Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной аналитической практике разработан ряд методов иммуноанализа, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее регистрация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ [Yallow, Berson, 1959], иммуноферментный анализ [Engvall, Perlmann, 1971, 1972, Weemen, Schuurs, 1971, Rubinstein et al., 1972], био- и хемилюминесцентные иммуноанализы [Woodhead, Weeks, 1985, Ullman et al., 1996], флюориметрический анализ [Frank, 1978, Frengen et al., 1993] и его микрообъемные модификации [Swartzmann et al., 1999, Zuck et al., 1999, Martens et al., 1999], анализ проточной цитометрией [Fulwyler, 1976, Cook, Irving, 1989, Frengen et al., 1993, McHugh, 1994]. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого возможно получить специфические антитела, избирательностью и специфичностью, высокой чувствительностью. Однако наряду с достоинствами, у них есть некоторые недостатки. В частности, опасность для здоровья, связанная с использованием изотопных меток в радиоиммунологических исследованиях (РИА), токсичные и канцерогенные свойства хромогенных субстратов, применяемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Кроме того, ряд методов зависит от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры, обладает трудоемкостью и относительной длительностью исполнения (РИА, хемилюминесцентный и флуоресцентный, анализы, проточная цитометрия).
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных по отношению к определяемому веществу (лиганду) аффинных соединений (анти-лигандов) оптически плотными частицами или цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток следует отметить латексы, в том числе цветные [Remington et al., 1983, Bangs, 1987, 1996, Lin You-chu et al., 1989, Gerber et al., 1990, Tarcha et al., 1990], эритроциты [Guesdon, Avrameas, 1980, Плаксин, 1986], неметаллические коллоиды серы, селена, теллура [Spallholz, 1982, Yost et al, 1989, Russel et al, 1989], оксиды металлов [Akzo, 1980, Zelikman, Hjerten, 1988], полимеризованные коллоидные красители, [Snowden, Hommel, 1991], гидрофобные красители [Gribnau et al., 1985, Anderson, 1988, Rounds, 1988], коллоидное золото [Moeremans et al., 1984, Egger, Bienz, 1987., Roth, Heitz, 1989, Chakraborty at al., 1990, Martin et al., 1990]. Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие лиганда как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов), так и в многочисленных гетерогенных системах. К первой группе можно отнести агглютинацию довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменение спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов. Ко второй – системы, основанные на эритроиммуноадсорбции и, более широко, на седиментационно-адсорбционном (иммуно)анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блоттинге; иммуно- и гибридофильтрации (flow-through анализах), иммунохроматографии (иммуномиграции) и ряде других процедурных аранжировках, результат которых оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания лиганда на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение лиганда, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.
Основными недостатками отмеченных методов являются неудовлетворительная надежность систем анализа и плохая воспроизводимость результатов, обусловленные слабой стабильностью диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью используемых в качестве меток частиц.
Решение перечисленных проблем получило свою реализацию в работах, в которых в качестве меток детектирующих реагентов применили частицы коллоидного углерода [Плаксин и др., 1991, 1994, 1997]. Основным моментом этих разработок стала двухэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, предусматривающая ковалентное связывание аффинных соединений с частицами углерода. Решение коснулось сразу двух аспектов проблемы. Черный цвет углеродных частиц обеспечил максимальную из существующих в природе хромофорность меток, а ковалентный характер связи аффинных соединений с ними – максимальную прочность структуры диагностикума.
Важным результатом разработанной технологии явилось получение устойчивой гетерогенной системы, обладающей одновременно свойствами истинного раствора и суспензии, названной авторами «суспензоидом». Частицы углерода размерами 162 нм, обладающие реальной поверхностью и находящиеся в водной фазе, не оседали и не всплывали под действием обычной гравитации.
Однако двухэтапный метод конъюгирования отягощен рядом технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения двух хроматографических процедур: освобождение от избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования, за которым вновь следует процедура хроматографического удаления несвязавшихся молекул анти-лиганда. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого с целью пептизации поверхности углеродных частиц инертного белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА) ограничивает количество связываемого аффинного соединения, что, в конечном итоге, накладывает ограничения на уровень чувствительности стереоспецифического анализа, проводимого с использованием таких конъюгатов.
Вместе с тем, сконструированные модели тест-систем на основе полученных реагентов в полной мере продемонстрировали перспективные возможности применения углеродных конъюгатов для создания аналитических систем, пригодных для диагностического тестирования.
Цель настоящей работы - разработка универсальной технологии одноэтапного синтеза диагностических реагентов с использованием углеродных наночастиц и конструирование на ее основе систем безинструментального иммуноанализа.
Основные задачи исследования:
1. Разработать технологию синтеза углеродных диагностикумов, предусматривающую одноэтапное конъюгирование аффинных соединений с наночастицами коллоидного углерода. Изучить стабильность полученных конъюгатов.
2. Обосновать универсальную систему диагностического тестирования, основанную на определении иммуноглобулинов класса G с использованием в качестве аффинного соединения белка G стрептококка и оценить ее основные аналитические параметры.
3. Обосновать системы иммуноаналитического определения различных лигандов в различных процедурных аранжировках.
4. Разработать методы аналитического тестирования на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые разработана одноэтапная технологическая схема ковалентного конъюгирования аффинных соединений с гидрофобными наночастицами коллоидного углерода, пригодная для промышленного внедрения, позволившая химически инертному углероду стать прочно связанным с биологическими макромолекулами. Компактность и универсальность разработанной технологии, подбор оптимальных параметров синтеза и технологических приемов позволили в условиях использования лабораторной модели технологической установки получить объем диагностических реагентов, обеспечивающий проведение до 300000 определений в год. Технологический процесс можно легко масштабировать, не опасаясь негативных последствий, которыми, как правило, сопровождаются любые действия, связанные с переносом лабораторной схемы в условия реального производства.
Впервые предложен и апробирован оригинальный и эффективный способ получения углеродных частиц с высокой степенью стандартизации по размерам.
Полученные данные дополняют современный биотехнологический арсенал методов принципиально новой технологией, позволяющей получать устойчивые водные суспензии гидрофобных наночастиц, поверхность которых может быть надежно модифицирована практически любыми соединениями, имеющими в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Технология синтеза диагностикума и способы анализа с использованием синтезируемых углеродных реагентов защищена патентами РФ № 2089212 от 10.09.1997, № 2268471 от 20.01.2006, № 2283131 от 10.10.2006, № 2302424 от 10.07.2007. Кроме того, получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 20051128104/15(031560) от 05.02.2007, № 2007103808/15(004097) от 30.10.2007 и № 2007100406/15(000429) от 09.10.2007.
Использование разработанной технологии позволило получить устойчивые диагностические реагенты, которые характеризуются стабильностью в течение длительного времени, даже в условиях значительного отклонения от оптимальных параметров хранения. Это составило основу надежности тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов.
Привлекательные с позиций надежности и стабильности характеристики полученных реагентов позволили существенно упростить процедурное оформление анализов без ущерба для аналитических параметров готовых тест-систем.
Разработка технологии одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов позволила повысить чувствительность определения различных лигандов в разных форматных аранжировках анализа.
Впервые на углеродных конъюгатах продемонстрированы преимущества систем анализа, эксплуатирующих уникальные свойства биотин-стрептавидинового взаимодействия, как в аспекте универсальности детекции, так и в возможности амплифицированного усиления результата аналитического исследования, повышающего чувствительность определения.
Практическая значимость исследования.
Разработанные методические подходы в сфере конструирования неинструментальных аналитических систем могут служить основой для создания широкого спектра разнообразных наборов, пригодных для диагностического тестирования. Это могут быть системы анализа для клинико-лабораторных исследований, для экспресс диагностики в кабинете врача по принципу «один пациент - один тест», для скрининговых исследований в чрезвычайных ситуациях, для работы бригад скорой помощи, домашние тесты, полевые – в условиях экспедиционных отрядов и армейских подразделений. Быстрые и надежные, а вместе с тем, чрезвычайно простые в использовании, тесты могут найти свое применение в пищевой промышленности, в криминалистике, в ветеринарии и растениеводстве для оснащения не только контрольных лабораторий, но и фермерских хозяйств и т.д. В условиях исследовательских лабораторий наличие подобных диагностических инструментов может обеспечить возможность самостоятельного конструирования актуальных тест-систем. Например, достаточно иметь конъюгат белка G с углеродом, чтобы при необходимости сконструировать систему обнаружения и идентификации любых иммуноглобулинов. Это бывает весьма актуально там, где проводятся работы, связанные с выделением и очисткой белковых соединений из различных биологических материалов. То же касается и стрептавидинового конъюгата, как универсального детектирующего реагента, способного обнаружить любой лиганд при одном лишь условии – наличии соответствующего биотинилированного анти-лиганда.
Внедрение в практику. Результаты работы используются в практической деятельности лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при оценке иммуноглобулиновой контаминации препаратов выделяемых белков фетоплацентарного комплекса, при оценке уровня сероконверсии в период иммунизации экспериментальных животных, в экспериментально-производственной работе филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермский НПО «БИОМЕД», в работе Института новых медицинских технологий (г.Краснокамск), в учебном процессе на биологическом факультете Пермского госуниверситета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанная технология одноэтапного конъюгирования различных аффинных соединений с частицами коллоидного углерода позволяет получать детектирующие реагенты прочной ковалентной структуры за счет единовременного процесса пептизации, активации и связывания всех компонентов диагностикума. Получаемые конъюгаты устойчивы при хранении в течение длительного времени даже в условиях отклонения температуры окружающей среды от оптимальной.
2. Получение стабильных конъюгатов на основе углеродных наночастиц дает возможность конструировать широкий спектр систем анализа, как с высокой степенью универсальности, так и с узко направленными задачами определения конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям, предъявляемым к диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность, воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.
3. Использование в конструкции аналитических систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового взаимодействия приводит к существенному усилению чувствительности определения при создании широкого спектра диагностических тест-систем на основе наночастиц углерода.
Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE’95), Санкт-Петербург, 1995, на XIII-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (ICEP’98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006, на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, включая 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.
