Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Этапы канцерогенеза в шейке матки 12
1.1. Современные гистологические и цитологические классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки 14
1.2. Трудности гистологической диагностики плоскоклеточных неоплазий шейки матки 16
1.3 Трудности цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки 20
1.4 Возможности уточнения морфологического диагноза 22
1.5 Плоидометрия 33
Глава 2. Материал и методы 42
Глава 3. Результаты гистологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки 50
Глава 4. Результаты цитологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки 71
Глава 5. Сравнительная плоидометрическая и кариометрическая диагностика плоскоклеточных новообразований шейки матки - по гистологическим и цитологическим препаратам 97
Заключение 103
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список использованной литературы 122
Приложения 135
- Современные гистологические и цитологические классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки
- Трудности цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки
- Возможности уточнения морфологического диагноза
- Результаты цитологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки
Введение к работе
Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место в мире по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин [143]. По данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) в 1990 году РШМ составил приблизительно 10% от всех 4700000случаев злокачественных эпителиальных новообразований во всем мире [97]. В некоторых регионах, таких как Экваториальная Африка, Центральная Америка, Южная и Центральная Азия данная патология достигает 1/3 всех наиболее распространенных раков [19,143].
Уровень заболеваемости раком ШМ в разных странах неодинаков. Так, заболеваемость РШМ в последние 3-4 десятилетия в большинстве развитых стран заметно снизилась [143]. Ряд авторов связывают это с введением программ цитологического скрининга [96,118] и улучшением уровня жизни населения [81]. Уровень заболеваемости РШМ в большинстве развивающихся стран остается достаточно высоким [143].
По данным ВОЗ, уровень смертности от РШМ не имеет тенденции к снижению [143]. Ежегодно во всем мире от РШМ умирают приблизительно 230000 женщин и более 190000 из них (более 80%)- из развивающихся стран [112,131].
В Российской Федерации в последние годы отмечается стабилизация заболеваемости раком ШМ (14,9 на 100000 женского населения) и летальности (5 на 100000 женщин) [33,38], благодаря активно развивающемуся цитологическому скринингу, способствующему раннему выявлению РШМ у женщин [21,54,58]. Однако, несмотря на это, в нашей стране рак шейки матки -одна из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей [33,38].
Основным фактором, провоцирующим развитие РШМ, является вирус папилломы человека (ВПЧ или англ.НРУ), а точнее онкогенные его типы: 16,18 и 31 [40,42,89,90,95,105,108,111,113,116].
Наиболее часто РШМ выявляется в старшей возрастной группе (60-70 лет и старше), однако в последнее время появляется все больше публикаций, описывающих случаи возникновения этой патологии у женщин репродуктивного возраста [33,92,143]. Самый высокий риск возникновения дисплазий, по данным В.П. Козаченко и соавт., также имеется в молодом возрасте [36]. По данным W.D.Rosenfeld HPV впервые обнаруживается у 39% подростков во время единственного скринингового визита [132]. М. Frisch, Н. Hausen связывают это с ранним началом половой жизни и снижением иммунитета у подростков [99,104].
В связи с обширной распространенностью, высокой смертностью и заболеваемостью раком ШМ (шейки матки) лиц всё более молодого возраста, профилактика РШМ и ранняя диагностика предраковых изменений остается актуальной медицинской и социальной проблемой [19,22,26,42].
Разрешение вопросов, связанных с диагностикой рака ШМ, и особенно его ранних форм затруднено [30,84,85], поскольку при этих формах заболевания отсутствуют патогномоничные клинические симптомы: предраковые изменения чаще всего маскируются фоновыми процессами [22,46,61], начальные формы РШМ у 57,7% больных протекают клинически бессимптомно [25,143] и могут быть своевременно установлены только посредством морфологических (цитологического и гистологического) методов исследования [26]. До настоящего времени методы цитологической и гистологической диагностики по-прежнему являются наиболее доступными и распространенными из всех способов диагностики новообразований ШМ [37,127].
Однако, результаты морфологических методов исследования не всегда однозначны. Особенно это относится к оценке степени выраженности дисплазий плоского эпителия и определению начальных форм рака ШМ [28]. Нередки случаи различной интерпретации одних и тех же препаратов высококвалифицированными патологоанатомами и цитологами [29]. Пред-
6 лагаемые морфологические критерии для дифференциальной диагностики разных проявлений опухолевой прогрессии в шейке матки остаются субъективными и не могут служить одинаковой воспроизводимости диагнозов разными исследователями. Всё это обуславливает поиск более точных и объективных подходов к диагностике данной патологии.
Современные вспомогательные методики, используемые в диагностике плоскоклеточных неоплазий шейки матки (электронная микроскопия, иммуногисто- и иммуноцитохимия, молекулярно-биологические методы), не позволяют окончательно решать вопросы диагностики этой патологии в силу их недостаточной точности и дороговизны [10]. В то же время плоидометрическое исследование содержания генетического материала (ДНК) в ядрах клеток плоского эпителия ШМ в процессе канцерогенеза используется для этой цели пока недостаточно, хотя вызывает бесспорный научный [6,7] и практический интерес, так как является более экономичным и доступным в использовании методом [10].
Применение плоидометрического и кариометрического методов исследования при изучении предраковых процессов и рака может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики стадий развития онкологического процесса в шейке матки [2].
В связи с этим, целью настоящей работы явилось совершенствование дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки по данным плоидометрии при сравнительной цитологической и гистологической диагностике плоскоклеточных новообразований шейки матки. Исходя из этого задачи исследования определялись следующим образом::
На гистологическом и цитологическом материале осуществить плоидометрическое исследование ядер клеток плоского эпителия с учетом стадий канцерогенеза в шейке матки.
Определить диагностические плоидометрические критерии цервикальной интраэпителиальной неоплазий разной степени выраженности.
Установить плоидометрические показатели ядер опухолевых клеток, характерные для инвазивного рака шейки матки: плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего.
Определить возможности плоидометрии для совершенствования гистологической и цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.
Дать сравнительную оценку точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки по гистологическим и цитологическим препаратам и использовать эти данные для создания унифицированной морфометрической классификации.
Оценить возможности компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными красителями, для диагностики предрака и рака шейки матки.
Научная новизна
Впервые обоснован и апробирован метод компьютерной плоидометрии для дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.
Впервые осуществлена визуализация плоидности ядер эпителиоцитов, характеризующей стадии канцерогенеза в шейке матки на тканевом и клеточном уровне.
На основе плоидометрических и кариометрических данных впервые получен комплекс объективных характеристик, уточняющих дифференциально-диагностические критерии стадий развития плоскоклеточных новообразований шейки матки.
Впервые проведен сравнительный анализ плоидометрических и кариометрических параметров ядер плоских эпителиоцитов, характеризующих стадийность развития рака в шейке матки и
разработана морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки. Впервые предложен способ кариометрической диагностики предрака и рака шейки матки по цитологическому материалу на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов в различной цитологической окраске.
Практическая значимость полученных результатов
Полученные в работе данные позволяют использовать визуализацию плоидности и морфометрические характеристики ядер клеток плоского эпителия в качестве дополнительной информации к рутинной световой микроскопии - основному методу морфологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки.
Получение результатов компьютерной плоидометрии не связано с применением сложных и дорогостоящих методик исследования, в то же время они являются объективными количественными критериями для проведения дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки, что позволяет минимизировать диагностические ошибки и определять прогноз заболевания.
В наиболее трудных для диагностики случаях разработанная морфометрическая классификация плоскоклеточных новообразований шейки матки создает объективную основу для более четких морфологических заключений о характере неопластического процесса.
Предлагаемый способ цитологической диагностики предрака и рака шейки матки на основе измерения площади ядер плоских эпителиоцитов при различной цитологической окраске может применяться в цитологических лабораториях лечебно-диагностических учреждений.
Основные положения, выносимые на защиту
Метод компьютерной плоидометрии позволяет проводить визуализацию плоидности ядер клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия на клеточном и тканевом уровне и может быть использован при осуществлении дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки.
Разная степень выраженности средних показателей плоидности доминирующих клонов клеток плоского эпителия характеризует низкую и высокую степени цервикальной интраэпителиальной неоплазии и позволяет дифференцировать их от инвазивного плоскоклеточного ороговевающего и неороговевающего рака.
Данные компьютерной кариометрии цитологических препаратов, окрашенных различными методами, можно использовать для дифференциальной диагностики предрака и рака шейки матки.
Сравнительная оценка точности плоидометрической и кариометрической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки, проведенной по гистологическим и цитологическим препаратам, позволяет использовать сходные по значениям относительные показатели измерений (плоидность, кратность увеличения площади ядер, нарастание анеуплоидии, косвенные признаки пролиферативной активности) для создания унифицированной морфометрической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по теме: «Морфологическая диагностика опухолей и опухолеподобных состояний шейки матки» на кафедре патологической анатомии РМАПО (зав. кафедрой профессор Перов Ю.Л.); внедрены в практику цитологической лаборатории при Центре патологоанатомических исследований на базе Московской городской клинической больницы № 33 им. проф. А.А.
Остроумова, в работу патологоанатомического отделения НО «МФ МСЧ № 1 АМО ЗИЛ». Результаты компьютерной кариометрии ядер плоских эпителиоцитов в цитологических препаратах представлены к рассмотрению в качестве проекта научного изобретения. Апробация работы
Материалы диссертации доложены на 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине», (Москва, 2003); на XXI и XXII научно-практических конференциях «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2003,2004). Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики и патологической анатомии РМАПО 29.06.2004.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, изданных в отечественной печати.
Список опубликованных работ по теме диссертации:
Плоидометрическая характеристика клеток плоского эпителия при дисплазиях шейки матки. // «Успехи теоретической и клинической медицины». - М.: РМАПО, 2003. - вып. 5. - С. 139-140.
Сравнительная оценка цитологических и гистологических препаратов дисплазий и рака шейки матки по данным плоидометрических исследований. // Материалы 5-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине». - Москва, 2003. - С.5-8.
3. Дифференциальная диагностика стадий канцерогенеза в шейке матки (по
данным плоидометрического исследования ). // Архив патологии. - 2003. - том
66. - № 3.- С.23-27 (Совместно с Г.Г. Автандиловым, Т.М. Преображенской).
11 4. Сравнительная оценка точности плоидометрической диагностики предрака и рака шейки матки по результатам гистологических и цитологических исследований. // Российские медицинские вести. - 2004. - том IX. - № 2. - С.35-38 (Совместно с Г.Г. Автандиловым).
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Библиографический указатель включает в себя 149 источников (в т.ч. 69 отечественных и 80 зарубежных публикаций). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами, 28 рисунками.
Современные гистологические и цитологические классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки
В недавнем прошлом в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ опухолей и опухолеподобных поражений шейки матки (1981г.) [43,106] эпителиальные предопухолевые заболевания ШМ - дисплазии (Д) -подразделяли на слабо-, умеренно и резко выраженные Д; рак in situ и рак in situ, подозрительный на начало стромальной инвазии. В группу плоскоклеточных карцином выделяли: рак с ороговением, крупноклеточный рак без ороговения и мелкоклеточный рак без ороговения.
Среди цитологических - до настоящего времени используется классификация ВОЗ 1973г. [91], идентичная гистологической классификации 1981г.. В 60-е годы прошлого столетия термин «дисплазия» был заменен на понятие «цервикальная интраэпителиальная неоплазия» (ЦИН) (от англ - CIN: cervical intraepithelial neoplasia). Согласно этой концепции дисплазию разной степени выраженности [50] и рак in situ объединили под названием «цервикальная интраэпителиальная неоплазия» (англ.СЩ). Термин был предложен R.M. Richart в 1966г. [128]. Различают III степени выраженности CIN: CIN-I -слабо выраженная (слабая)Д; CIN-II - умеренно выраженная (умеренная) Д; под рубрикой CIN-III объединяют выраженную (тяжелую) Д и рак in situ. Согласно этой концепции, тяжелая дисплазия и рак in situ не являются последовательными стадиями малигнизации эпителия ШМ, а представляют собой различные гистологические проявления внутриэпителиальных поражений, предшествующих инвазивному раку. С целью достижения единого мнения среди исследователей и для того, чтобы в большей степени отразить биологический процесс, чем подчеркнуть гистологические проявления, для описания цервикальных мазков была внедрена в 1988 г новая классификация - Бетесда - система (The Bethesda System (TBS)) (NCI, 1989) [114]. Бетесда-система является широко востребованной в США и многих других развитых странах. В течение последних 10 лет детально обсуждается применение Бетесда-системы для классификации цитологических заключений. В этой двухстадийной системе неинвазивные плоскоклеточные поражения классифицируются следующим образом: -атипичные плоские клетки неопределенного значения (АПКНЗ) - клетки с наличием атипичных ядерных характеристик, но без изменений, подтверждающих койлоцитоз или ЦИН I; -низкая степень плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (Н-ПИП), включающая койлоцитоз и ЦИН I; - высокая степень плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (В-ПИП), включающая ЦИН II и ЦИН III. Эта классификация сейчас используется и для описания гистологических поражений. Вместе с тем "за" и "против" деления ЦИН на две или три категории, как и влияние папилломавирусной инфекции на систематизацию и терминологию, продолжают обсуждаться [47,125,138,142]. В гистологической классификации опухолей и опухолеподобных поражений ШМ 1994г. [107] термин «дисплазия» был соответственно заменен на «цервикальная интраэпителиальная неоплазия» (ЦИН), и слабые дисплазии образовали группу - ЦИН I, аналогично - умеренные - группу ЦИН II, а тяжелые дисплазии и рак in situ были объединены в группу ЦИН III. Далее следует группа плоскоклеточных карцином, которая также претерпела изменения и теперь включает: плоскоклеточный ороговевающий рак (ПОР), плоскоклеточный неороговевающий рак (ПНОР), веррукозную карциному, бородавчатую (кондилломатозную) карциному, папиллярную карциному, а также - лимфоэпителиоматозную карциному. Согласно последней гистологической классификации опухолей ШМ ВОЗ 2003г. [143] снова выделяют в отдельные группы: цервикальную интраэпителиальную неоплазию CIN III, карциному in situ и раннеинвазивную плоскоклеточную карциному (микрокарциному); далее следует группа плоскоклеточных карцином, в которую, кроме уже вошедших в классификацию 1994г., добавились базалоидная и переходноклеточная карциномы. Как подчеркивается в МКБ-0 [44] «определение степени дифференцировки новообразований весьма варьирует среди патомофологов мира», что вызывает затруднения при практическом применении классификаций и требуют создания более точных систем для объективной диагностики онкогенеза.
Как указывает Г.Н. Минкина и соавт. [47], на основании обзора эволюции морфологической номенклатуры становится очевидным, что любое изменение терминологии базируется на новой научной информации, которая меняет наши концепции, и ведет к новому взгляду на патологический процесс.
Остается дискутабельным вопрос: какая из перечисленных морфологических классификаций наиболее точно отражает суть происходящих неопластических изменений в ШМ в процессе озлокачествления и полнее отвечает требованиям онкологической практики.
Для решения этой задачи необходимо выяснение морфо-функциональных особенностей клеточных клонов в каждой из стадий канцерогенеза и получение более объективных, хорошо воспроизводимых и достоверных признаков доброкачественных и злокачественных стадий развития новообразований данной локализации. К сожалению, на сегодняшний день возможности световой микроскопии в диагностике плоскоклеточных новообразований шейки матки ограничены, в связи с чем в гистологической и цитологической диагностике последних имеется ряд трудностей.
Трудности цитологической диагностики плоскоклеточных новообразований шейки матки
Определение степени Д по цитологическим препаратам основывается на количественном соотношении клеток нормальных и подвергнутых дисплазии [45]. В.Н. Прилепская и соавторы отмечают, что при слабой степени Д в препарате выявляются до 20% клеток с дискариозом, при умеренной Д - до 20-40%, при выраженной Д в цитограмме обнаруживаются в значительном количестве клетки базального и парабазального слоев до 75% [33,53]. Несколько другие данные приводит И.П. Шабалова Согласно её данным при слабой степени Д в препарате выявляют до 10% клеток с дискариозом, при умеренной Д - до 10-20%, при выраженной Д - до 20-30%, в цитограмме ВЭР клетки базального и парабазального слоев, подвергшиеся дисплазии, составляют - более 30% [64]. Приведенные данные различных авторов наглядно демонстрируют, что критерии диагностики дисплазии носят весьма условный и приблизительный характер. Кроме того, имеется еще одна очевидная сложность диагностики данной патологии. По сведениям большинства специалистов, слабая Д является одним из наименее воспроизводимых цитологических диагнозов. Изменения, сходные с легкой Д, могут быть при воспалительных, репаративных, дегенеративных и других поражениях, кроме того указанные патологические процессы могут скрывать Д. Сложности установления степени Д чаще возникают при низком эстрогенном статусе. Клеточный состав «атрофических мазков» представлен преимущественно элементами глубоких слоев и установить степень дисплазии по выраженности ядерной патологии невозможно, поэтому в отдельных случаях дают заключение о дисплазии без указания на степень [64].
Дифференциальная диагностика выраженных (тяжелых) форм дисплазии от рака in situ тоже нередко трудна. Так, по данным А.С. Петровой [63] среди выраженных форм Д, диагностированных цитологическим методом, в 87% случаев гистологически обнаружен внутриэпителиальный или инвазивный рак. Нужно отметить, что цитологически отличить эти два процесса не всегда представляется возможным [28,45], поэтому в последние годы наблюдается тенденция к объединению ВЭР и тяжелой дисплазии в тяжелую интраэпителиальную неоплазию [61]. Трудности цитологической диагностики ВЭР и инвазивного рака связаны с тем, что цитолог не видя базальной мембраны, ставит диагноз лишь на основании морфологических изменений эпителиальных клеток [63,66]. Недостатком цитологического метода является невозможность установления признаков инфильтративного роста в связи с отсутствием в цитологическом материале тканевого субстрата [53,33]. В подобных случаях необходима биопсия опухоли с последующим гистологическим исследованием [63,66].
Однако, ряд исследователей пытаются установить цитологические критерии дифференциальной диагностики ВЭР и инвазивного рака. В.Н. Прилепская и соавторы подчеркивают, что при преинвазивной карциноме в мазках типичных клеток рака меньше, чем при инвазивном раке: преобладают клетки, изменения которых характерны для дисплазии, нет распадающихся клеток, клеточного детрита с обилием лейкоцитов, эритроцитов. Наличие в мазке значительного количества клеток парабазального и базального слоев многослойного плоского эпителия с резко выраженными признаками дискариоза и единичных небольших скоплений клеток с признаками атипии позволит цитологу заподозрить наличие преинвазивной формы рака [33,53].
Таким образом, можно считать, что критерии цитологической диагностики всех этапов канцерогенеза в шейке матки: различные степени интраэпителиальной неоплазии, внутриэпителиальный рак и инвазивный рак носят несколько суъективный характер и требуют уточнения. На основе полученных данных требуется разработка классификационной системы, позволяющей осуществлять наиболее точную диагностику стадий канцерогенеза в шейке матки, ввиду отсутствия единой цитологической классификации плоскоклеточных новообразований шейки матки.
Представляют интерес различия в содержании гликогена, нейтральных и кислых мукополисахаридов, нуклеиновых кислот и некоторых ферментов при дисплазиях, карциноме in situ и инвазивных раках ШМ.
Согласно исследованиям И.А.Яковлевой и А.П. Черного [69] при пренеопластических и при неопластических процессах трофика и соответственно метаболизм эпителия существенно изменяются.
При дисплазиях снижается количество гликогена вплоть до полного его исчезновения. Отмечается нарастание активности кислой фосфатазы, сукцинат - и лактатдегидрогеназы, в то же время содержание щелочной фосфатазы резко падает.
Как указывают Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г., Хмельницкий O.K., [60,61,67,69] при дисплазиях гликоген обнаруживается в большом количестве в цитоплазме клеток функционального и особенно промежуточного слоя, в то время как нейтральные мукополисахариды преобладают в поверхностном функциональном слое. Гиперплазированные же клетки базального слоя гликогена, нейтральных и кислых мукополисахаридов не содержат. Содержание же нуклеиновых кислот (ДНК- дезоксирибонуклеиновой кислоты и РНК- рибонуклеиновой кислоты), также активность кислой фосфатазы и сукцинатдегидрогеназы при Д находятся в прямой связи со степенью выраженности базально-клеточной активности и клеточной атипии.
Возможности уточнения морфологического диагноза
В настоящее время активно изучаются количественные гистопатологические маркеры, пролиферативные и регуляторные маркеры, основные маркеры стабильности генома и др. [139].
Особое место среди них принадлежит белку р53. Исследованием его структуры занимаются ведущие биологи мира, считая, что он является узловой точкой генома, изменения в котором запускают развитие опухоли [93,101,124,147]. В 1990 г. были определены функции р53 в нормальных клетках как гена-супрессора опухолевого роста [88], особенностью которого является одновременное функционирование обоих аллелей в нормальных клетках. Нарушение функции р53 может происходить в результате потери одного аллеля и/или мутации в другом. Итогом является повышенная сверхэкспрессия гена и, как следствие, появление в клетке мутантной формы белка р53, утрата его сдерживающего влияния на пролиферацию клеток, что может приводить к их неконтролируемому делению [88]. На тканевом уровне нарушения в геноме проявляются в неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. [41]
Прогностическое значение иммунореактивности, связанной с р53, у больных с цервикальными карциномами широко обсуждается. Некоторые иностранные литературные источники не находят связи между гиперэкспрессией р53 (или существованием мутации белка р53) и её клиническим значением [126]. Другие делают выводы, что экспрессия р53 определяет развитие опухоли с плохим прогнозом [143].
К этой же группе маркеров относится клеточный онкоген с-тус, являющийся ядерным фактором транскрипции, с-тус кодирует клеточные регуляторные белки, индуцирующие пролиферацию и подавляющие дифференцировку клеток [56]. Aoyama С. и соавт., Delias А. и соавт. [72,94] отмечают увеличение содержания с-тус в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивных раках ШМ. Высказываются предположения, что с-тус играет важную роль на ранних этапах канцерогенеза в ШМ.
Частые случаи наличия еще одного онкогена зафиксированы в цервикальных карциномах. с-егЬВ2 - онкоген, который кодирует синтез онкобелков, выполняющих функции, аналогичные рецепторам к эпидермоидному фактору роста (EGFR) и обладающих тирозинкиназной активностью [137]. Иммуногистохимическое обнаружение с-егЬВ2 у пациентов связывают с плохой выживаемостью, и рассматривают его как маркер заболевания высокого риска [119].
В последнее время внимание морфологов привлек как возможный маркер неоплазий в шейке матки белок Р16 ink4a, представляющий собой ингибитор циклинзависимых киназ Cdk 4,6 [20,27,143]. Данный белок, являющийся негативным регулятором пролиферации клеток, участвует в сигнальном пути Cdk-Rb-E2F, контролирующем переход клетки из фазы G1 в S-фазу клеточного цикла. Как и многие другие супрессоры опухолевого роста, ген, кодирующий Р16 ink4a, в опухолях самых разных локализаций нередко инактивируется в результате точковых мутаций, делеций или метилирования. Выбор именно Р16 ink4a как потенциально перспективного маркера рака шейки матки обусловлен следующими обстоятельствами. Прежде всего соответствующий ген вовлечен в тот же самый сигнальный путь, что и ген предрасположенности к ретинобластоме Rb, белковый продукт которого в свою очередь избирательно инактивируется продуктом онкогена Е7 вируса папилломы человека. Продемонстрирована обратная корреляция между состоянием Р16 ink4a и pRb как в культивируемых in vitro, в том числе в цервикальных клетках человека, так и в клетках первичных опухолей разных локализаций. Известна также способность pRb осуществлять негативную регуляцию синтеза Р16 ink4a.
Таким образом, кажущаяся на первый взгляд парадоксальной для опухолевых клеток гиперэкспрессия белка Р16 ink4a, ингибирующего переход клетки в S-фазу, в случае карцином ШМ, где этиологическим агентом является вирус папилломы человека, и где, как следствие, под действием Е7 инактивирован pRb, в действительности может служить индикатором злокачественного превращения клеток эпителия ШМ [27,143].
Все выше изложенное, а также результаты изучения данного маркера позволяют считать, что иммуногистохимическое окрашивание на белок Р16 ink4a является одним из перспективных методов в ранней диагностике злокачественных клеток, ведущих происхождение из эпителия ШМ. Особое значение этот маркер может иметь для оценки разной степени диспластических нарушений, что требует дальнейших исследований [27]. Ряд иностранных авторов также считают Р16 ink4a многообещающим маркером ЦИН [109].
Морфологические особенности эпителия ШМ в процессе малигнизации связаны с изменением в наборе маркеров дифференцировки (прежде всего цитокератинового фенотипа эпителиального пласта), экспрессии РЭА (раково-эмбрионального антигена), а также маркеров пролиферации Ki-67 и др. СВ. Петров и соавторы [55,56] отмечают, что экспрессия кератина №17, маркирующего в норме базальные слои сложных эпителиев, в группе тяжелых дисплазий является неодинаковой. Те наблюдения тяжелой дисплазии, где реакция на цитокератин (ЦКР) №17 определяется во всех слоях эпителия и сходна с экспрессией этого кератина в раке in situ, относятся к группе дисплазий с тенденцией к прогрессированию во внутриэпителиальный рак. Другие случаи тяжелой дисплазии, где ЦКР №17 не выявляется, относятся к группе дисплазий с тенденцией к регрессу [55,56]. Во всех клетках тяжелой дисплазии и во всех слоях эпителиального пласта при раке in situ определяется антиген Ki-67.
Ввиду того, что в инвазивных плоскоклеточных карциномах выявляются серотипы HPV высокого риска - №16, 18, 33, обнаружение этих вариантов в дисплазиях ШМ позволяет квалифицировать такие процессы как Д с высоким риском развития рака. Это касается прежде всего легких и умеренных Д, планирование лечения которых должно проводиться с учетом результатов анализа на папилломавирусную инфекцию. Если же в диспластическом эителии выявляются серотипы вируса папилломы человека №6, 11, то такие случаи не связаны с прогрессией в рак in situ и далее в инвазивную опухоль. Эти больные относятся к группе низкого риска развития РШМ.
Определенную помощь могут оказать антитела к маркеру пролифереции Кі-67, который выявляется в клеточных ядрах в случаях быстрого продвижения инфицированной HPV клетки от базального к поверхностным слоям. Известно, что протеины Е6 и Е7 вируса папилломы человека обладают выраженным митогенным эффектом, что проявляется равномерным окрашиванием ядер пролиферирующих клеток. В участках плоскоклеточной метаплазии, атрофии, в плоскоклеточных папилломах интенсивность мечения антителами Кі-67 низкая. Отмечено, что чем ниже уровень плоскоклеточной дифференцировки эпителия эктоцервикса, тем ниже пролиферативная активность [56].
Результаты цитологической и плоидометрической диагностики предраковых процессов и рака шейки матки
По мере озлокачествления эпителиальной ткани шейки матки, от нормы к инвазивному раку, по результатам нашего исследования, нарастало количество генетического материала: при плоскоклеточном ороговевающем раке оно превысило исходные показатели в 2,3 раза, а при неороговевающем раке - в 2,5 раза. Гистограммы инвазивных плоскоклеточных раков были представлены преимущественно тетраплоидными ядрами со значительным количеством анеуплоидных и полиплоидных ядер (рис. П.7.1., П.8.1). Показатели средней плоидности ядер при инвазивных плоскоклеточных раках шейки матки были свыше 4,5 с и составили 5,4 - при плоскоклеточных ороговевающих раках и 5,8 с - при неороговевающих раках (табл. 2), что свидетельствует о более высокой дифференцировке ороговевающих раков.
Следовательно, согласно результатам проведенного нами плоидометрического исследования гистологических срезов, по мере развития стадий канцерогенеза в шейке матки отмечается последовательное нарастание среднего содержания ДНК в ядрах клеток плоского эпителия.
Кроме прямых признаков малигнизации, проявляющейся в увеличении средних показателей плоидности ядер опухолевых клеток, нами также были изучены косвенные диагностические морфометрические признаки опухолевой прогрессии (табл. 2), в числе которых: - «индекс накопления ДНК - ИНДНК» - средний взвешенный показатель плоидности - Мв (с) получаемый по среднему взвешенному показателю измеряемых ядер; - «площадь оптического сечения ядер» - характеризует площадь ядер клеток; - «показатель полиморфизма ядер-ППЯ »- отношение между средними взвешенными и средними показателями площадей оптического сечения ядер клеток; - «коэффициент анеуплоидии- КА» - отношение числа анеуплоидных (и полиплоидных) ядер, с содержанием в ядрах ДНК выше 4 с, к суммарному количеству парадиплоидных, паратриплоидных и паратетраплоидных ядер; - «пролиферативная активность - ПА», отражающая синтетические процессы в ядрах клеток и интенсивность роста опухоли - превышение показателя средней арифметической плоидности ядер клеток опухоли диплоидного уровня (М-2с); - «клеточная плотность» - число ядер клеток в стандартном объеме ткани. ИНДНК - индекс накопления ДНК, т.е. средний взвешенный показатель плоидности, достаточно хорошо, по мнению ряда авторов [5,73,75,76] характеризующий изменения содержания ДНК в ядрах клонов клеток в процессе опухолевой трансформации, также последовательно нарастал в каждой из выделенных групп и увеличился в 1,9 раза при тяжелой дисплазии и карциноме in situ (в группе НИН III) по сравнению с физиологической нормой, что подтверждает общую закономерность экспоненциального накопления генетического материала в ядрах клеток ростковой популяции при дисплазиях и злокачественном росте тканей человека, установленную Г.Г. Автандиловым и соавторами [35] и для эпителия шейки матки. Одновременно с нарастанием плоидности ядер клеток интраэпителиальных неоплазий и инвазивных раков, в нашем исследовании, увеличивалась площадь оптического сечения ядер (и соответственно их объем) в 2,1-2,2 раза при инвазивном раке по сравнению с нормой, коррелирующие, по данным литературы [10], с содержанием в ядрах ДНК (табл. 2). Одновременно с площадью нарастал и «показатель полиморфизма ядер-ППЯ» - отношение между средними взвешенными и средними показателями площадей оптического сечения ядер клеток, по нашим данным он увеличился (табл. 2), в 1,2 раза при инвазивных раках по сравнению с нормой, что также свидетельствует об укрупнении ядер и нарастании ядерного полиморфизма по мере развития неоплазий в шейке матки, отмечаемого морфологами в литературных описаниях дисплазии различной степени тяжести и инвазивных раков [65,66,67]. Также важным показателем озлокачествления эпителия шейки матки явилась анеуплоидия ядер клеток, которая, по результатам нашего исследования, нарастала по мере развития неоплазии. Она стала заметной только при умеренной дисплазии - коэффициент анеуплоидии - 0,22 (табл. 2), при тяжелой дисплазии произошло его удвоение, и далее на стадии карцином произошло второе удвоение этого коэффициента. Согласно данным Автандилова Г.Г., Гундоровой Л.В., Mellin W., Steinbeck R.G., выраженная анеуплоидия (и полиплоидия) клеток свойственна инвазивным ракам различных локализаций [10,31,32,117,141]. В нашем исследовании были получены также объективные свидетельства темпа роста опухоли - нарастающий показатель пролиферации (табл. 2): с 0,3 в норме до 3,4 - при ороговевающем раке и 3,8 при неороговевающем раке. Иными словами, при карциномах темп размножения клеток возрастал в 11-12 раз по сравнению с неизмененной тканью, что объясняет агрессивный рост инвазивных плоскоклеточных раков [50]. По мере развития каждой из стадий канцерогенеза в шейке матки, согласно нашим данным, заметно увеличилась и «клеточная плотность» (относительная доля ядер в срезе, % - табл. 2) - число клеток в стандартном объеме ткани с 4,72% в норме до - 11,5% при ороговевающем раке и 10,5%) при неороговевающем раке, что связано с увеличением пролиферативной активности клеток.
Результаты проведенной нами плоидометрии гистологических срезов шейки матки свидетельствуют о том, что по мере развития ЦИН различной степени тяжести и инвазивного плоскоклеточного рака разной степени дифференцировки последовательно нарастают плоидность и площадь оптического сечения ядер плоских эпителиоцитов шейки матки, нарастает ядерный полиморфизм, увеличивается число анеуплоидных (и полиплоидных) клеток в ростковой зоне неоплазии, пролиферативная активность клеток неоплазии и их количество в стандартном объеме неопластической ткани. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследований разных авторов, проводимых на других эпителиальных тканях [18,31,34].
