Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. нейроэндокринные новообра зования пищеварительной системы (нэн пс). клинико морфологические особенности нозологической группы 11
1.1 Эволюция подходов к номенклатуре и классификации НЭН ПС 11
1.2 Современная гистологическая классификация НЭН ПС 13
1.3 Особенности гистологического строения первичных и метастатических НЭН ПС 14
1.4 Особенности иммунофенотипа первичных и метастатических НЭН ПС 14
1.4.1 Диагностические маркеры 15
1.4.2 Прогностические маркеры 20
1.5 Градация и особенности экспрессии Ki-67 в первичных и метастатиче ских НЭН ПС 26
1.6 Семейство белков CRABP. Особенности экспрессии и клиническая зна-чимость CRABP-1 в НЭН ПЖ 30
1.7 Заключение 32
Глава 2. Материал и методы исследования 33
2.1 Общая характеристика клинико-морфологических параметров НЭН ПС
и критерии отбора клинических случаев для анализа 33
2.2 Подготовка гистологических препаратов. Морфологическая характери-стика НЭН ПС 41
2.3 Подготовка иммуногистохимических препаратов. Оценка экспрессии маркеров 42 2.4 Методы статистического анализа данных. Математический анализ 48
Результаты и обсуждение
ГЛАВА 3. Особенности гистологической структуры и иммуногистохимической экспрессии маркеров в НЭН ПС 49
3.1 Особенности гистологической структуры первичных и метастатических НЭН ПС 49
3.2 Ткане- и органоспецифичные ИГХ маркеры в первичных и метастати-ческих НЭН ПС 56
3.3 Нейроэндокринные ИГХ маркеры в первичных и метастатических НЭН ПС 62
3.4 Дифференциально-диагностические ИГХ маркеры в метастазах НЭН ПС без выявленного первичного очага 65
3.5 ИГХ определение специфических гормонов в первичной опухоли и метастазах НЭО ПЖ 68
3.6 ИГХ маркеры прогноза в НЭО ПЖ 72 Обсуждение 77
ГЛАВА 4. Определение степени злокачественности и пролиферативной активности первичных НЭО ЖКТ и ПЖ 86
4.1. Особенности экспрессии Ki-67 в НЭО ЖКТ и ПЖ 86
4.2. Взаимосвязь уровня Ki-67 в НЭН ПС с клинико-морфологическими параметрами 92
4.3. Сравнительный анализ степени злокачественности в зависимости от локализации первичной опухоли 105
4.4. Прогностическая значимость индекса Ki-67 в группе больных локализованными формами НЭО ПС 106
Обсуждение 117
ГЛАВА 5. Экспрессия KI-67 в регионарных и отдаленных метаста ЗАХ НЭО ЖКТ и ПЖ
5.1. Экспрессия Ki-67 в регионарных метастазах НЭО ЖКТ и ПЖ 124
5.2. Экспрессия Ki-67 в синхронных и метахронных отдаленных метастазах НЭО ЖКТ и ПЖ 125
5.3. Сравнительный анализ степени злокачественности первичных НЭО ЖКТ и ПЖ и соответствующих метастазов 129
5.4 Влияние химиотерапии на пролиферативную активность отдаленных метастазов НЭО ЖКТ и ПЖ в печени 133
5.5. Прогностическая значимость индекса Ki-67 в группе больных метастатическими НЭО ПС 135
Обсуждение 138
ГЛАВА 6. Экспрессия CRABP-1 В НЭО ПЖ 142
6.1. Особенности экспрессии CRABP-1 в НЭН ПЖ 142
6.2. Взаимосвязь уровня экспрессии CRABP-1 с клинико-морфологическими параметрами и индексом Ki-67 НЭН ПЖ 144
6.3. Прогностическая значимость экспрессии CRABP-1 в НЭО ПЖ 146 Обсуждение 148 ГЛАВА 7. Заключение 151
Выводы 156
Практические рекомендации 158
Список литературы
- Особенности гистологического строения первичных и метастатических НЭН ПС
- Подготовка гистологических препаратов. Морфологическая характери-стика НЭН ПС
- Нейроэндокринные ИГХ маркеры в первичных и метастатических НЭН
- Прогностическая значимость индекса Ki-67 в группе больных локализованными формами НЭО ПС
Введение к работе
Актуальность темы.
Нейроэндокринные новообразования пищеварительной системы (НЭН ПС) представляют собой редко встречающиеся опухоли, исходящие из клеток диффузной эндокринной системы [DeLellis 2007]. Возросшая в последние десятилетия заболеваемость НЭН ПС приблизила их по частоте встречаемости к лимфоме Ходжкина и опухолями яичка [Modlin 2008]. По распространенности среди опухолей пищеварительной системы НЭН занимают второе место, уступая только раку толстой кишки [Modlin 2005].
В последние десятилетия отмечено увеличение заболеваемости НЭН ПС с 1,09 в 1973 г. до 5.25/100000 в 2004 г. [Yao 2008]. Заболеваемость НЭН ПС отмечена во всех возрастных группах, пик ее приходится на пятое десятилетие. Мужчины болеют несколько чаще женщин. Причиной роста частоты выявления НЭО, по мнению исследователей, следует считать совершенствование методов диагностики и обследования больных.
НЭН ПС обладают вариабельным биологическим поведением, их прогноз и тактика лечения могут значительно варьировать. Так, среди высокодифференци-рованных НЭН благоприятным прогнозом отличаются опухоли аппендикса и тонкой кишки, тогда как отдельные подтипы опухолей желудка и двенадцатиперстной кишки могут протекать более агрессивно [Янкин 2005, Soga 2005, Graeme-Cook 2009].
Существование столь гетерогенной группы новообразований делает актуальным создание универсальной классификации, отражающей их биологические особенности. В настоящее время практическое применение получила классификация НЭН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и поджелудочной железы (ПЖ), разработанная Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ, 2010) на основе системы градации гистологической степени злокачественности, предложенной ранее Европейским обществом по изучению нейроэндокринных опухолей (ENETS), и системы TNM-стадирования.
Несмотря на широкое применение современной системы градации НЭН ПС, малоизученным остается вопрос, посвященный повышению степени злокачественности первичной опухоли с течением времени, а также ее изменениям в метастазах по сравнению с исходным очагом [Klimstra 2010]. Имеются отдельные данные, что не только в пределах одного опухолевого узла, но и в процессе развития первичной опухоли и ее метастазов пролиферативная активность, измеряемая с помощью ядерного антигена Ki-67, может отличаться в значительной степени [Qvigstad 1999, Dhall 2011]. При этом особую важность приобретает оценка степени злокачественности НЭО в метастазах, так как именно уровень пролифера-тивной активности опухолевых клеток является определяющим фактором выбора схемы химиотерапии [Tang 2008, Klimstra 2010].
Помимо индекса пролиферативной активности, актуальным является изучение экспрессии маркеров, отражающих особенности клинического течения и прогноз НЭО ПС. В отношении таких факторов, как цитокератин 19, рецепторы прогестерона, C-KIT и CD99 в литературе имеются данные, подтверждающие клиническую значимость их экспрессии в НЭО, однако, результаты исследований носят противоречивый характер [Goto 2004, Schmitt 2007, Knosel 2012].
Новым, ранее не изученным в НЭО, маркером индивидуального прогнозирования может служить цитоплазматический белок, связывающий ретиноевую кислоту – CRABP1. Экспрессия CRABP1 была выявлена как при in vitro моделировании эмбриогенеза островков Лангерганса, так и при развитии НЭО ПЖ у лабораторных животных [Dodge 2009; Colvin 2011].
Кроме того, интерес представляет анализ экспрессии диагностических маркеров во вторичных очагах опухолевого роста, так как более 60% больных НЭН ПС на момент постановки диагноза имеют отдаленные метастазы [Кубышкин 2004, Modlin 2008, Caplin 2010]. В частности, значительные трудности возникают при исследовании метастазов НЭН без выявленного первичного очага, что объясняется сходством гистогенеза и иммунофенотипа НЭО ПС [DeLellis 2010]. Тем не менее, показано, что использование антител к таким транскрипционным факторам
как CDХ-2 и TTF-1 в 60-85% случаев позволяет установить кишечную или легоч-4
ную органную принадлежность первичной опухоли [Sangoi 2010]. При этом, экспрессия в НЭО факторов ISL1, PDX-1 и РАХ-8, отвечающих за панкреатическую дифференцировку, остается недостаточно изученной [Ozcan 2011].
Цель исследования. Изучение клинической значимости особенностей им-мунофенотипа и пролиферативной активности первичных и метастатических НЭН ПС с учетом морфологических критериев и прогноза заболевания. Задачи исследования.
-
Изучить клинико-морфологические особенности НЭН ПС, провести их оценку и градацию в соответствие с современными критериями ВОЗ и TNM-стадирования.
-
Провести сравнительный анализ морфологических и иммунофенотипиче-ских особенностей клеток первичных и метастатических НЭН ПС.
-
Проанализировать уровень пролиферативной активности и сравнить степень злокачественности в первичных опухолях и соответствующих регионарных и отдаленных метастазах на основании определения индекса Ki-67.
-
Изучить особенности ИГХ экспрессии и прогностическую значимость маркеров CK19, PR, C-KIT, CD99 в НЭО ПЖ.
-
Определить наличие и особенности ИГХ экспрессии белка CRABP1 в НЭН ПЖ, проанализировать связь его экспрессии с клинико-морфологическими и прогностическими параметрами заболевания.
-
Провести статистический анализ полученных данных и определить наиболее значимые прогностические критерии НЭН ЖКТ и ПЖ.
Научная новизна.
В работе впервые проведено комплексное морфоиммуногистохимическое исследование первичных и метастатических НЭН ПС с использованием широкой панели дифференциально-диагностических и прогностических маркеров. Получены данные об изменении пролиферативной активности клеток первичной опухоли в ее синхронных и метахронных метастазах. Впервые выявлена иммуногистохи-мическая экспрессия белка CRABP1 в НЭН ПЖ и изучена ее связь с клинико-морфологическими и прогностическими параметрами заболевания.
Практическая значимость. В работе проведено сравнительное изучение иммуноморфологических особенностей первичных и метастатических НЭН ПС, которое дает возможность проведения более точной дифференциальной диагностики НЭН различной локализации, а также позволяет повысить точность определения степени злокачественности и прогноза НЭН ПС, что будет способствовать выбору адекватной тактики лечения пациентов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
НЭН ПС – новообразования, имеющие характерные морфологические и иммунофенотипические особенности, которые достоверно не различаются между первичными и метастатическими очагами новообразования.
-
НЭН ПС могут демонстрировать достоверное увеличение пролиферативно-го индекса (ПИ) и степени злокачественности опухоли в регионарных и отдаленных метастазах.
-
CRABP1 является одним из факторов, участвующих в механизмах прогрессии НЭН ПЖ и связанных с увеличением степени злокачественности опухоли.
Апробация диссертации. Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников отдела патологической анатомии опухолей человека, отделения опухолей печени и поджелудочной железы, отделения абдоминальной онкологии, отделения проктологии, лабораторий клинической биохимии и клинической онкогенетики ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН 19 ноября 2013 г. Основные положения работы доложены на 9th Annual ENETS Conference (Копенгаген 7-9 марта 2012 г.), ХХ Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 16 апреля 2013 г.), ХХI Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 7 апреля 2014 г.), 25th European Congress of Pathology (Лиссабон, 2 сентября 2013 г.), ХХ Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России - 2013» (Москва, 2 октября 2013 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 7 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, разработан дизайн исследования, выкопировка данных из медицинской документации, проанализированы рутинные и иммуногистохимические препараты исследуемых случаев. Под руководством и при непосредственном участии автора проведено внедрение новых алгоритмов диагностики нейроэндокринных новообразований пищеварительной системы с использованием иммуногистохимических маркеров. Статистическая обработка данных, полученных в ходе исследования, проведена с личным участием автора. Автором осуществлен анализ и интерпретация полученных данных, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертационная работа.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - «онкология», конкретно пунктам 2, 3, и паспорту специальности 14.03.02 - «патологическая анатомия», конкретно пунктам 2, 4, 5.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах, состоит из введения, обзора литературы, клинико-морфологической характеристики исследуемого материала и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 11 отечественных и 163 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 44 рисунками.
Особенности гистологического строения первичных и метастатических НЭН ПС
DeLellis и соавт. [DeLellis 2010] были суммированы результаты исследований гормонального профиля первичных и метастатических НЭО ЖКТ. Авторы показали, что в НЭО среднего отдела эмбриональной кишки, являющихся в большинстве случаев ЕС-клеточными, экспрессия серотонина встречается в 89% случаев, тогда как в НЭО переднего и заднего отдела эмбриональной кишки - в 13-30% случаев. Экспрессия соматостатина наиболее часто встречается в передне-и заднекишечных НЭО, но крайне редка в среднекишечных опухолях. Для части передне- и заднекишечных НЭО характерна экспрессия глюкагона и -субъединицы хорионического гонадотропина. Характерной для НЭО проксимальной части ДПК является экспрессия гастрина.
Несмотря на специфичность связи клеточного состава опухоли с экспрессией гормонов, показано, что многие НЭО часто имеют полигормональный статус, значительно осложняющий процесс диагностического поиска [Solcia 1997, De-Lellis 2004, Bosman 2010]. Кроме того, непостоянство экспрессии гормонов ограничивает их применение на практике и отводит ведущее место в ИГХ диагностике НЭО ПС транскрипционным факторам (ТФ). Среди последних хорошо себя зарекомендовали и вошли в широкое практическое применение CDX-2 и TTF-1.
По данным большинства исследователей [Moskaluk 2003, Barbareschi 2004, La Rosa 2004, Lin X 2007, Schmitt 2008, Srivastava 2009] экспрессия CDX-2 и TTF-1 в первичных и метастатических НЭО является взаимоисключающей для опухолей гастроэнтеропанкреатической и легочной локализации, соответственно.
Несмотря на то, что экспрессия CDX-2 характерна для НЭО ПС, она отличается значительной вариабельностью внутри этой группы, что может быть связано с органной принадлежностью и клеточным составов опухоли. Так, в большинстве исследований экспрессия CDX-2 не была обнаружена в первичных или метастатических ECL-клеточных НЭО желудка [La Rosa 2004, Lin X 2007, Schmitt AM 2008, Srivastava A 2009], тогда как среди первичных НЭО ПЖ она варьировала от 0 до 40% [Moskaluk 2003, Lin 2007, Schmitt AM 2008, Srivastava 2009]. Было показано, что наибольшей частотой экспрессии обладают панкреатические и дуоденальные гастриномы, где CDX-2 выявлялся в 50-100% случаев [La Rosa 2004, Hermann G 2011], тогда как частота экспрессии CDX-2 в инсулиномах и глюкагономах не превышала 35% и 14%, соответственно.
Противоречивый характер носят сообщения о частоте экспрессии CDX-2 в метастатических очагах НЭО, где она не превышает 50% для опухолей панкреатического происхождения, но может достигать 100% в метастазах НЭО двенадцатиперстной кишки [Barbareschi 2004, Schmitt 2008, Srivastava 2009, Denby 2012, Koo 2012].
Высокой частотой экспрессии CDX-2 характеризуются ЕС-клеточные НЭО, относящиеся к среднему отделу эмбриональной кишки, где маркер встречается в 100% случаев [La Rosa 2004]. Экспрессия CDX-2 также встречается в 52-100% первичных и 61-100% метастатических НЭО тонкой кишки, аппендикса и правой половины ободочной кишки, но, при этом, заметно снижается в НЭО прямой кишки, колеблясь в пределах 0-78% [Moskaluk 2003, Barbareschi 2004, Lin X 2007, Schmitt 2008, Srivastava 2009, Koo 2012]. По данным Graeme-Cook [Graeme-Cook 2009], первичные и метастатические L- и ЕС-клеточных НЭО прямой кишки являются CDX-2-негативными.
Анализ экспрессии ТФ панкреато-дуоденальной дифференцировки показал, что ее распределение среди широкого спектра опухолей носит неоднородный характер и, аналогично CDX-2, может зависеть от клеточного состава опухоли. Так, экспрессия РАХ-8 отмечена в 35-88% НЭО ПЖ независимо от их клеточного состава, но, при этом, наблюдается только в 15% инсулином, 2% глюкагоном и полностью отсутствует в гастриномах. Отмечена корреляция экспрессии РАХ-8 со степенью дифференцировки НЭО [Sangoi 2011, Yachida 2012].
По данным разных авторов [Srivastava 2009, Park 2011], частота экспрессии PDX-1 в НЭО ПЖ варьирует от 28% до 100%, встречаясь в 90-100% гастрином, 90% инсулином, 20% соматостатином, 14% глюкагоном и отсутствуя в РР-позитивных опухолях [Hermann 2011]. Экспрессия ISL1 отмечена в 64-82% НЭО ПЖ [Schmitt 2008], встречаясь в 100% РР- или соматостатин-позитивных опухолей, 84-100% инсулином, 75% ВИПом, 71-100% глюкагоном и лишь в 25-50% гастрином [Schmitt 2008, Hermann 2011]. Среди НЭО ДПК, по разным данным, частота экспрессии РАХ-8 может варьировать от 0 до 100% случаев, а экспрессия PDX-1 и ISL1 наблюдается в 80% и 50% случаев соответственно. При этом экспрессия ISL1 встречалась в 100% случаев D- или G-клеточных НЭО ДПК, а PDX-1 экспрессировали 100% G-клеточных и 50% D-клеточных НЭО [Schmitt 2008, Hermann 2011].
Высокая диагностическая ценность панкреато-дуоденальных ТФ была продемонстрирована при исследовании метастатических очагов НЭО ПС. Так, экспрессия РАХ-8 и ISL1 в метастазах НЭО ПЖ была отмечена в 65% и 68% случаев, соответственно [Long 2010, Haynes 2011, Ozcan 2011, Sangoi 2011, Koo 2012], а экспрессия PDX-1 и ISL1 в метастазах дуоденальных НЭО, по данным разных авторов, колебалась от 0 до 100% случаев [Schmitt 2008, Fendrich 2009].
Приведенные данные показывают, что ИГХ методы исследования обладают высокой дифференциально-диагностической ценностью при изучении НЭО ПС и позволяют не только с большой точностью верифицировать клеточный состав опухоли, но и определить наиболее вероятную первичную локализацию метастатического очага.
Подготовка гистологических препаратов. Морфологическая характери-стика НЭН ПС
Результаты экспрессии оценивались как сумма баллов от 0 до 8 с учетом количества (+1 - 25% клеток, +2 – 25-50% клеток, +3 – 50-75% клеток, +4 - 75% клеток) и интенсивности окраски ангитен-позитивных клеток (+1 – слабая, +2 – умеренная светло-коричневая окраска, +3 – интенсивная, коричневая окраска, +4 – интенсивная, темно-коричневая окраска). Реакция определялась в цитоплазме опухолевых клеток. В клетках и неклеточных структурах стромы опухоли экспрессия маркера отсутствовала. Позитивным контролем экспрессии CRABP-1 служили островки Лангерганса, где отмечалась интенсивное окрашивание преимущественно периферических клеток. Негативным контролем экспрессии маркера служили клетки протокового эпителия. 0-2 балла соответствовали низкому уровню экспрессии CRABP-1, 3-5 баллов – среднему, 6-8 баллов – сильному.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии CD99, CK19, CD117 и рецепторов прогестерона в НЭН ПЖ. Исследования экспрессии CD99, CK19, CD117 и PR было выполнено на парафиновых блоках операционного материала первичных высокодифференцированных НЭН ПЖ 57 больных, возраст которых составил 22-79 лет (в среднем – 53,1 года). Случаи мелкоклеточного рака были исключены из исследования. Соотношение женщин и мужчин – 1,47 (34 женщины, 23 мужчины). Среди высокодифференцированных НЭО было 56 нефункцио-нирующих опухолей и одна инсулинома. Размеры первичных опухолей варьировали от 1,2 до 14 см (в среднем – 5,4 см). Всем больным была выполнена радикальная операция в объеме дистальной субтотальной резекции поджелудочной железы или гастропанкреатодуоденальной резекции. Период послеоперационного наблюдения варьировал от 6 до 182 мес (в среднем – 48 мес). За период наблюде 47 ния умерло 7 больных через 6-63 мес (в среднем – 20,3 мес), у 14 больных отмечено прогрессирование заболевания через 2-81 мес (в среднем – 23,7 мес). При анализе экспрессии маркеров учитывались размер первичной опухоли, степень злокачественности, наличие местной, сосудистой и нейроинвазии, очагов некроза, регионарных и отдаленных метастазов. Дополнительно оценивался общий показатель неблагоприятных событий, включавший наличие синхронных и/или ме-тахронных отдаленных метастазов, местный рецидив опухоли, смерть больных, наступившую в результате прогрессирования заболевания.
Экспрессия всех маркеров оценивались с учетом интенсивности окраски ан-гитен-позитивных клеток (1 балл – слабая, слегка превышающая фоновую, окраска, 2 балла – умеренная светло-коричневая окраска, 3 балла – интенсивная, коричневая окраска) и считалась положительной в зависимости от количества окрашенных клеток опухоли. Экспрессия СК19 считалась положительной при слабом окрашивании 10% клеток опухоли или при умеренном и выраженном окрашивании 5% клеток. Экспрессия СD117 считалась положительной при слабом окрашивании 100% клеток опухоли, при умеренном или выраженном окрашивании 20% и 5% клеток соответственно. Экспрессия PR считалась положительной при слабом или умеренном окрашивании 75% клеток опухоли или при выраженном окрашивании 10% клеток. Экспрессия CD99 считалась положительной только при интенсивном окрашивании 5% клеток опухоли, независимо от локализации окраски (мембранная или цитоплазматическая).
Ядерная экспрессия маркера не учитывалась. Позитивным контролем экспрессии CD99 служили островки Лангерганса, где отмечалось интенсивное окрашивание клеток. Негативным контролем служила эпителиальная выстилка протоков поджелудочной железы.
Реакция к CК19 определялась в цитоплазме опухолевых клеток. Ядерная экспрессия маркера отсутствовала. Позитивным контролем экспрессии CК19 служил протоковый эпителий поджелудочной железы, где отмечалось интенсивное окрашивание цитоплазмы клеток. Негативным контролем служили островки Лан-герганса. Реакция с PR определялась в ядрах опухолевых клеток. Мембранная и ци-топлазматическая экспрессия не учитывались. Позитивным контролем экспрессии PR служили островки Лангерганса, где отмечалось интенсивное окрашивание клеток. Негативным контролем служила эпителиальная выстилка протоков поджелудочной железы.
Реакция к CD117 определялась в цитоплазме опухолевых клеток. Ядерная экспрессия не учитывалась. Позитивным контролем экспрессии CD117 служили траневые базофилы. Негативным контролем служили островки Лангерганса.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии инсулина, гастрина, глюкагона, серотонина и соматостатина в НЭН ПЖ. Исследования экспрессии 4 гормонов и серотонина было выполнено на парафиновых блоках операционного материала первичных и метастатических НЭО ПЖ 20 больных, возраст которых составил 23-66 лет (в среднем – 49,5 лет). Соотношение женщин и мужчин – 1,5 (12 женщин, 8 мужчин). Группа включала 19 нефункционирующих опухолей и одну инсулиному. Размеры первичных опухолей варьировали от 3 до 14 см (в среднем – 6,4 см). Всем больным была выполнена радикальная операция в объеме дистальной субтотальной резекции поджелудочной железы или гастропанкреато-дуоденальной резекции. Период послеоперационного наблюдения варьировал от 20 до 106 мес (в среднем – 44.6 мес). Случаи низкодифференцированного нейро-эндокринного рака были исключены из исследования. При анализе экспрессии гормонов и серотонина учитывались размер первичной опухоли, степень злокачественности, наличие сосудистой и периневральной инвазии, очагов некроза, регионарных и отдаленных метастазов.
Нейроэндокринные ИГХ маркеры в первичных и метастатических НЭН
Выраженные изменения в строении метастазов встречались достаточно редко - 2,3% от общего числа метастатических случаев. Так, гнездное строение первичной НЭО ПЖ изменилось на гнездно-ацинарное в отдаленном метастазе, а крупноклеточный НЭР солидного строения в связи с появлением выраженного фиброза приобрел гнездно-трабекулярное строение в отдаленном метастазе.
Сравнительный анализ строения первичных и метастатических НЭН ПС показал, что в большинстве случаев вторичные очаги опухолевого роста либо были гистологически идентичными исходной опухоли (82,8% случаев), либо их строение незначительно отличалось от первичного очага (14,9%). В единичных случаях строение метастазов значительно отличалось от первичной опухоли, что, однако, не выходило за рамки морфологии, типичной для НЭО данной локализации. Полученные данные указывают на крайне низкую частоту изменения морфологического строения метастазов по сравнению с первичными НЭО ПС.
Среди основных недостатков светооптической диагностики строения метастазов НЭО неизвестной локализации следует назвать весьма низкую специфичность данного параметра. В связи с этим, по мнению ряда авторов, определение первичной локализации опухоли на основании оценки строения ее метастазов не может иметь самостоятельного значения и требует применения дополнительных и более специфичных методов исследования [Гуревич 1997, Heitz 2004, Hruban 2007, Anlauf 2008].
Вторым после светооптического и обязательным элементом диагностики НЭН ПС является иммуногистохимическое подтверждение эпителиальной и нейроэндокринной дифференцировки клеток опухоли. В связи с этим нами была проведена сравнительная оценка экспрессии ряда диагностических цитокератинов и нейроэндокринных маркеров в первичных и метастатических НЭН ПС.
Результаты исследования показали, что локализация в клетках и интенсивность окраски АЕ1/АЕ3 и СК18 в первичных и метастатических НЭН ПС, независимо от гистологического строения и органной принадлежности, достоверно не различалась (р=0,35). Сходными являлись результаты исследования экспрессии нейроэндокринных маркеров в первичных и метастатических НЭН ПС. Локализация и интенсивность окраски Syn и CgА в первичных и метастатических НЭН ПС, независимо от гистологического строения и органной принадлежности опухоли, достоверно не различалась (р=0,87). Чувствительность экспрессии эпителиальных и нейроэндокринных маркеров в первичных и метастатических высокодифферен-цированных НЭО ПС составляла 100%.
До 75% случаев нейроэндокринных карцином независимо от органной принадлежности характеризовались снижением интенсивности экспрессии и фракции антиген-позитивных клеток по сравнению с высокодифференцированными опухолями. Достоверных различий между первичными и метастатическими очагами в экспрессии цитокератиновых филаментов отмечено не было (р=0,35). Чувствительность экспрессии СК18 и АЕ1/АЕ3 в первичных и метастатических НЭР ПС составляла 100%.
Клетки НЭР демонстрировали пониженную интенсивность и распространенность экспрессии Syn и CgА, без достоверных различий между первичными и метастатическими очагами (р=0,87). Чувствительность экспрессии Syn и CgА в первичных НЭР ПС составляла 100% и 62,5%, соответственно, в метастазах -100% и 40,0%, соответственно.
Также показано, что увеличение доли солидных структур в метастазах вы-сокодифференцированных НЭО не оказывает достоверного влияния на экспрессию маркеров эпителиальной (АЕ1/АЕ3, СК18) и нейроэндокринной (Syn, CgА) дифференцировки (р=0,58 и р=0,20, соответственно). Аналогично предыдущим исследованиям [Graeme-Cook 2009, DeLellis 2010, Bosman 2010, Chan ES 2012], мы не обнаружили достоверной связи экспрессии нейроэндокринных маркеров с органной принадлежностью опухолей (р=0,32).
Полученные данные подтверждают высокую диагностическую ценность данных маркеров при исследовании первичных и метастатических НЭН ПС.
Диагностическая ценность СК7 и СК20 была изучена на серии НЭН ПС, включая один метастаз НЭО без выявленного первичного очага. Обнаружено, что 62,0% опухолей не экспрессировали ни один из этих маркеров, тогда как в остальных случаях экспрессия СК7 и СК20 была ассоциирована с органной принадлежностью опухоли. Так, НЭО ПЖ характеризовались иммунофенотипом СК7+/СК20-, являющегося типичным для протокового панкреатического эпителия (14,3% случаев). 19,0% случаев, куда входили НЭО ЖКТ и мелкоклеточный рак пищевода, имели иммунофенотип СК7-/СК20+, сходный с иммунофенотипом слизистой оболочки тубулярных отделов ЖКТ. Единственной опухолью с имму-нофенотипом СК7+/СК20+ был метастаз без выявленного первичного очага (4,7% случаев). Оценка экспрессии СК7 и СК20 в метастазах НЭН показала отсутствие значимых различий по сравнению с первичными опухолями (р=0,64). Сходные данные были получены и другими исследователями [Chu PG 2002, Erickson 2004, Chan 2012, Brenner 2007, La Rosa 2012].
Таким образом, полученные данные указывают на сравнительно низкую диагностическую ценность СК7 и СК20 при исследовании НЭН ПС, что не позволяет рекомендовать их к использованию в рутинной практике.
Прогностическая значимость индекса Ki-67 в группе больных локализованными формами НЭО ПС
В связи с тем, что часть больных с метастазами НЭО ПС в печени проходит предоперационную химиотерапию, мы провели дополнительный анализ влияния химиотерапевтического лечения на пролиферативную активность опухолей. Показано, что рост пролиферативной активности в отдаленных метастазах, несмотря на проводимую химиотерапию, встречался в 50% случаев. Снижение пролифера-тивной активности или отсутствие ее изменений наблюдалось в 10% и 40% случаев, соответственно.
Результаты исследования индекса Ki-67 метастазов после проведения химиотерапии показывают, что частота и характер изменений пролиферативной активности аналогичен таковым в общей группе отдаленных метастазов. Таким образом, полученные данные указывают на то, что рост пролиферативной активности в метастазах НЭО ПС является достаточно частым событием, в том числе, несмотря на проведение химиотерапевтического лечения.
Принимая во внимание рост пролиферативной активности метастазов по сравнению с первичной опухолью, мы изучили характер влияния возросшей про-лиферативной активности на степень злокачественности опухоли.
Установлено, что рост пролиферативной активности во вторичных очагах метастатических НЭО ПС сопровождался повышением степени злокачественности опухоли в 10 (16,4%) наблюдениях, 9 (90,0%) из которых приходились на отдаленные метастазы и 1 (10,0%) – на регионарные. В частности, в одном (10,0%) регионарном и 5 (50,0%) отдаленных метастазах отмечено повышение низкой степени злокачественности (G1) до уровня промежуточной (G2). В 4 (40,0%) отдаленных метастазах отмечено повышение промежуточной степени злокачественности (G2) до уровня высокой (G3).
Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований. Так, Lindholm с соавт. [Lindholm 2011] отметили, что изменение степени злокачественности НЭО ПС чаще встречается в отдаленных метастазах и чаще характеризуется ее повышением. При этом Dhall с соавт. [Dhall 2011] установили,
что рост низкой степень злокачественности до уровня промежуточной в метастатических очагах НЭО наблюдалась лишь в 3,5% случаев. В свою очередь, нам удалось выявить возможность изменения промежуточной степени злокачественности до уровня высокой.
Оценка влияния на выживаемость роста степени злокачественности в отдаленных метастазах у больных НЭО ПЖ не показала достоверных различий в обеих исследуемых группах. В обоих случаях прогностическая значимость степени злокачественности для НЭО ПЖ была статистически достоверной (p=0,01 и p=0,03, соответственно). При этом нам не удалось продемонстрировать достоверные результаты влияния на выживаемость степени злокачественности НЭО ЖКТ. Показатели выживаемости больных НЭО ЖКТ при исходной и переоцененной степени злокачественности опухолей не имели достоверных различий (p=0,28 и p=0,11, соответственно).
Анализ влияния степени злокачественности опухоли на ОВ и БРВ больных с наличием метастазов показал отсутствие достоверных различий в прогнозе заболевания (р=0,12 и р=0,15, соответственно), что может объясняться низкой 5-летней прослеженностью больных данной группы, равной 45,7%.
Результаты проведенного исследования показывают, что пролиферативная активность и степень злокачественности метастатических опухолей способна возрастать в 45,9% и 16,4% случаев, соответственно.
В свою очередь, увеличение степени злокачественности в метастатических опухолях приобретает особую важность в свете того, что именно уровень проли-феративной активности НЭН ПС является ведущим фактором при выборе оптимальной схемы химиотерапевтического лечения больных [Modlin 2008, Bettini 2008, Bosman 2010].
Данный раздел исследования проведен с целью выявления особенностей иммуногистохимической экспрессии цитоплазматического белка, связывающего ретиноевую кислоту (CRABP1), в НЭН ПЖ и ее связи с клинико-морфологическими параметрами опухоли и прогнозом заболевания.
Особенности экспрессии CRABP1 в опухоли. Позитивная экспрессия CRABP1 выявлена в 31 (43,7%) НЭН ПЖ, включая одну (16,7%) НЭН G1, 24 (42,1%) НЭН G2 и 6 (75%) НЭН G3 (Рисунок 43Б-Е). Фокальная интенсивная экспрессия маркера также была отмечена в отдельных клетках островков Лангерган-са вне зоны роста опухоли (Рисунок 43А). Высокий уровень экспрессии (6-8 баллов) отмечен в 16 (22,5%) случаях, включая одну НЭН G1, 9 НЭН G2, 6 НЭН G3, где доля окрашенных клеток составляла 75-100%. Наиболее интенсивной была экспрессия в 2 случаях мелкоклеточного рака. Средний уровень экспрессии (3-5 баллов) наблюдался в 15 (21,1%) случаях НЭО G2. Экспрессия CRABP1 умеренной и высокой интенсивности определялась в 25-75% клеток. Отсутствие или низкий уровень экспрессии (0-2 балла) CRABP1 был отмечен в 40 (56,3%) случаях, включавших 5 случаев НЭО G1, 33 случая НЭО G2 и 2 случая НЭН G3.
Наблюдались два основных типа окрашивания клеток НЭН ПЖ. В первом случае реакция была представлена интенсивным и гомогенным окрашиванием цитоплазмы, диффузно распределенных между CRABP1-негативными элементами и напоминала аналогичную реакцию в островках Лангерганса. Количество CRABP1-позитивных клеток варьировало от 10% до 70%. Второй вариант характеризовался диффузным и часто гетерогенным окрашиванием различной интенсивности большинства (70-100%) клеток опухоли. В клетках, формирующих ту-булярные и псевдожелезистых структуры, отмечалась апикальная конденсация CRABP1. Наиболее интенсивная экспрессия CRABP1 отмечена на периферии ряда опухолей, в зонах инвазии или в клетках опухолевых эмболов.
