Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Экология актиномицетов 7
1.2. Влияние солевого режима почв на развитие актиномицетов 12
1.3. Бактериальное население засоленных почв 13
1 .4. Галофильные бактерии 20
1.5. Механизмы адаптации бактерий к высокому содержанию солей 24
1.6. Алкалофильные бактерии 31
1.7. Механизм адаптации бактерий к высокому значению рН 33
1.8. Алкалофильные актиномицеты: выделение из почвы, таксономическое положение и образование биологически активных веществ 41
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 48
2.2. Методы исследования 54
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Численность и таксономический состав актиномицетных комплексов засоленных почв 59
3.2. Диапазоны значений концентраций соли и значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из засоленных почв 77
3.3. Динамики численности и биомассы актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением засоленной почвы 84
3.4. Наблюдение за морфологической дифференцировкой мицелия галоалкалофильного стрептомицета 88
Обсуждение 91
Выводы 95
Список литературы 96
- Экология актиномицетов
- Механизмы адаптации бактерий к высокому содержанию солей
- Численность и таксономический состав актиномицетных комплексов засоленных почв
- Диапазоны значений концентраций соли и значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из засоленных почв
Введение к работе
Актуальность проблемы Засоленные почвы - это большая группа почв разного генезиса и свойств, объединенных одним диагностическим признаком -наличием в профиле легкорастворимых солей в количестве, ухудшающим плодородие почв и отрицательно влияющим на рост и развитие большинства растений (Засоленные почвы России, 2006) Эти почвы представляют собой своеобразные природные экосистемы, в которых высокие концентрации солей и недостаток влаги создают экстремальные условия для существования живых организмов, здесь формируются специфические микробные сообщества
В микробиологических исследованиях засоленных почв большое внимание уделялось галофильным, осмотолерантным и алкапотолерантным микроорганизмам Подробно исследованы разнообразие и функциональные проявления галоалкалофильных и галоалкалотолерантных прокариот (Заварзин и др, 1999) Среди сведений о бактериальном населении засоленных местообитаний находим лишь единичные сведения о мицелиальных бактериях (Калакуцкий, Агре, 1977, Gochnauer et al, 1975, The Prokaryotes, 1991, Jang et al, 2003)
Среди актиномицетов обнаружены галофильные формы Saccharopolyspora halophila (Gochnauuer et al, 1975), Actinopotyspora, Nocardiopsis (AL-Tia and Ruan, 2001), Prauserella halophila и P alba (Li et al, 2003), способные расти на средах, содержащих 10-20% или даже 15-25% NaCl
Для засоленных почв нередко характерны высокие значения рН, особенно, если засоление обусловлено содержанием в почве ионов Na+, Са2+ и СОз2" Поэтому в этих почвах можно ожидать развитие не только галофильных, но и алкалофильных микроорганизмов, в том числе и актиномицетов (Звягинцев, Зенова, 2001)
Целью работы является экологическая характеристика комплекса актиномицетов в засоленных почвах для расширения представлений о разнообразии микробного мира и выявления культур актиномицетов, перспективных в отношении биотехнологии
Задачи исследования
Разработка и подбор методических приемов для учета и выделения актиномицеов из засоленных почв
Сравнительная характеристика актиномицетных комплексов различных засоленных почв
Оценка радиальной скорости роста галофильных, алкалофильных и галоалкалофильных актиномицетов при различных концентрациях NaCl и значениях рН среды для построения кривых толерантности культур в отношении содержания соли и рН среды
Исследование динамики численности и биомассы актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением засоленной почвы
Изучение особенностей дифференцировки мицелия галоалкалофильных актиномицетов на средах с различными концентрациями солей и значениями рН
Научная новизна Впервые установлены закономерности распространения: и таксономическая структура комплексов галофильных, алкалофильных и галоалкалофильных актиномицетов в широком ряду засоленных почв Установлено, что разнообразие актиномицетного комплекса засоленных почв ограничено присутствием родов Streptomyces и Micromonospora. Установлен диапазон значений концентрации соли (NaCl) и рН среды, пригодных для роста актиномицетов засоленных почв Выявлены особенности развития мицелия галоалкалофильного стрептомицета на средах с различньми значениями рН (7 и 9) и концентрациями солей (0,02% и 5%) Показано увеличение количества выделяемых из засоленных почв актиномицетов при использовании сред с повышенными концентрациями солей и высокими значениями рН. Впервые в засоленных почвах установлено развитие актиномицетного мицелия, длина которого достигает до 140 м/г почвы
Практическая значимость. Выявлены экологические ниши алкалофильных, галофильных и галоалкалофильных актиномицетов, что важно для расширения наших представлений о биоразнообразии микробного комплекса почв
Знание об особенностях распространения и жизнедеятельности галофильных, алкалофильных и галоалкалофильных актиномицетов могут представлять существенный интерес для биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии
Сведения, полученные в диссертационной работе, используются в лекциях по курсу "Биология почв" для студентов факультета почвоведения МГУ имени М В Ломоносова
Апробация работы. Основные положения работы доложены на заседании Московского общества естествоиспытателей природы (Москва, 2005), на X и XI Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов 2003" (Москва, 2003) и "Ломоносов 2005" (Москва, 2005), на конференции "Биотехнология, экология, охрана окружающей среды" (Москва, 2005), на школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2005), на Международной научной конференции "Экология и биология почв" (Ростов-на-Дону, 2005), на Международной научной конференции "Экология и биология почв проблемы диагностики и индикации" (Ростов-на-Дону, 2006), на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М В Ломоносова
Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе в 3 статьях в реферируемых журналах
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
Экология актиномицетов
Необходимо заметить, что задачей, как общей экологии, так и экологии микроорганизмов в частности, особенно на начальных стадиях изучения является обнаружение тех факторов среды, которые могут служить ограничивающими или критическими для развития отдельного индивидуума или группы микроорганизмов (Преображенская, 1978).
К основным лимитирующим факторам, влияющим на обилие и разнообразие микроорганизмовт в почве и, в частности актиномицетов, можно отнести следующие (Калакуцкий, Агре, 1977): 1) доступность кислорода; 2) кислотность среды; 3) относительная влажность; 4) доступность питательных веществ; 5) биологические факторы (конкурентоспособность, симбиотические отношения); 6) температура.
Мицелиальные прокариоты не являются чемпионами устойчивости к условиям внешней среды, за исключением их способности противостоять высыханию. В сухой почве при минимальной влажности, когда прекращается рост других организмов, актиномицеты обнаруживаются. Таким образом, актиномицеты частот доминируют в микробных популяциях засушливых почв (Звягинцев, Зенова, 2001). Связано ли это доминироание со способностью к росту мицелия при ограниченных значениях относительной влажности или с устойчивостью спор актиномицетов к высушиванию (Калакуцкий, Зенова, 1984). В последнее время установлено, что споры некоторых стрептомицетов способны прорастать, а проростки увеличиваться в длину при очень низкой влажности aw 0,67 (Звягинцев Д.Г. и др., 2005). Известно о выделении и изучении термофильных актиномицетов. Показано, что актиномицетное население термальных областей многочисленно и разнообразно (Агре, 1986).
В настоящее время представители почти всех известных родов актиномицетов выделены из почв. Исключение составляют, пожалуй, только рухляк выветривания и примитивные почвы сухих пустынь Центральной Арктики. Абсолютное, в ряде случаев, и относительное количество актиномицетов, учитываемое методом высева на плотные питательные среды, имеет тенденцию нарастать по мере продвижения с севера на юг (Звягинцев, Зенова, 2001). Как правило, в южных почвах (черноземы, каштановые, серо-бурые почвы, сероземы) увеличивается разнообразие как стрептомицетов, так и нокардий.
Широкое распространение актиномицетов в природе определяется их устойчивостью к высушиванию, временному отсутствию питательных веществ в среде обитания и эффективностью расселения спорами. Многие актиномицеты в лабораторных культурах способны, хоть и медленно, но расти на водном агаре и других средах с низким содержанием питательных веществ. В почве активно растущий вегетативный мицелий обнаруживается преимущественно в микрофонах с повышенным содержанием органического вещества. Обладая небольшой скоростью роста, актиномицеты не оказываются среди r-стратегов при попадании в почву легко доступных органических веществ и начинают доминировать лишь тогда, когда создаются условия для разложения сравнительно труднодоступных субстратов.
Большинство актиномицетов нейтрофилы (оптимальные для роста значения рН среды 6-8). Существуют сведения о присутствии в почве ацидофильных и алкалофильных форм (Зенова и др., 2000; Селянин и др., 2005). Все же можно предполагать, что в природных средах со значениями 3 рН 9 рост и активность большинства известных актиномицетов будут сильно подавлены. Известно, что известкование кислых почв приводит к увеличению количества стрептомицетов; карбонат кальция нередко добавляют к почвенным образцам с целью стимуляции развития в них стрептомицетов в лабораторных условиях. Заболевание растений, вызываемое стрептомицетами (парша картофеля, например), обычно связано с почвами, имеющими нейтрально-щелочную реакцию, например, с хорошо произвесткованными почвами.
Поскольку большинство ныне известных почвенных актиномицетов являются аэробными микроорганизмами с окислительным типом обмена и развитыми системами переноса электронов на кислород, можно достаточно уверенно предполагать, что недостаток кислорода угнетает их рост и активность в почве. Отмечалось, тем не менее, что из затопленных почв рисовников выделяются в аэробных условиях стрептомицеты, микромоноспоры, стрептовертицилы. Динамика почвенных популяций анаэробных или микроаэрофильных организмов с рудиментарным мицелием (представители Actinomyces и Agromyces) почти не исследована.
Механизмы адаптации бактерий к высокому содержанию солей
При повышении концентрации солей в окружающей среде активность воды снижается, и она выходит из клетки, т.е происходит обезвоживание организма (ионный стресс). Поддерживание равновесного осмотического давления в цитоплазме и во внешней среде осуществляется с помощью процесса осморегуляции.
Предложено два механизма осморегуляции (Звягинцева, 1987).
Галобактериальный или КС1 тип осморегуляции. Осмотическое равновесие достигается за счет поддержания концентрации КС1 в цитоплазме клетки на уровне концентрации солей в окружающей среде. Этот тип осморегуляции описан у ряда архебактерий (метанотрофные бактерии, например Metanohalophilus portucalensis) и эубактерии (ацетогенные анаэробы Haloanaerobium и Acetohalobium, сульфатредуцирующие бактерии Desulfovibrio halophilus).
Осмотический тип осморегуляции: описан у фототрофных и аэробных хемогетеротрофных микроорганизмов и связан с накоплением в клетках бактерий органических осмопротекторов, таких как глицинбетаин, производные эктоинов, аминокислоты (пролин, глютамин), полиолы, N-ацитилированные аминокислоты, Сахаров.
Цианобактерии в качестве осмопротекторов чаще всего имеют трегалозу или тетрозиды. Аэробные галофильные бактерии преимущественно относятся к альфа- и гамма-протеобактериям. У них основным осмопротекторным веществом служит глицинбетаин и эктоин.
Концентрация осмопротекторов в цитоплазме клетки может превышать 1М. При понижении концентрации соли они способны экстрагироваться или откладываться в виде запасных питательных веществ. Накопление осмопротекторов в клетке индуцируется на уровне генома и зависит от осмотического стресса, фазы роста культуры, источника углерода и его концентрации в среде роста. Как предполагает ряд авторов механизм действия осмопротекторов складывается из того, что, во-первых, они увеличивают внутриклеточное осмотическое давление, а во-вторых, стабилизируют макромолекулы клеток. Осмопротекторы могут как синтезироваться самой клеткой, так и транспортироваться из окружающей среды. Ряд бактерий, например энтеробактерии, обладают эффективным механизмом трансформации некоторых осмопротекторов, например бетаина, из окружающей среды в клетку. В качестве сопутствующих осмопротекторов у широкого ряда микроорганизмов выступают сахара, это типично для бактерий с ограниченной толерантностью к солям.
Кроме того, для микроорганизмов, устойчивых к повышенным концентрациям солей характерны модификации в морфологии и структуре клеток. Структурная адаптация клеточных мембран к осмотическому шоку состоит в изменении состава белков, липидов и жирных кислот. В условиях солевого стресса в клеточных мембранах было обнаружено увеличение количества гликолипидов, по сравнению с амфотерными липидами и отмечено изменение соотношения жирных кислот в фосфолипидах, что важно для поддержания стабильности бислойной структуры мембран (Звягинцева, 1987).
Физиолого-биохимические механизмы противодействия осмотическому стрессу исследуются уже в течение многих лет на широком круге микроорганизмов. Факторы повышения осмотического давления, связанные с клеточной активностью, довольно очевидны. Для функционирования ферментов требуется более высокая концентрация растворенных веществ в цитоплазме, чем в среде, окружающей клетки, в соответствии, с чем в цитоплазме накапливаются растворенные вещества. Это вызывает поступление в клетку воды и повышение тургорного давления, которое могло бы разорвать мембрану, если бы она не была защищена клеточной стенкой. Повышению тургора способствует также и то, что в клетках большинства бактерий накопление растворенных веществ, в частности ионов, происходит до значительно более высоких концентраций, чем требуется для синтетических процессов. Для объяснения феномена относительно высокого тургорного давления в бактериальных клетках А. Кохом (Koch) предложена теория поверхностного стресса (Современная микробиология, 2005). Согласно этой теории, бактерии аккумулируют значительный пул растворенных веществ, для создания высокого тургорного давления, что способствует "растяжению клеточной стенки и тем самым удлинению цепей пептидогликана. Таким образом, уровень тургора, эволюционно определившийся" вначале для обеспечения условий протекания ферментативных реакций в цитоплазме, мог впоследствии стать движущей силой реакций, протекающих на поверхности клетки. При очень высокой осмолярности среды бактерии могут предотвращать понижение тургора путем уменьшения степени перекрестного связывания компонентов клеточной стенки. Вследствие этого клетка увеличивается в размерах соответственно новому балансу между тургорным давлением и устойчивостью к нему клеточной стенки.
Численность и таксономический состав актиномицетных комплексов засоленных почв
Численность стрептомицетов, выделяемых из различных засоленных почв, колеблется от сотен колониеобразующих единиц (КОЕ) до тысяч и десятков тысяч КОЕ/г почвы в зависимости от типа почвы и горизонта (рис. 1). Численность мицелиальных прокариот, обнаруженная в засоленных почвах на 1-3 порядка уступает количеству актиномицетов, выделяемых на среде Гаузе 1 из дерново-подзолистой и чернозема соответственно (Звягинцев, Зенова, 2001).
Наименьшее количество стрептомицетов обнаружено в малогумусовом корковом (соровом) солончаке, образцы которого были отобраны на полуострове Бузачи (рис. 1 Б). Численность стрептомицетов в этих почвах не превышает сотен КОЕ/г почвы. Малая численность актиномицетов в этой почве объясняется тем, что эти почвы достаточно бедны органическими и минеральными веществами, практически не содержат карбонатов. Содержание гумуса в этих почвах низкое (около 0,5%). Наибольшее количество (тысячи и десятки тысяч КОЕ/г почвы) стрептомицетов обнаружено в бурой пустынно-степной почве Монголии (рис. 1, Л), луговом гидроморфном солончаке (рис 1, Г, Д, Е) и корковом (соровом) солончаке (рис. 1, В), образцы которых были отобраны в Бурятии на территории пересохших соленых озер. Бурая пустынно-степная почва содержит большое количество карбонатов. Актиномицеты являются кальциефилами, споры их интенсивно прорастают в присутствие ионов кальция. В луговом гидроморфном и корковом солончаках, образцы которых отобраны на в Бурятии содержание гумуса более высокое ( 1%), чем в солончаках, образцы которых отобраны на полуострове Бузачи. Этим объясняется большая численность актиномицетов в этих почвах.
Численность стрептомицетов, обнаруживаемых в засоленных почвах, возрастает (часто на порядок) с увеличением концентрации солей в среде, используемой для выделения актиномицетов. Количество выделенных из почвы на среде Гаузе 1 модифицированной (концентрация солей MgCl2 и Na2S04 - 5%) мицелиальных прокариот оказалось более значительным по сравнению с их численностью на традиционной среде Гаузе 1(0,02% MgCl2 и Na2S04) (рис. 1).
Увеличение концентрации соли в среде выделения до 10% не дало возможности обнаружить актиномицетов в засоленных почвах. По видимому, это связано с тем, что в исследованных нами почвах содержание растворимых солей не превышает 6%.
Численность стрептомицетов, выделяющихся из содовых солончаков, значительно возрастала при использовании среды с содержанием соды (1%) и высоким значением рН (10,0), и на порядок превышала численность стрептомицетов, вырастающих на среде Гаузе 1 и на среде Гаузе 1 модифицированной содержание солей (MgCl2 и Na2S04) - 5% (рис. 2).
Количество актиномицетов, выделенных из зональных почв на среду с повышенной концентрацией солей, как правило, было меньшим по сравнению с численностью актиномицетов на традиционно используемых средах. Так, при выделении актиномицетов из чернозема на среду с повышенной концентрацией солей численность мицелиальных бактерий уменьшалась на два порядка по с 0,02%-ными концентрациями солей MgCl2 и Na2S04 Е- с 5%-ными концентрациями солей MgCb и Na2S04; N - КОЕ/г почвы Корково-пухлый солончак (А), корковый (соровый) солончак (Б, В), солончак луговый гидроморфный (Г, Д, Е), солончак пухлый (Ж), солончак содовый (3), каштановая почва (И), бурая полупустынная почва (К), бурая пустынно-степная почва (Л), серо-бурая почва (М)
сравнению с количеством этих организмов на традиционной среде Гаузе -1 (тысячи КОЕ/г - на среде с 5% концентрацией солей; сотни тысяч КОЕ/г - на среде с 0,02% концетрацией солей) (рис. 3). Численность стрептомицетов, выделяемых из чернозема на традиционно используемую среду Гаузе 1 составила 3,2х105 КОЕ/г почвы а численность стрептомицетов выделенных и-на среде Гаузе 1 с 5% соли составила 7,6 10J. КОЕ/г почвы. Таким образом, повышение концентрации соли в среде уменьшает количество выделяемых из чернозема стрептомицетов на 2 порядка по сравнению с численностью мицелиальных прокариот на традиционной среде Гаузе 1.
Очевидно, в засоленных почвах существует комплекс галофильных стрептомицетов, получающих возможность развиваться при высеве почвенной суспензии на среду, содержащую повышенные концентрации солей хлоридов и сульфатов.
Все изученные нами засоленные почвы имели рН выше 7, за исключением солончака лугового-гидроморфного, образцы которого отобраны из разреза В02 на Большом Барфоне (таб. 1). Высокое значение рН объясняется присутствием карбонатов или соды в исследованных почвах.
При повышении значения рН среды до рН 9 численность мицелиальных прокариот, выделяемых из засоленных почв, как правило, увеличивалась по сравнению с количеством стрептомицетов, выявляемых на среде с аналогичным содержанием солей и значением рН 7,2. Исключение составлял солончак луговый гидроморфный (образцы разреза В02 на Большом Барфоне (табл.1), где на среде с рН 9 не происходит увеличение количества выделяемых стрептомицетов, что объясняется нейтральной реакцией среды в этой почве (рис. 4 Г).
Диапазоны значений концентраций соли и значений рН, пригодных для роста стрептомицетов, выделенных из засоленных почв
В нашей работе использование селективных сред с повышенной концентрацией солей - хлоридов и сульфатов - и высоким значением рН, соответствующим почвенным условиям, позволило выделить актиномицеты из засоленных почв в количестве в 10 раз большем, чем при использовании традиционных сред, и обнаружить в засоленных почвах специфические комплексы галофильных, алкалофильных и галоалкалофильных актиномицетов. В работе установлено, что в засоленных почвах существует комплекс галофильных, алкалофильных и галоалкалофильных актиномицетов, получающих возможность развиваться при высеве почвенной суспензии на среду, содержащую соли MgCb и Na2S04 в 5%-ной концентрации и рН 9,0.
Численность актиномицетов в засоленных почвах оказалась на 1,3 порядка ниже меньше по сравнению с количеством актиномицетов, выявляемом в дерново-подзолистой почве и черноземе соответственно.
В исследованных нами засоленных почвах выявлено присутствие представителей родов Streptomyces и Micromonospora, причем представители рода Micromonospora проявляли меньшую, чем стрептомицеты, приспособленность к росту при высокой концентрации соли в среде. Из литературы известно, что выделенные из засоленных почв актиномицеты относятся к родам Streptomyces, Nocardiopsis, Actinopolyspora, Nocardioides, Microbispora (Wang et al., 1994; Li et al., 2003). Нам не удалось в литературе последних обнаружить ссылки на выделение из почвы галофильных микромоноспор,хотя в определители (Определитель бактерий Берджи, 1997) описан вид Micromonospora halophitica, устойчивый к 4%-ной концентрации NaCl.
С увеличением концентрации солей и значения рН в среде выделения увеличивается видовое разнообразие стрептомицетов, выделяемых из исследованных засоленных почв. Очевидно, среди видов стрептомицетов, принадлежащих к секциям Helvolo-flavus и Roseus существуют формы, которым свойственна галофилия. Это предположение основано на тосм экспреиментально установленном факте, что представители перечисленных секций стрептомицетов выделяются из засоленных почв на среде с повышенной концентрацией хлоридов и сульфатов (5%-ная концентрация MgCI2 и Na2SC 4). Нам удалось выделить галоалкалофильный актиномицет Streptomyces pluricolorescens шт. 2, принадлежащий к секции Helvolo-flavus серии Helvolus.
Стрептомицеты реализуют так называемую «стратегию поиска», их рост подчиняется линейному закону, а скорость роста практически постоянна. Это позволило нам, используя показатели радиальной скорости роста колоний стрептомицетов на среде с разными концентрациями NaCl и разными значениями рН, определить оптимальные и ограничительные для роста культур, выделенных из засоленных почв, значения концентрации соли и рН. Выделены группы негалофильных стрептомицетов, диапазон концентраций NaCl, пригодных для роста этих культур лежит в области от О до 5 %, оптимальная радиальная скорость роста колонийнаблюдается при 1%-ной концентрации соли. Слабо галофильные культуры оптимально растут при 2%-3%-ной концентрации соли, диапазон роста отмечен при концентрации соли от 1% до 7%. Умеренные галлофилы оптимально растут при 5% NaCl. Диапазон их роста отмечен в области концентраций соли от 2% до 8%.
В засоленных почвах обнаружены нейтрофильные стрептомицеты, предпочитающие для роста среду с рН 7,2; диапазон значений рН, пригодных для роста лежит в области от 5,0 до 9,0. Культуры, оптимально растущие при рН 8,0 - 9,0 и слабо растущие при 5,8, выделены из щелочных засоленных почв на среде с рН 9.
Таким образом, установлено, что оптимальные для роста стрептомицетов значения концентрации соли и значения рН среды корелируют созначениями концентрации соли и рН в среде выделения и в почве, из которой выделены стрептомицеты.
Очевидно, способность культур расти на среде с повышенной концентрацией соли и повышенным значением рН является генетически закрепленным признаком. Это положение подтверждается установленным экспериментально фактом, что галоалкалофильные стрептомицеты сохраняют способность оптимально расти при концентрации соли 5% и рН 9 даже после многочисленных пересевов на среду с 0,02%-ной концентрацией соли и рН 7,0.
В работе впервые показано, что актиномицеты в засоленной почве растут, выявлено присутствие мицелия, длина которого достигает 140 м/г почвы.
У гаоаалкалофильного стрептомицета наблюдаются особенности роста на щелочной (рН 9) среде с концентрацией солей MgCl2 и Na2S04 равной 5%, заключающиеся в следующем: удлинение стадий жизненного цикла - задержка спорообразования во времени по сравнению с образованием спор на среде с 0,02-ной концентрацией солей - и высокая радиальная скорость роста колоний. Можно предположить, что галоалкалофильные стрептомицеты обладают особым механизмом адаптации к условиям повышенного содержания солей. Обладание этим механизмом позволяет галоалкалофильным формам успешно конкурировать с негалофильными за счет быстрого освоения субстрата.
