Любые изменения условий, дающие преимущества в
размножении того или иного микроорганизма, входящего в ценоз, приводят к
реализации его патогенного потенциала, а в ряде случаев к распространению
определенной микробной популяции за пределы естественной среды
обитания [9]. т„г . -ді.з/. п»^/' -
Естественно, что с большей вероятностью микроорганизмы,
обладающие достаточно полным набором факторов патогенности, способны
занимать новую экологическую нишу и вызывать патологический процесс.
Выявление таких условно-патогенных микроорганизмов в не свойственных
Чередах йу обитания является достаточно убедительным доказательством
микроорганизма часто свидетельствует о диссеминации процесса и развитии септицемии. В этих случаях решающим] является эффективность бактериологического исследованияДправильность выбора питательных/сред, концентрация возбудителя в материале, условия его транспортировки, проводимая предварительная противомикробная терапия и т.д.). Кроме этого, ряд трудно культивируемых возбудителей, таких как S. pneumoniae, Н. influenzae, Mycoplasma spp. и др. требует использования специфических сред и условий, определенных навыков персонала. Эти обстоятельства делают необходимым повысить эффективность выявления возбудителя в
этиологического диагноза. Получение гемокультуры того или иного
исследуемом материале. В настоящее время кроме ставших «золотым стандартом» микробиологических методов идентификации и количественной оценки возбудителей, начинают широко применяться новые молекулярно-диагностические методы. В клинической практике успешно используется ПЦР - диагностика различных инфекционных заболеваний. Ряд характеристик ПЦР определяет преимущества этого метода в сравнении с другими. Высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения анализа после начала антибактериальной химиотерапии, быстрота выполнения относятся к достоинствам ПЦР. Ранее было показано удачное применение ПЦР для рутинной лабораторной диагностики возбудителей^инфекционных процессов респираторного и урогенитального тракта, например, Bordetella pertussis, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и т.д. [98, 58]. В качестве объекта исследований нами были выбраны условно - патогенные организмы S. pneumoniae и С. albicans. -? Ci'- 1'п*"**>'*>.
Основанием для такого выбора послужило то, что оба этих
микроорганизма широко распространены, и их роль в развитии
патологического процесса хорошо известна. Однако обнаружение ДНК f-?.
условно-патогенного возбудителя не всегда является подтверждением его
этиологической значимости. Особенно это подтверждается при исследовании
материала, где не исключается контаминация нормальной флорой (в мокроте,
смыве из носоглотки, мазке из влагалища), которая неизбежно приводит к
гипердиагностике и не позволяет решить вопрос о патогенетической
значимости определяемых микроорганизмов, тем более в случае
оппортунистической инфекции. Например, S. pneumoniae может
обнаруживаться в респираторном тракте и у здоровых носителей, и при развитии заболевания [76, 32]. A Candida spp. может определяться во влагалище 20% здоровых женщин детородного возраста [23]. Поэтому мы считали, что обнаружение у выявляемого возбудителя факторов патогенности в определенной степени позволит судить об его
7 этиологической значимости в развитии оппортунистической инфекции. Использование ПЦР в решении этого вопроса позволило бы определить ее место в алгоритме этиологической диагностики.
Активация популяции S. pneumoniae при развитии заболевания характеризуется выраженным распространением пневмококка из естественной экологической ниши - носоглотки, в безмикробЧіьіе пространства респираторного тракта, тде может реализовываться патогенный потенциал. Патогенность С. albicans может проявляться и в пределах естественной экологической ниши, и при захвате новых территорий.
Предполагалось, что использование молекулярно - генетической детекции ДНК возбудителя, дополненное определением маркеров его патогенности при разных вариантах развития оппортунистической инфекции в определенной степени поможет установить этиологическую значимость данного микроорганизма. Так, например, известно, что кандида, выделенная от больных с манифестной инфекцией, более вирулентна по сравнению со штаммами от носителей [5]. Наличие полисахаридной капсулы, являющейся самым признанным фактором патогенности у S. pneumoniae, повышает вирулентность возбудителя в 105 раз [62]. Серьезной проблемой для клиницистов становится проявление ^другого фактора патогенности S. pneumoniae, а именно возникновение резистентности возбудителя к антибиотикам, наиболее часто используемых для лечения инфекционного процесса, вызванного данным микроорганизмом. Так, например, лечение пневмоний на протяжении десятилетий основывалось на использовании пенициллина вследствие его высокой активности в отношении пневмококка. В последнее время во всем мире наблюдается стремительный рост резистентности возбудителей пневмоний к антибактериальным препаратам. Значительно увеличилась доля пневмоний, вызываемых штаммами S. pneumoniae, устойчивыми к пенициллину. Крупное исследование по изучению устойчивости респираторных возбудителей к антибиотикам Alexander Project выявило наличие пенициллин-резистентных штаммов S.
/
pneumoniae в отдельных регионах (Франция, Испания) до 51,4% случаев. Хотя, проблема устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам в России пока не столь актуальна, но по данным многоцентрового исследования «ПеГАС-1», умеренно резистентные к пенициллину штаммы пневмококков были выявлены уже в 9% [1]. Следует помнить, что резистентность штаммов значительно варьирует в каждом регионе и может серьезно осложнить выбор терапии. Механизм устойчивости S.pneumoniae к пенициллину и другим бета- л актами ым антибиотикам обусловлен изменением пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство этих белков к бета-лактамным антибиотикам. Применение ПЦР для обнаружения мутаций пенициллин-связывающих белков способствует быстрому выявлению таких штаммов и назначению адекватного лечения с учетом резистентности возбудителя. Помимо этого, проявление различных факторов патогенности как было указано выше, помогает микроорганизмам занять новые, не свойственные им ниши обитания. Проявлением агрессии возбудителя можно считать развитие генерализации инфекционного процесса, В связи с этим диагностическую значимость может представлять изучение стерильных в норме сред организма, а именно, крови. Хорошо известно, что С.albicans обладает способностью к проникновению в эндотелий кровеносных сосудов и дальнейшей гематогенной диссеминации [47]. Пневмония, вызываемая S. pneumoniae, часто сопровождается бактериемией [38]. По данным Mandell et all, эффективность бактериологического выявления возбудителя в крови при внебольничной пневмонии остается не высокой и составляет от 1 до 16 % [64]. Применение в данном случае ПЦР в связи с ее высокой чувствительностью, возможно, поможет повысить эффективность этиологической диагностики.
Течение оппортунистической инфекции во многом обусловлено иммунным статусом человека. Воспалительные цитокины, такие как IL-10, могут ингибировать синтез про - воспалительных цитокинов, включая IL-la \
b, IL-6, IL-8 и TNF. Измерение уровня IL-10 показало, что при
внебольничной пневмонии происходит увеличение количества цитокина в
крови. Оно коррелирует с тяжестью течения болезни и может иметь
прогностическое значение [42]. В связи с этим изучение при помощи ПЦР
полиморфизма единственного нуклеотида в промоторе гена IL-10- 1082G/A,
приводящее к различной степени его экспрессии может дать
предварительную оценку возможного течения заболевания.
Цель исследования: ^-
Определение роли ПЦР в алгоритме ^исследования больных с подозрением на инфекцию, вызванную условно - патогенными возбудителями. Задачи исследования:
1. Оценка эффективности применения ПЦР для выявления S. pneumoniae в мокроте и крови у больных с внебольничными пневмониями в сравнении с данными бактериологического исследования.
2. Изучение генов факторов патогенности S. pneumoniae (фибронектин-связывающего белка (pavA) и пневмолизина (plyA)), и их влияния на развитие бактериемии.
Оценка частоты выявления мутаций AR1 и AR2 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) и их влияния на развитие резистентности микроорганизма к пенициллинам.
Изучение факторов, влияющих на развитие бактериемии у больных с внебольничными пневмониями.
Изучение влияния генов факторов патогенности С. albicans (негативной регуляции гифообразования (nrg) и хитин синтетазы 1 (chsl)) на развитие кандидоза.
Оценка эффективности применения ПЦР для выявления кандидемии у больных на фоне иммуносупрессии.
Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии внебольничных пневмоний и бактериемии
Инфекционный процесс может и не развиться, а остановится на этапе носительства. В первые недели носительства защита от инфекции, по-видимому, осуществляется неспецифическими механизмами. В дальнейшем начинают вырабатываться антитела к капсульньш полисахаридным антигенам, обеспечивающие специфическую защиту. Однако, у здоровых взрослых IgG-антител к большинству типоспецифических антигенов в крови, как правило, не удается обнаружить. Они и появляются в результате носительства, перенесенного заболевания или вакцинации. При нарушении синтеза IgG или фагоцитарной функции нейтрофилов и макрофагов риск пневмококковой инфекции и тяжесть заболевания возрастает [6]. 1.1.5. Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии виебольничных пневмоний и бактериемии.
Наиболее часто S. pneumoniae вызывает пневмонию. Пневмония относится к наиболее распространенным заболеваниям, возникающим в любом возрасте, и представляет собой комплекс патологических изменений, развивающихся в легочной ткани, основным проявлением которых является инфекционный, экссудативный процесс, вызванный микроорганизмами различной природы. Патогенез пневмоний обусловлен динамичным своеобразным процессом взаимодействия микроорганизма (ассоциации возбудителей) и противоинфекционной защиты организма. При этом сложный комплекс альтернативных, дисциркуляторных и защитно-приспособительных реакций, развивающихся при пневмонии в легких и других органах и системах, отражает несостоятельность отдельных звеньев противоинфекционной защиты в ответ на проникновение возбудителя в легочную ткань. Выбор эффективного лечения должен базироваться на этиологической, патогенетической, медико-биологической оценке воспалительного процесса в легких. J
Согласно международной классификации болезней (МКБ 10 пересмотра) основным принципом классификаций пневмоний является этиологический, выделяют бактериальные, вирусно-бактериальные, грибковые, аллергические и т.д. 1В нашей стране, признавая значимость этиологической классификации пневмоний, тем не менее, продолжают пользоваться множественными классификациями, разделяющими пневмонии по патогенезу, клинико-морфологическим формам, объему поражений, тяжести течения, видам осложнений [20]. В последние годы все чаще используют классификации, учитывающие окружающие условия, в которых развилось заболевание: внебольничные, госпитальные (нозокомиальные) пневмонии, аспирационные пневмонии и пневмонии у лиц с иммунодефицитами В этиологической структуре внебольничных пневмоний, т.е. пневмоний, возникших вне стационарных условий, основным возбудителем является Streptococcus pneumoniae, удельный вес которого по данным бактериологических исследований доходит до 30% [2]. В 20-30% процентах случаев выявляется Mycoplasma pneumoniae, в 10-15%» -Haemophilus spp., а в 8 % - Chlamydia pneumoniae [18]. В 20-30% случаев этиология пневмоний вообще не устанавливается и антибактериальная терапия в этих случаях назначается эмпирически /Смертность от внебольничных пневмоний достигает 5%, а среди пациентов, требующих госпитализации, доходит до 20% [11]. Чаще всего пневмонии возникают в холодное время года, т. е. заболеваемость носит сезонный характер, однако следует отметить, что болезнь может возникнуть в любое время года [21]. Среди больных пневмонией преобладают мужчины. Они составляют, по данным различных авторов: 52 - 56%, тогда как женщины: 44 - 48%). Частота пневмоний резко увеличивается с возрастом. Пациенты в возрасте от 40 до 59 лет составляют 38 - 56 % заболевших, старше 60 лет - от 31 до 60% [13]. Объективная оценка тяжести состояния больного является необходимой для принятия решения о тактике ведения больного, его транспортировке, об оптимальном месте терапии больного, для сравнения исходов в зависимости от методов лечения, качества оказания помощи.
Для оценки тяжести и прогноза внебольничной пневмонии наиболее часто применяется шкала PORT, предложенная M.Fine в 1997 г. [40, 1]. Используя этот алгоритм, можно провести классификацию больных в соответствии с факторами риска. Чем больше баллов имеет больной, тем более вероятен плохой прогноз заболевания. Пациенты, относящиеся к I, II и III классам риска, имеют невысокий риск летальности (менее 5%), и могут получать амбулаторную терапию. Пациенты IV и V классов имеют более высокий риск летальности (до 30%), и должны быть доставлены в стационар. Больные, относящиеся к V классу, как правило, имеют тяжелую пневмонию и нуждаются в интенсивной терапии, j
Факторами, способствующими развитию инвазии S. pneumoniae в кровь являются; пол, возраст, хронические заболевания и т.д. Особенно жесткая корреляция была найдена с курением, причем влияние может оказывать и пассивное курение. У больных с нормальным иммунитетом риск развития инвазивного процесса при курении оценивается как 51%, при пассивном курении 17%, при наличии хронических заболеваний 14% [75]. 1.1,6. Проблема развития резистентности к пенициллином.
Этиологическая значимость C.albicans в развитии кандидозов
Орофарингеальный кандидоз встречается приблизительно у 30% онкологических пациентов после химиотерапии и более чем у 90% больных со СПИДом, и характеризуется поражением слизистой щек, неба, зева, языка, десен, углов рта.
Поверхностный кандидоз кожи встречается у 5-6% онкологических больных. Чаще он развивается в крупных и мелких складках, но высыпания могут возникать на гладкой коже туловища и конечностей, в том числе ладоней и подошв. Редко встречается кандидоз ладоней и подошв. Кандидоз кожи подошв наблюдается преимущественно у детей.
Candida spp. играет важную роль и в развитии кандидозного вульвовагинита (КВВ) и занимает второе место в инфекционной патологии женщин. Свыше 75% женщин имеют на протяжении жизни хотя бы один эпизод манифестации данной инфекции [31]. Основными факторами риска вагинального кандидоза считаются беременность, использование средств контрацепции, лечение антибактериальными препаратами и сахарный диабет. Заболеваемость возрастает во время беременности, встречаясь не менее чем у 20% - 30% женщин. Наиболее высокая степень колонизации отмечается в последнем триместре и у первородящих [17]. В течение заболевания выделяют острую и хроническую формы. Острая форма протекает не более 2 месяцев. Рецидивирующий КВВ рассматривается как особый вариант течения хронической формы заболевания. В этом случае под рецидивированием понимают не просто повторное появление симптомов, а довольно частое их возникновение, чередующееся с неманифестными периодами, в течение которых колонизация Candida spp сохраняется. Другим, более тяжелым вариантом течения хронической формы, является персистирующий КЕШ. При нем симптомы заболевания сохраняются постоянно с той или иной степенью выраженности, обычно стихая после проведенного лечения. В настоящее время установлено, что рецидивы вагинального кандидоза, как правило, вызываются одним штаммом гриба. Причину хронического и рецидивирующего течения склонны объяснять состоянием организма больной, прежде всего - особенностями защитной системы влагалища. При отсутствии существенных изменений лимфоцитов периферической крови в ткани влагалища развивается локализованный специфический иммунодефицит по отношению к антигенам Candida [15], С. albicans, С. glabrata, С. krusei наиболее часто вызывают виды Candida spp., КВВ, С. albicans вызывает данное заболевание в 70% случаев. За последние десять лет распространенность вагинального кандидоза, вызванного видами, не относящимися к С. albicans, увеличилась почти вдвое. В настоящее время кандидоз влагалища, вызванный этими видами грибов, некоторые авторы склонны относить к так называемому осложненному вагинальному кандидозу. Вместе с тем, эти возбудители нередко встречаются с большей частотой независимо от течения заболевания, например в некоторых этнических группах. При вагинальном кандидозе как эндогенной инфекции его этиология может отражать особенности колонизации полости рта и кишечника (С. tropicalis, С. glabrata, С. krusei) или кожи (С. guilliermondii, С. parapsilosis). Увеличение удельного веса редких видов в этиологической структуре кандидозов связывают с изменениями диеты, бытовых условий, бесконтрольного применения лекарственных препаратов и т. д. Не исключаются и другие факторы [15].
Вторым доминирующим по частоте возбудителем, вызывающим КВВ, является С. glabrata. Он выделяется в 15 - 30 %. Третье место по результатам разных исследований обычно занимает С. tropicalis [15]. Длительный период колонизации без развития кандидозного вагинита у некоторых женщин может быть связан со спецификой вирулентности штаммов. Candida попадает в организм на стадии бластоконидии. Удачная колонизация зависит от многих факторов, например, от эффективности адгезии к вагинальным эпителиальным клеткам. Уменьшение способности к колонизации и развитии инфекции может также зависеть от спонтанного клиренса кандид при помощи защитных механизмов реализуемых на уровне слизистых. При подходящих условиях для активации популяции грибов у них наблюдается образование герментативных трубок. Этот процесс может быть критическим для инвазии в слизистую оболочку. У пациенток с симптомами кандидоза в вагинальном секрете всегда присутствуют клетки кандиды с проростковыми трубками. Этот признак является надежным отличием манифестации инфекции от носительства.
Электронные фотографии поверхностных влагалищных эпителиальных клеток в модельных экспериментах на мышах при кандидозных вагинитах показывают, что герминтативные трубки активно внедряются и пенетрируют в слизистую. В то же время показано, что мутантные штаммы, утратившие способность к образованию этих трубок, не способны к успешной колонизации влагалища у мышей даже при введении инокулята в высокой концентрации [89]. С. albicans проникает и выживает в глубоких слоях цервикального и вагинального эпителия. Псевдомицелий проникает вглубь до 4-6 слоев эпителия, расстояние между ним и подслизистои местами не превышает толщину 5-6 эпителиоцитов. Проникновение внутрь клеток наряду с целостностью маннопротеиновой оболочки позволяет грибам противостоять факторам защиты макроорганизма [15]. Клетки влагалища обладают иммунокомпетентностью и могут функционировать независимо от реакций системного иммунитета. Слизистая содержит большое количество эпителиальных клеток, дендритоподобных клеток Лангер ганса и Т-лимфоцитов [14].
Первой стадией кандидозного инфекционного процесса следует считать колонизацию в сочетании с тканевыми реакциями (гиперемия, отек, инфильтрация). Вторая стадия - проникновение гифальных элементов в глубину покровных тканей, приводящее к развитию поверхностного инвазивного процесса. Первая и вторая стадия могут длиться годами. Третья стадия - пенетрация покровных тканей и инвазия кандид в лимфатические и кровеносные сосуды с поражением глубоких тканей и органов, соответствует развитию глубокого микоза. Четвертая стадия — фунгемия и возникновение очагов кандидозной инфекции, соответствует системной и генерализованной формам микоза [3].
Результаты, полученные при исследовании группы больных с диагнозом внеболышчная пневмония; контрольной группы, их обсуждение
Та же ситуация складывается и с Н. influenzae. Если при использовании стандартных микробиологических методов возбудитель был высеян в 52%», то применение ПЦР позволило несколько увеличить процент его определения до 58%. Однако, сравнение этих результатов с данными, полученными при исследовании образцов контрольной группы, где ДНК Н. influenzae определялась в 75%, говорит о том, что и здесь нельзя признавать диагностическим критерием наличие ДНК этого микроорганизма в мокроте. Candida spp. высевалась в 30% случаев в исследуемой группе, ПЦР повышало эффективность определения до 48%. Сравнение частот выявления Candida spp. в мокроте больных с внебольничными пневмониями и в мазках из носоглотки контрольной группы (48% и 17% соответственно, р = 0,0013) свидетельствует о меньшей распространенности носительства кандид у здоровых людей. Возможно, это связано с тем, что хотя мокрота на исследования собиралась в первые дни поступления, многие больные бесконтрольно принимали данные- препараты в домашних условиях, что могло привести к активации популяции кандид.
ДНК S.aureus была определена при ПНР - исследовании в 6% образцов мокроты больных исследуемой группы и в 4% мазков лиц контрольной, т.е. частоты обнаружения и этого возбудителя являются сопоставимыми в разных группах.
Таким образом, совпадение частот выявления некоторых возбудителей в образцах у- от пациентов с внебольничнои пневмонией и в мазках из носоглотки здоровых людей контрольной группы говорит о ВЫСОКОЙ чувствительности метода ПЦР, которая в этой ситуации увеличивает частоту обнаружения ДНК микроорганизмов - комменсалов, но не позволяет дифференцировать случаи манифестации инфекции от носительства.
Несмотря на это, необходимо отметить, что ПЦР способствовала идентификации ДНК таких патогенов, как М.tuberculosis (6%) и M.pneumoniae (13%). У всех пациентов с положительным результатом ПЦР на M.tuberculosis был микробиологически подтвержден диагноз «туберкулез легких» и их лечение было продолжено в ПТБ. В контрольной группе ДНК этих микроорганизмов не была обнаружена.
Таким образом, диагностическая значимость ПЦР для определения этиологического агента инфекционного процесса в легких при исследовании биосубстратов, полученных не стерильным путем из верхних и нижних отделов респираторного тракта, достаточно низкая, так как она не позволяет дифференцировать носительство оппортунистических микроорганизмов от манифестации инфекции. В связи с этим, была предпринята попытка, оценить диагностическую значимость ПЦР - исследования при использовании в норме стерильной среды организма, а именно крови. Кроме того, изучить вероятность развития бактериемии при пневмонии. В нашем исследовании термин «бактериемия» мы используем при получении положительного сигнала при постановке ПЦР на образцах крови. Однако, высокая чувствительность данного метода, а также невозможность при его применении оценить жизнеспособность микроорганизма, чья ДНК была обнаружена, не позволяют судить о том, что имеет ли место быть в организме истинная бактериемия или мы сталкиваемся с клиренсом остатков дезоксирибонуклеиновых кислот элиминированных возбудителей.
Бактериологическое исследование крови Микробиологическое исследование крови было проведено у 3 пациентов исследуемой группы, роста S. pneumoniae обнаружено не было. У одного пациента был высеян S. hominis.
ПЦР-исследование крови У 44 пациентов (88%) исследуемой группы была исследована кровь при помощи ПЦР на наличие ДНК S. pneumoniae. ДНК этого возбудителя, была обнаружена в 11 образцах крови (25%). Таблица №11.
У 10 из них ДНК определена и в мокроте и в крови; у одного была исследована только кровь. У пяти больных с положительной мокротой не был проведен ПЦР - анализ крови. Из трех пациентов, с отрицательным микробиологическим исследованием крови (см. выше), у одного ПЦР -исследование показало наличие ДНК S. pneumoniae в крови. Взятие крови для ПЦР происходило в первые дни поступления в стационар, однако не все пациенты обращались в лечебные учреждения сразу после начала заболевания. График №2. Поэтому забор крови для исследования происходил у всех на разные сроки от развития пневмонии. У четырех больных: 6 - 10 сутки, у трех: 11-15, у двух: 16-20 сутки. У двух пациентов определить срок начала заболевания установить не удалось. Определение ДНК S. pneumoniae в крови наблюдается с повышенной частотой в первые 10 дней от начала заболевания.Большинство исследований у пациентов без бактериемии также было проведено в первые 10 дней - 12 больных, 11-15 дней - 3, 16-20 день - 6, на двоих данных нет. Можно предположить, что временной фактор не является определяющим, но если бактериемия все-таки наблюдается, то чаще это происходит в ранние сроки заболевания. Эти данные совпадают с литературными. Так в модельном эксперименте на мышах было показано, что при изучении пневмококковой пневмонии и сопутствующей ей бактериемии только 21% культур крови давали положительный результат. В то время как ПЦР обнаружила ДНК S. pneumoniae в 77% образцов. Через 48 часов от начала антибиотикотерапии все культуры крови были отрицательными, а 58% давали положительные результаты при ПЦР [72].
Результаты, полученные при исследовании группы больных с иммуносупрессией, и их обсуждение
При исследовании выявленной ДНК С. albicans в обоих случаях отмечено наличие генов факторов патогенности nrg и chs.
Обнаружение кандидемии и последующее эффективное лечение с применением противогрибковых препаратов подтверждает истинность наличия кандид в крови у этих больных.
Следует отметить, что если при обнаружении бактериемии, вызванной S. pneumoniae, не было найдено отличий в тяжести клинического течения пневмоний у этих пациентов, то при выраженной манифестации кандидозной инфекции на фоне нейтропении проявлялись клинические признаки утяжеления течения инфекции (повышение температуры).
Приведенные данные свидетельствуют, что только при тяжелых иммунодефицитах кандидозная инфекция не может быть удержана на уровне естественной экологической ниши возбудителя. ПЦР позволяет эффективно контролировать эту ситуацию, и оценивать адекватность проводимой терапии.
Полученные результаты дают основание заключить, что применение ПЦР позволяет значимо увеличить частоту определения возбудителя в патологическом материале в сравнении со стандартными микробиологическими методами. Помимо этого, ПЦР способствует идентификации ДНК таких патогенов, как M.tuberculosis и M.pneumoniae. У всех пациентов с положительным результатом ПЦР на M.tuberculosis был микробиологически подтвержден диагноз «туберкулез легких».
Однако обнаружение условно-патогенных микроорганизмов ДНК в мокроте нельзя признать диагностическим критерием. Это согласуется с данными литературы [69]. Для таких патогенов как S. pneumoniae, Н. influenzae, Candida sp., S. aureus, являющихся представителями нормальной флоры человека, колонизирующей назофаренгиальную область, наличие возбудителя в пробе может свидетельствовать и о наличии носительстве, и о манифистации инфекции [75,32,54,70]. Это хорошо иллюстрируется совпадением частот выявления данных возбудителей в мокроте от больных с внебольничными пневмониями и в мазках из носоглотки лиц контрольной группы.
Таким образом, диагностическая значимость ПЦР для определения этиологического агента инфекционного процесса в легких при исследовании биосубстратов, полученных не стерильным путем из верхних и нижних отделов респираторного тракта, достаточно низкая, так как она не позволяет дифференцировать носительство микроорганизмов от манифестации инфекции.
Диагностическая значимость обнаружения ДНК условно-патогенных возбудителей резко возрастает при исследовании стерильных сред организма [74]. В нашем исследовании применение ПЦР позволило выявить ДНК S. pneumoniae в 25 % образцов крови пациентов с внебольничной пневмонией. В контрольной группе в крови только одной пациентки была определена ДНК S. pneumoniae. Поскольку S. pneumoniae обладает высокой ивазивностью некоторые авторы считают, что выявление этого возбудителя в крови возможно без выраженного патологического процесса в легких [43], следовательно этот показатель не является абсолютным при обосновании этиологического диагноза. Тем не менее, сравнивая частоту встречаемости в крови ДНК S. pneumoniae у лиц больных пневмонией и контрольной группы можно считать, что этиологический диагноз может быть подтвержден с вероятностью 98%.
Применение ПЦР не позволило выявить ДНК Candida sp., S. aureus, H. influenzae и CMV в образцах крови пациентов с внеболышчной пневмонией и контрольной группы. Хотя, в образцах мокроты и мазках ДНК всех этих возбудителей была найдена. Видимо, способностью к инвазии при нормальном иммунном статусе из исследуемых нами микроорганизмов в большей степени обладает S. pneumoniae и наиболее частый высев из крови определяется не только значимостью этого возбудителя в этиологии пневмоний, но и свойствами самого микроорганизма, а именно факторами патогенности. Исследование частоты встречаемости выбранных нами генетических маркеров факторов патогенности S. pneumoniae, а именно гена пневмолизина (ply А), гена фибронектин - связывающего белка (pavA), и мутации AR1 гена пенициллин - связывающего белка pbplA не позволяет повысить эффективность обоснованности этиологического диагноза пневмоний и отличить возбудителей патологического процесса от представителей нормальной микрофлоры. По выбранным маркерам статистически значимых отличий по частоте встречаемости их в образцах ДНК, обнаруженной в биоматериалах лиц контрольной группы и больных с пневмониями, не было обнаружено. Данные, полученные в нашем исследовании о наличии мутации AR1 гена pbplA, коррелировали с результатами микробиологического анализа резистентности выделенных штаммов S. pneumoniae к пенициллинам. Все штаммы, охарактеризованные микробиологически как устойчивые к антибиотику, имели выше названную мутацию. ПЦР - обнаружение данной мутации не занимает длительного времени, что важно при назначении своевременной и адекватной терапии внебольничных пневмоний. Была показана корреляционная связь между мутацией AR1 в гене пенициллин связывающего белка 1А и наличием гена фибронектин-связывающего белка spav. Возможность сцепленного наследования опровергается достаточно дальним расположением этих двух генов на хромосоме S. pneumoniae. Таким образом, объяснить эту связь без применения дополнительных методических приемов не предоставлялось возможным. При изучении факторов, возможно влияющих на развитие бактериемии у больных с пневмонией, было показано, что ни количественная характеристика популяции S. pneumoniae; ни другие возбудители, присутствующие в респираторном тракте; ни сопутствующие заболевания; ни курение, пол, возраст; ни особенности иммунитета больного не повышают вероятность обнаружения ДНК S. pneumoniae в крови.
